Bu video, hücre kültürü için uygun, uyumlu, ekstrasellüler matriks (ECM) kaplanmamış maddeler imal etmek için kullanılan deneysel teknikler göstermek ve çekiş gücü mikroskopi için uygun ve hücre davranışı üzerindeki etkilerinin gözlenmesi ECM sertlik.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Ekstrasellüler matriks (ECM) hücresel adezyon düzenlenmesi, hücre göçü ve ECM yeniden şekillenme için esastır. Odak yapışıklıklar makromoleküler meclisleri olduğunu çift ECM kontraktil F-aktin hücre iskeletinin. Bu bağlantı, hücre zarından substrate altında yatan, hücre içi mekanik güçlerin iletim sağlar. Son çalışmalar, ECM mekanik özellikleri, fokal adezyon ve F-aktin morfolojisi yanı sıra, hücre farklılaşması, bölünmesi, çoğalması ve göçü de dahil olmak üzere çok sayıda fizyolojik süreçleri düzenleyen göstermiştir. Böylece, hücre kültürü yüzeylerin kullanımı tam olarak kontrol ve ECM mekanik özellikleri modüle giderek daha yaygın bir yöntem haline gelmiştir.
Yapışık bir hücrede fokal yapışıklıklar çekiş kuvvetleri ölçmek için bir yöntem olarak adlandırılan çekim gücü mikroskobu (TFM) yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve hesaplama teknikleri ile birlikte, uyumlu substratlar kullanılır. Bu teknik, hücresel daralma sonucu substrat deformasyonların yerel büyüklüğü ve yönü ölçümleri dayanmaktadır. Floresan etiketli proteinlerin yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile birlikte, sitoskeletal organizasyon ve yeniden yapılanma çekiş güçleri ile ilişkilendirilmesi mümkün.
Burada iki boyutlu hücresel daralma ölçmek için uygun bir iyi karakterize, ayarlanabilir mekanik sertlik, bir hücre kültürü substrat yaratma amaçlı, uyumlu matrislerin hazırlanması için ayrıntılı bir deney protokolünde mevcut. Bu protokoller poliakrilamid hidrojeller imalat, kaplama gibi jeller ECM proteinleri, jeller kaplama hücreleri, ve perfüzyon odasının kullanarak yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi içerir. Buna ek olarak, veri atıf TFM protokolleri kullanarak hücresel güçlerinin konumu ve büyüklüğü gösteren temsili bir örnek sağlar.
Protokol
1. Lamel yüzey etkinleştirilmesi
- Lamelleri (# 1.5, 22x40 mm), temiz ve toz kaldırmak için, daha önce açıklanan bir protokol (Waterman-Storer, 1998) ve etanol sabunla yıkar bir dizi kullanılarak temizlenebilir.
- Paslanmaz çelik tutucu raf yerleştirin lamelleri, öyle ki lamelleri arayla ve değmiyor.
- Kimyasal davlumbaz (nitril eldiven ve gözlük önerilir), kare bir cam tabak (~ 350ml hacmi) doldurmak için nihai bir konsantrasyon için% 2 (2ml silan / 100 ml izopropanol) 3-isopropanol aminopropyltrimethoxysilane tam güç sulandırmak. Plastik ile reaktivite nedeniyle, izopropanol 3-aminopropyltrimethoxysilane uygulamak için bir cam Pasteur pipet....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu prosedür, hesaplama izleme rutinleri (Sabass ve ark, 2008) uygulanması ile birlikte, kurulum için bir çekim gücü mikroskobu (TFM) deneyi burada açıklanan mikron ölçekli mekansal çözünürlüğe sahip cep güçlerinin ölçümü için izin verir . Deney protokolünde optimize etmek için, ECM ligand tekdüze kaplama ile saf ve düzgün bir jel substrat oluşturmak için kritik öneme sahiptir. Aşağıda potansiyel tuzaklar tartışın:
Üniform Olmayan Jel Yüzey veya Tears:
Deney.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Ulrich Schwarz laboratuar hücresel çekiş güçleri ölçümü (Sabass ve ark, 2008) kullanılan hesaplama izleme yazılımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, bir Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü ve ML Gardel ve Tıp Scientist Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (5 T32 GM07281) SP Kış NIH Müdürü Pioneer Ödülü (DP10D00354) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3-aminopropiltimetoksisilan | Aldrich | 28, 177-8 | |
| %40 Akrilamid | Bio-Rad | 161-0140 | |
| %2 Bis-akrilamid | Fisher Scientific | BP1404 | |
| TEMED | Fisher Scientific | BP 150-20 | |
| Amonyum persülfat | Fisher Scientific | BP179 | |
| 40nm floresan mikroküreler | Invitrogen | F8789 | |
| Sulfo-SANPAH | Pierce, Thermo Scientific | 22589 | |
| Konfokal görüntüleme haznesi (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | |
| Lamel döndürücü | Ev yapımı | NA | |
| Ultraviyole lamba CL1000 | UVP Inc. | 95-0228-01 | |
| Paslanmaz çelik raf | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | |
| akriloil-X, SE (6-((akriloil)amino)hekzanoik asit) | Invitrogen | A-20770 | |
| Hidrazin hidrat | Sigma-Aldrich | 225819 | |
| Sodyum meta-periyodat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20504 | |
| İzopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Fibronektin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Kolajen | BD Biosciences | 354236 | |
| Lamel (#1.5) | Corning | 2940‐224 | |
| Glutaraldehit | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | |
| Asetik Asit | Acros Organics | 64-19-7 |
Kaynaklar
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
