Xenograft hudmodell for å manipulere menneskelige immunresponser in vivo
Summary
Den nåværende protokollen beskriver hvordan man poder menneskelig hud på ikke-overvektige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gammakjedereseptor (NSG) mus. En detaljert beskrivelse av preparatet av menneskelig hud for transplantasjon, forberedelse av mus for transplantasjon, transplantasjon av menneskelig hud med delt tykkelse og gjenopprettingsprosedyre etter transplantasjon er inkludert i rapporten.
Abstract
Den humane hud xenograftmodellen, der human donorhud transplanteres på en immundefekt musevert, er et viktig alternativ for translasjonsforskning innen hudimmunologi. Murine og menneskelig hud varierer vesentlig i anatomi og immuncellesammensetning. Derfor har tradisjonelle musemodeller begrensninger for dermatologisk forskning og narkotikaforskning. Imidlertid er vellykkede xenotransplantasjoner teknisk utfordrende og krever optimal prøve- og musetransplantasjonsstedforberedelse for transplantat- og vertsoverlevelse. Den nåværende protokollen gir en optimalisert teknikk for å transplantere menneskelig hud på mus og diskuterer nødvendige hensyn for nedstrøms eksperimentelle mål. Denne rapporten beskriver riktig forberedelse av en hudprøve fra en menneskelig donor, montering av et kirurgisk oppsett, forberedelse av mus og operasjonssted, hudtransplantasjon og overvåking etter kirurgi. Overholdelse av disse metodene muliggjør vedlikehold av xenotransplantater i over 6 uker etter operasjonen. Teknikkene som er skissert nedenfor tillater maksimal podeeffektivitet på grunn av utvikling av tekniske kontroller, steril teknikk og pre- og postkirurgisk kondisjonering. Passende utførelse av xenograftmodellen resulterer i langlivede humane hudtransplantatprøver for eksperimentell karakterisering av human hud og preklinisk testing av forbindelser in vivo.
Introduction
Musemodeller brukes ofte til å gjøre slutninger om menneskelig biologi og sykdom, delvis på grunn av deres eksperimentelle reproduserbarhet og kapasitet for genetisk manipulasjon. Musefysiologi rekapitulerer imidlertid ikke humane organsystemer fullstendig, spesielt hud, og har derfor begrensninger for bruk som preklinisk modell i legemiddelutvikling1. Anatomiske forskjeller mellom mus og menneskelig hud inkluderer forskjeller i epiteltykkelser og arkitektur, mangel på murine ekkrine svettekjertler og variasjoner i hårsykling2. Videre er både immunsystemets medfødte og adaptive armer divergerende mellom de to artene3. Mushud inneholder en unik immunpopulasjon av dendritiske epidermale T-celler (DETCs), har en høyere overflod av dermale γδ T-celler, og varierer i immuncelleundergruppelokalisering sammenlignet med humant vev4. Derfor har eksperimentelle funn angående menneskelig hudbiologi og betennelse nytte av validering med menneskelig vev. Mens in vitro og organoide kultursystemer er mye brukt verktøy for å studere menneskelig vev, er disse systemene begrenset av fraværende eller ufullstendig immunrekonstituering og mangel på forbindelse til perifer vaskulatur5. Den humaniserte xenograft hudtransplantasjonsmodellen tar sikte på å tillate terapeutisk eller biologisk manipulering av immun- og ikke-immunveier i humant vev in vivo.
Den menneskelige hud xenograft-modellen har blitt brukt til å studere hudfysiologi og farmakologi, analysere immunavvisning og responser, dissekere menneskelige hudkreftmekanismer og forstå hudsykdommer og sårheling6. Selv om den gjelder for flere felt av hudforskning, har xenograft-modellen lavere gjennomstrømning enn in vitro-studier og mangler den enkle genetiske manipulasjonen som brukes i musemodeller. Tidspunkter innenfor denne modellen kan variere fra uker til måneder, og vellykket poding krever passende fasiliteter og utstyr for å utføre disse operasjonene. Xenograft-modellen leverer imidlertid biologisk og fysiologisk kontekst til eksperimenter, mens organoide kultursystemer, som vevseksplanter, ofte krever replikering av et mylder av bevegelige deler, for eksempel eksogene signaler, med bestemte tidsintervaller7. Derfor er denne modellen best utnyttet for ytterligere å validere funn observert in vitro og i musemodeller, eller for arbeid som ellers ikke er biologisk mulig. Hensiktsmessig bruk av xenograftmodellen gir en unik mulighet til å studere og manipulere intakt humant vev in vivo.
Optimalisering av xenograft hudtransplantasjonsmodellen har stolt på flere tiår med forskning for å bevare transplantatintegritet over tid. Kritisk for denne prosessen er å bruke ikke-overvektige diabetiker (NOD) -scid interleukin-2 gammakjedereseptor (NSG) mus, som mangler B- og T-adaptive immunceller, funksjonelle NK-celler, og har mangler i makrofag og dendrittiske celler8. Den immunsviktende naturen til disse NSG-vertene tillater transplantasjon av humane hematopoietiske celler, pasientavledede kreftformer og hud 8,9,10. Til tross for dette immunsuppressive vertsmiljøet er ytterligere undertrykkelse av muse-nøytrofile immunresponser ved anti-GR1-administrering nødvendig for transplantatsuksess10. De viktigste hindringene i transplantasjon av intakt vev er infeksjon, avvisning og vanskeligheter med å gjenopprette blodstrømmen til transplantatet, noe som noen ganger fører til tap av dermal og epidermal integritet11. Teknikker inkludert administrering av anti-FR1 og bruk av passende transplantatdybde forbedrer transplantatoverlevelse10. Grundig optimalisering gjør det mulig å utføre humane xenograft hudtransplantasjoner på NSG-mus med høy effektivitet og overlevelse, fra 90% -100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mus xenograft hudtransplantasjonsmodell er en nøkkelteknikk for mekanistisk dissekering av menneskelige hudimmunresponser i en in vivo-innstilling 14. Vellykkede hud xenograft transplantasjoner stole på riktig forberedelse av mus og hudprøver og mus og overholdelse av aseptiske gnagere kirurgi metoder15. Rask nedkjøling og riktig lagring av hudprøver ved kalde temperaturer i medier (for eksempel steril saltvann) er viktig for å sikre fortsatt vevshelse før t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis finansiert av sponsede forskningsavtaler fra TRex Bio og tilskudd fra NIH (1R01AR075864-01A1). JMM er støttet av Kreftforskningsforeningen (bevilgning 26005). Vi anerkjenner Parnassus Flow Cytometry Core støttet delvis av tilskuddene NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 og S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
