Islah ve sütten kesmenin temelleri

1. Hayvanları eşleştirirken ihtiyaç duyulan bilgiler, uygun isimlendirme kullanan hayvanın suşunu/stoğunu, damızlık erkek ve dişi için doğum tarihlerini ve kurulum tarihini içerir. Üreme kolonileri için doğru kayıt tutma zorunludur.

2. Farelerin ve sıçanların cinsiyet tayini, anogenital mesafeler karşılaştırılarak yapılır. Kadınlarda, anüs ile dış genital organlar arasındaki mesafe erkeklere göre daha kısadır. Erkek hayvanlarda skrotal kese varlığı başka bir cinsiyet göstergesidir.

3. Eşleşme şemasının seçilmesi ve ayarlanması

NOT: Kullanılabilecek iki çiftleşme şeması vardır.

1. Proöstrus/kızgınlık zamanlı çiftleşme: Bu yöntem, dişilerin erkeklerle maksimum alıcılık ve doğurganlık noktasında soyulmasına dayanır.
   1. Kızgınlık döngüsü kadınlarda ya proöstrus ve östrus göstergesi olan değişiklikler için dış genital organların görsel muayenesi ile ya da vajinal sekresyonların sitolojisi ile izlenmelidir (aşağıya bakınız).
   2. Bir dişinin proöstrus veya kızgınlık döneminde olduğu belirlendiğinde, hayvanlar genellikle geceleri çiftleştiği için günün sonunda bir erkekle eşleştirilir.
   3. Ertesi sabah, dişi bir çiftleşme tıkaç için muayene edilir (aşağıya bakınız). Tıkaç yoksa, dişi gün boyunca erkekle kalabilir ve günün sonunda çiftleşme tıkaç olup olmadığını kontrol edebilir. Alternatif olarak, artık proöstrus veya kızgınlık geçirmediği belirlenirse, üreme kafesinden çıkarılır.
2. Rastgele zamanlanmış çiftleşme: Bu yöntem, kemirgenlerin kızgınlık döngüsünün çok kısa, 4-5 gün uzunluğunda olmasına dayanmaktadır.
   1. Bu yöntem için, çiftleşmeler herhangi bir zamanda kurulabilir ve dişiler daha sonra bir tıkaç görülene kadar her sabah ve akşam çiftleşme tıkaçları için kontrol edilir.
   2. Akşamları bir dişi bir erkekle eşleştirilir.
   3. Bir tıkaç görülene kadar her günün başında ve sonunda bir çiftleşme tıkaç olup olmadığı kontrol edilir. Bu yöntemi kullanırken bir fişin görülmesi genellikle 3 veya daha fazla gün sürer.

4. Hamileliği tahmin etmek

Yavruların palpasyonu hamilelik sırasında daha sonra, 10-12. gün civarına kadar zor olduğundan, kemirgenler için ticari ultrason sistemleri geliştirilmiştir; Bununla birlikte, az sayıda hayvan araştırma tesisi bu teknolojiye sahiptir. Bu nedenle, çiftleşme tıkaçlarının görselleştirilmesi, vajinal değişikliklerin gözlemlenmesi veya vajinal sitoloji, bir dişinin ne zaman bir yavruya gebe kaldığının tahmin edilmesine yardımcı olmak için yaygın olarak kullanılır (aşağıya bakınız). Bununla birlikte, bu yöntemlerin hiçbiri hamileliği doğrulayamaz. Çiftleşme tıkaç görüldüğünde, dişi kilo alımı gibi hamilelik belirtileri açısından izlenmelidir.

5. Kızgınlık döngüsü aşamasının belirlenmesi

1. Görsel İnceleme
   NOT: Farelerin ve sıçanların zamanlanmış çiftleşmesi için, proöstrus ve östrusun göstergesi olan değişiklikler için vajinanın görsel olarak gözlemlenmesi, kızgınlık döngüsü aşamasını belirlemenin en hızlı yöntemidir ve özel ekipman gerektirmez.
   1. Görsel yöntemi kullanarak kızgınlık döngüsünü değerlendirirken, ışık kaynağı vajinal dokuların algılanan rengini değiştirebileceğinden ve değerlendirmeyi zorlaştırabileceğinden, oda aydınlatmasına göre aynı alanda görsel incelemenin yapılması önemlidir. Örneğin, LED ışıkların oluşturduğu mor ton, görsel algılamayı daha zor hale getirir.
   2. Kızgınlık döngüsünün aşamasını görsel gözlemle değerlendirmek için, her farenin ön ayakları bir kafes kapağına dayanacak şekilde kuyruk tarafından manuel olarak tutulması gerekir.
   3. Her kadının vajinal açıklığı, vajinal alanı çevreleyen dokunun durumuna ve vajinal açıklığın boyutuna göre değerlendirilir. ²
      1. Proöstrus sırasında vajinal açıklık geniştir ve çevre dokunun şişmesi ile karakterizedir. Doku pembe renkli ve çok nemlidir. Genellikle açıklığın dorsal ve ventral kenarları boyunca kırışıklıklar veya çizgiler vardır.
      2. Kızgınlık sırasında vajinal açıklığı çevreleyen dokuların şişliği azalır ve dokular eskisi kadar nemli ve pembe olmaz.
      3. Metestrus sırasında vajinal açıklık minimaldir ve ihmal edilebilir derecede şişlik vardır.
      4. Diestrus sırasında vajinal bölge çevresindeki dokularda şişlik olmaz ve vajinal açıklık küçük ve kapalıdır.
2. Vajinal sitoloji
   Hem fareler hem de sıçanlar poliöstrus olduğundan, kızgınlık döngüsü uzunluğu çok kısadır ve 4-5 gün arasında değişir. Bazen kızgınlığın dört aşamasını da tanımlamak gerekir: proöstrus, östrus, metessus ve diestrus. Vajinal sitoloji bu aşamaları belirlemek için oldukça doğru bir yöntemdir. Ayrıca iki numune toplama yöntemi vardır: noninvaziv vajinal lavaj yöntemi ve invaziv vajinal kanal temizleme yöntemi.
   1. Vajinal lavaj
      1. İhtiyaç duyulan malzemeler steril 200 μl pipet uçları, lateks ampuller, steril çift damıtılmış su (ddH₂0) ve temiz cam slaytlardır.
      2. Steril 200 μl'lik bir ucun ucuna bir lateks ampul yerleştirin. Pipete yaklaşık 100 μl steril ddH₂O çekin.
      3. Fareyi kafesten kaldırın ve kuyruğu size bakacak şekilde tel çubuk kafesin üstüne yerleştirin.
      4. Kuyruğu sıkıca kavrayın ve farenin arka kısmını kaldırın. Fare artık sadece kapağı kavrayan ön pençelere sahip olacak.
      5. Fare idrar yaparsa, idrara çıkma durana kadar bekleyin. Vajinal kanalın girişinde idrar kalırsa, açıklık küçük bir ddH₂O fışkırtması ile durulanabilir. Durulama için kullanılan ucu değiştirin.
      6. ddH₂O dolu ucun ucunu deliğe girmeden vajinal kanalın açıklığına yerleştirin.
      7. Vajinal kanalın açılışında su hacminin dörtte biri ila yarısını (~ 25-50 μl) dışarı atmak için ampulü hafifçe bastırın. Sıvı, uç yerleştirilmeden kanala kendiliğinden aspire edilecektir. Ampule uygulanan basıncı yavaşça boşaltın. Sıvı uca geri çekilecektir.
      8. Ampule sıvı aspirasyonunu önlemek için basıncı çok hızlı boşaltmaktan kaçının. Filtrelenmiş bir uç bu amaç için yararlı olabilir.
      9. Tek bir örnekte yeterli sayıda hücre elde etmek için aynı ucu, ampulü ve sıvıyı kullanarak önceki adımı 4-5 kez tekrarlayın.
      10. Sıvıyı cam slayt üzerine yerleştirin ve lekenin oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin.
      11. Her fare için yeni bir pipet kullanın.
      12. Kuruduktan sonra, bu kızgınlık lekeleri hemen lekelenebilir veya daha sonraki bir tarihte saklanabilir ve lekelenebilir. Wright-Giemsa boyama en yaygın olarak slaytları boyamak için kullanılır. Bu leke, boyama işlemi sırasında hücrelerin yıkanmasını önlemek için sürgünün sabitlenmesini gerektirmeyen tek adımlı bir leke olarak ticari olarak mevcuttur. Slayt, üreticinin talimatlarına göre 45-60 saniye boyunca lekeye yerleştirilir.
      13. Slaytlar daha sonra bir mikroskop altında incelenir ve görülen hücreler döngünün aşamasına karşılık gelir: 1) dişi proöstrus içindeyse, hücreler sitoplazmadan daha koyu lekelenen bir çekirdeğe sahip yuvarlak, iyi biçimlendirilmiş çekirdekli epitel hücrelerinin kümeleri olarak görülür; 2) dişi kızgınlık dönemindeyse, hücrelerin çoğu, çekirdeği olmayan, görünüşte köşeli olan ve yoğun paketlenmiş kümeler halinde ortaya çıkan kornifiye skuamöz epitel hücreleridir; 3) dişi metestrus içindeyse, hücreler tipik olarak beyaz kan hücreleridir (özellikle bazı kornifiye skuamöz epitel hücrelerinin bulunduğu nötrofiller) ve birbirine bağlı iki sosis şeklinde koyu lekeli çekirdeklerdir; 4) Diestrus sırasında, mevcut hücreler normalde birkaç çekirdekli epitel hücresinin ortaya çıkmasıyla beyaz kan hücreleridir.
   2. Vajinal sürüntü
      1. İhtiyaç duyulan malzemeler 2 mm çapında steril pamuk uçlu aplikatörler, temiz cam mikroskop lamları ve steril serum fizyolojiktir.
      2. Pamuk uçlu bir aplikatörü tuzlu su ile ıslatın.
      3. Aplikatörün ucunu kısıtlanmış farenin vajinasına yerleştirin.
      4. Ucu yavaşça çevirin ve vajinal duvara doğru yuvarlayın. Çubuğu dikkatlice çıkarın.
      5. Hücreler, swabın slayt boyunca yuvarlanmasıyla kuru bir cam slayta aktarılır.
      6. Slayt kuruduktan sonra Wright-Giemsa boyası ile lekelenebilir.
         Sürüntü almak stresli bir prosedür olarak kabul edilir ve stresli olduğunda fareler kızgınlık döngülerini bozabilir. Sürüntü almanın neden olduğu vajinal ve servikal stimülasyon yalancı gebeliğe neden olabilir. Vajinal mukozanın tekrarlanan sürüntüleri, nazikçe, uygun kısıtlama ile ve doğru boyutta pamuklu çubuklarla yapılmazsa hasara neden olabilir. ^3,4

Şekil 2. Vajinal sitoloji -- kemirgen kızgınlık döngüsünün farklı aşamaları

6. Çiftleşme fişini görselleştirme

Bu tıkaç vajinal sıvı ve meniden oluşur ve kopülasyon sonrası 12-24 saat vajinada kalır. Fişin varlığı çiftleşmeyi onaylar, ancak dişinin hamile olduğunu garanti etmez. Tıkalı kadın hamileyse, gebeliğin ilk günü tıkaç bulunduktan sonraki gün olarak kabul edilir.

1. Fareyi kafesten kaldırın ve kuyruğu size bakacak şekilde tel çubuk kafesin üstüne yerleştirin.
2. Vajinal açıklığın daha iyi sunulmasını sağlamak için sırtı kamburlaştırmak için kuyruğun hemen üzerine baskı uygulayarak fareyi konumlandırın.
3. Beyazımsı bir kitle için vajinal açıklığını gözlemleyin. Çiftleşme tıkaç görsel olarak açık olmayabilir, ancak künt bir prob kullanılarak doğrulanabilir.
4. Probun ucunu kullanarak nazikçe vajinal açıklığa yerleştirin. Bir çiftleşme tıpasının varlığı, probun vajinal açıklığın 0,5 cm yakınında ilerlemesini engelleyecektir.
5. Prob her kullanımdan önce alkol ile dezenfekte edilmeli ve tamamen kurutulmalıdır.

Dişinin yavruları olduğu için doğum tarihi, yavru büyüklüğü, doğum sayısı, sütten kesilme sayısı, erkek/dişi yavru oranı ve genotiplerin oranı kaydedilmelidir. Bir altlık içindeki genotipler ebeveynlerin genotiplerine uymuyorsa, gerçek genotipi doğrulamak için yeniden test yapılmalıdır.

7. Sütten kesme

Fareler ve sıçanlar için gebelik yaklaşık 21 gündür. Gençler 21-28 günlükken sütten kesilir. Hem fareler hem de sıçanlar 8 haftalıkken üreyebilir, bu nedenle yavruların erken yaşta cinsiyetlerine göre ayrılması zorunludur. Yoğun üreme, bir sonraki yavru doğduğunda yaşlı yavruların orada bulunmasını önlemek için her çöpün yavrularının 20. günde sütten kesilmesini gerektirir. Yoğun olmayan üreme için, yavrular 20 günlük yaştan sonra, genellikle 28 günlük olana kadar anne ile birlikte bırakılabilir. Bu, genetiği değiştirilmiş birçok suş için çok faydalı olabilir, çünkü yavrular mühendislik ürünü olmayan veya vahşi tip hayvanlar kadar güçlü olmayabilir.

Erkek ve dişi yavrular sütten kesimde ayrılır. Mümkün olduğunda, yeni sütten kesilmiş yavrular tek başına barındırılmamalıdır. Bir çöpte belirli bir cinsiyetten yalnızca bir yavru varsa, bu yavruyu aynı cinsiyetten diğer yavrularla birlikte barındırmak için girişimlerde bulunulmalıdır. Olası barınma seçenekleri şunlardır: 1) tek bir dişi yavru, yoğun bir üreme kafesinde değilse anne ile birlikte kalabilir; 2) tek bir dişi veya erkek yavru, aynı yaştaki farklı bir çöpten aynı cinsiyetteki diğer yavruların yanına yerleştirilebilir; 3) Ebeveynler tek eşli bir çift ise, tek bir erkek yavrunun babayla birlikte barındırılmasına izin vermek için dişi kafesten çıkarılabilir; ve 4) tek bir erkek yavru, 5 haftalık olana kadar kız kardeşleriyle birlikte barındırılabilir. İstenmeyen yavruların uygun olmayan şekilde ayrılmış yavrulardan kaynaklanmasını önlemek için yavruların cinsiyeti, sütten kesildikten bir hafta sonra doğrulanmalıdır.

Sütten kesilen fareler ve sıçanlar, geliştiklerinden emin olmak için günlük olarak kontrol edilmelidir. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals⁵, yiyeceklerin hayvanlara dışkı ve idrarla kirlenmesini önleyecek şekilde sunulması gerektiğini belirtse de, yeni sütten kesilmiş farelere kafes tabanındaki bir cam tabağa (petri kabı) yerleştirilmiş az miktarda yiyecek (fare başına bir pelet) sağlanmalıdır. Bu, hayvanları tek besin kaynağı olarak kemirgen yemeğine geçmeye teşvik edecektir. Otomatik bir sulama sistemi ile kafeslere su sağlayan raflarda barındırılan hayvanlar için bile, fareler susuz kalmış gibi görünüyorsa kafese bir su şişesi eklenebilir.

İsim	Koloni Türü	Açıklama
ICR	Soylu	Albino
İsviçre-Webster	Soylu	Albino
Balb/c	Akrabalı	Albino
FVB	Akrabalı	Albino
C57BL/6	Akrabalı	Siyah ceket rengi
C3H	Akrabalı	Kahverengi ceket rengi
DBA/2	Akrabalı	Kahverengi/gri ceket rengi
Atimik çıplaklar (nu/nu)	Akrabalı	Tüysüz
SCID	Akrabalı	Şiddetli kombine bağışıklık eksikliği olan fareler-çeşitli tüy renkleri

Tablo 1. Yaygın olarak kullanılan fare lekeleri ve stokları.

İsim	Koloni Türü	Açıklama
Sprague-Dawley	Soylu	Albino
Wistar	Soylu	Albino
Balıkçı 344	Akrabalı	Albino
Lewis	Akrabalı	Albino
Uzun Evans	Akrabalı	Kapüşonlu, siyah beyaz

Tablo 2. Yaygın olarak kullanılan sıçan suşları ve stokları.