Bu yazıda daraltıcı manşet fare karotis arter ateroskleroz ikna etmek için tasarlanmıştır. Implante manşet farklı inflamatuvar fenotip aterosklerotik lezyon gelişimi tetikleyen yüksek, düşük ve salınımlı shear stresin iyi tanımlanmış bölgeler oluşturur, kendi iç lümen konik şekli nedeniyle.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Shear stres İndüklenmiş Ateroskleroz Tetikleme Karotis Kol İmplantasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Bu yaygın vasküler kayma gerilmesi değişiklikler, endotel hücreleri inflamatuar genlerin ifadesi tetikleyebilir ve böylece (1 ve 2 gözden) ateroskleroz neden kabul edilir . Shear stresin rolü kapsamlı in vitro kültür endotel hücreleri 1,3,4 akış dinamiklerinin etkisini araştıran ve büyük hayvanlar ve insanlar 1,5,6,7,8 in vivo olarak çalışılmıştır. Ancak, plak gelişimi üzerinde kayma gerilmesi etkisi sistematik soruşturma sağlayan yüksek tekrarlanabilir küçük hayvan modellerinde nadirdir. Son zamanlarda, Nam ve ark. 9, karotis arter dallarının ligasyonu, düşük ve salınımlı akış bir bölge oluşturur, bir fare modelini tanıttı. Bu model, endotel disfonksiyonu ve hiperlipidemik farelerde aterosklerotik lezyonların hızlı oluşumu neden olsa da, gözlenen inflamatuvar yanıt, en azından kısmen bir sonucu o olduğunu dışlanmış değildirf endotel ve / veya ligasyonu nedeniyle damar hasarı.
Bu sınırlamalar önlemek için, kayma gerilmesi değiştirerek manşet olan koni biçimli iç lümen, 10 karotis arter içinde yüksek, düşük ve salınımlı shear stresin tanımlanmış bölgeleri oluşturmak üzere seçildi hesaplanır akışkanlar dinamiği üzerine geliştirilmiştir . Apolipoprotein E (Apo E) knockout farelerde bu modeli uygulayarak, yüksek kolesterol, batı tipi diyetle beslenen, vasküler lezyonlar manşet memba ve mansap gelişir. Onların fenotip in vivo Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) 12 tarafından onaylandıktan sonra bölgesel akış dinamikleri 11 ile ilişkilidir: Düşük ve laminar shear stres yukarı manşet daha yatkın fenotipe geniş plaklar oluşmasına neden olur ise salınım kayma stres mansap manşet istikrarlı aterosklerotik lezyonların 11 neden olur. Yüksek kayma gerilmesi ve manşet içinde yüksek laminar flow bu bölgelerde,genellikle herhangi bir aterosklerotik plakların görülmektedir.
Sonuç olarak, kayma gerilmesi değiştirerek manşet prosedürü ApoE eksikliği olan farelerde fenotipik farklı aterosklerotik lezyon üretmek için güvenilir bir cerrahi yaklaşımdır.
Protokol
1. Kayma gerilmesi değiştirici hazırlanması (manşet)
- Kayma gerilmesi değiştirici iki boyuna yarı yarıya bir koni şeklinde lümen ile bir silindir oluşur. Yarım kabukları, plastik döküm yöntemi ile üretilen termoplastik polyetherketone yapılır. Hala runner bağlıyken döküm elemanları gönderildi. Bu nedenle, yarım kabukları kullanmadan önce kesilmiş olması. 300 mikron (downstream sonunda en düşük iç çapı) - Her dökme 150 mikron arasında değişen farklı boyutlarda yarısı kabukları içerir.
- Manşet hazırlık, cerrahi mikroskop altında yapılmalıdır.
- Künt forseps ile manşet yarım kabuk tutun ve hafifçe keskin bir neşter kullanılarak dökme kesti. Bu prosedür, daha fazla işlenmek üzere yarım kabuk öncüleri yol açacaktır.
- Yarım kabuk habercisi hatta kaygan olmayan bir plaka üzerine yerleştirin; rem için künt forseps ile düzeltin ve önceden yapılmış kesi boyunca tam kesmekkapalı uç Ove. Bu kullanıma hazır manşet yarım kabuk verecektir.
- Mikroskop altında yarım kabukları Kontrol ve kalan tüm keskin kenarları hafifçe kaldırın. Konik iç lümen, memba ve mansap implante manşet içinde kayma gerilmesi farklı kalitelerde indüklemesi için gerekli. Iç lümen dik çalışan yarım kabukları dış yüzeyinde oluk sonunda fonksiyonel manşet oluşturmak üzere bir araya yarısı kabukları sopalarla parçacığı için bir yol gösterici olarak hizmet vermektedir.
- % 70 etanol içinde, boyutuna göre sınıflandırılır manşet yarısında kabukları, saklayın.
2. Sağ karotis arter çevresinde manşet implantasyon
- ApoE knockout farelerde yaşı 10 hafta civarında ve en az 20 gram ağırlıkta olmalıdır. Plak gelişimi yüksek kolesterol diyet altında incelenmiştir, bu tür bir batı tipi diyet başlangıç olmalı, 4 hafta önce manşet implantasyonu tavsiye edilir.
- Tüm cerrahi prosedüren azından yarı steril koşullar altında yapılan bir cerrahi önlük, maske ve kapak ve steril eldiven giyin. 30 saniye boyunca bir boncuk enstrüman sterilizatör aletleri sterilize ve steril bir opak levha üzerine yerleştirin. Dikkat edin! Aletleri kullanmadan önce soğumaya var!
- Tamamen anestezi kadar% 3 izofluran ile dolu bir anestezi indüksiyonu odasında fare yerleştirin. Ayak tutam tepki ile anestezi derinliği olun. Alternatif olarak, anestezi, Ketamin (80 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) veya IACUC tarafından onaylanmış alternatif anestezikler intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile yapılabilir. Ip enjeksiyon yatar pozisyonda fare tuşunu basılı tutun ve karın sol alt kadranda anestezik enjekte edilir.
- Yatar pozisyonda, ısıtılmış bir cerrahi plaka üzerinde fare yerleştirin. Göz merhem (örneğin Bepanthen göz ve burun losyon) ile nemlendirin kuru çalışan gözleri önlemek için. Plaka ön ve arka pençeleri ve bant onları aşağı yayıldı. Izofluran anestezi, narkotik gaz akışı (% 2 isoflurane), küçük bir kemirgen maske yolu ile temin edilecek varsa.
- Uygulayarak ya da tüy dökücü ajan (örneğin Pilca Med) ya da ince bir elektrikli tıraş makinesi (örneğin, Wella Contura) kullanarak Mandibula ve sternum arasında saç çıkarın. Tıraş cildi tahriş önlemek için dikkatli olmak zorundadır. Tüm saç ve tüy dökücü ajan çıkarılana kadar, tüy dökücü bir ajan kullanılarak, saç nüfuz için 1-2 dakika sonra, hafifçe ovalayın.
- (Her büyüklüğünün iki) farklı boyutlarda ve birbirine 6-0 ipek sütür 2.5 cm uzunluğunda bir parça karotis oklüzyonu yerinde yarım kabukları önceden hazırlanmış hazır manşet yarım kabukları var.
- Betadine liberal miktarı ile çalışma alanı dezenfekte edin. Sternum (manubrium) üstten başlayarak 4-5mm medial insizyon ile cilt ve boyun altta yatan fasya açmak için keskin küçük bir makas kullanın.
- Açılış, genişletinkenara sağ parotis bezi hift ve cerrahi dağıtıcısı takın. Titreşimli sağ karotis tespit edebilmek kadar açık açık, sadece sağ sternomastoideus kas sağ omohyoid kas geçen trakea (cerrahlar görünümü), sol, derin teşrih.
- Çok ince, açılı ya da eğri forseps (örneğin Dumont # 5 / 45) kullanarak, çevresindeki bağ dokusu hafifçe kaldırarak sağ karotis arter disseke. Karotis boyunca doğrudan çalışan beyaz, tel nesne - - vagus siniri karotis Ayrı geminin tamamen açığa çıkarmak için bu adımı gerekli olduğu. Dikkatli olun ne karotis yakın bağlantı da sol internal juguler ven, vagus siniri ne de bir şube zarar vermek.
- Doğru manşet boyutu seçmek için, manşet yarısında kabukları iç çapı maruz karotis çapı karşılaştırın: manşet lümen en büyük genişlik karotis dış çapı karşılamak gerekir. Şimdi, dikkatle, karotis altında forseps ucu koymak forseps açmak, iplik, karotis altında 6-0 ipek sütür parça ve bir döngü oluşturur. Karotis altında ve döngü karotis yerinde bir manşet yarım kabuk arasında. En büyük daralması yan downstream olmak zorundadır.
- Karotis üstünde döngü içinde ikinci manşet yarısı kabuğu koyun.
- Sütür forseps ve düğüm iplik kullanarak dikiş döngü hafifçe sıkın. Bunu yaparak işleyen bir kayma gerilmesi değiştirici oluşur. Hassas montaj için manşet manşet dış yüzeyinde dikiş preformed oluk içinde tam olarak çalışıp çalışmadığını gereklidir.
- Sağ parotis bezi yaklaşık orijinal konumuna geri hareket ettirin ve 6-0 prolen sütür küçük bir miktar kullanarak ya da alternatif olarak, yara klipler kullanabilirsiniz cilt yakın.
- Subkutan profilaktik ağrı tedavisi ve yer sağlamak için 5 mg / kg Carprofen (örneğin Rimadyl) bir tek doz enjekte edilirfare ısınma odasında iyileşene kadar. Normalde, bu Ketamin / Xylazine anestezi kullanılarak 30-60 dakika sürer. Izofluran inhalasyon anestezi iyileşme dönemi kullanırken, önemli ölçüde daha kısadır (10-20 dakika).
- Bizim tecrübelerimize göre, hayvanlar, deneyimli bir cerrah tarafından yapılan müdahale ile yeniden manşet implantasyon sonrası ilk 24 saat içinde normal stressiz faaliyet. Hayvan bile bir gün ameliyat sonrası sıkıntı gibi görünen Ancak, analjezik tedavi tekrarlayın ve veteriner kadrosu ile danışın.
3. Manşet ve karotis arterler Explanting
- Histolojik analiz için karotid arterler gözlem süresi sonunda hasat olmak zorunda. Eksplantasyonu başlamadan önce, hayvan IACUC kurallarına göre öldürülmüş olması gerekir.
- Manşet yarım kabukları yeniden kullanım için tasarlanmıştır, dikkatlice, plastik unsurları, dis tüm doku parçaları ve bağlantı dikiş kaldırmakkarotis arterler secting, yıkayın ve yarım kabukları% 70 alkol solüsyonu saklamak. Bir manşet implantasyonu birkaç hafta sonra bir damar duvarları zarar görmemesi için dikkatli manşet incelemek için bağ dokusu yapışıklıklar gömülü olduğunu akılda tutmak gerekir.
- Alternatif olarak, manşet eksplante ve karotis arter ile birlikte gömülü. Manşet plastik malzemeden parafin gömmek için kullanılan normal fiksasyon çözümleri ve çözücülere dayanıklıdır. Ayrıca, gömülü numuneleri, normal bıçaklarla donatılmış bir normal mikrotom kullanılarak kesilebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Manşet, her zaman bir hayvan iki karotis arterler (Şekil 1A, 1B) yaklaşık bir konulmalıdır karşı taraf bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Manşet (Şekil 1B), iki yarım kabukları görüntü sunan iç lümen konik şekli görünür. Bu konik es için gerekli olanfarklı akış dinamikleri ile üç bölge tablishing. Doppler ölçümleri 11 ve karşılık gelen akım hızları, faz-kontrast hız MR 12 dayalı hesaplanan cast tarafından oluşturulan tipik kayma stres modelleri Şekil 2'de verilmiştir .
Manşet ApoE knockout farelerde implante bir batı tipi diyetle beslenen, değişen akış dinamikleri kışkırtmak makası strese bağlı aterosklerotik plak birikimi (Şekil 3): Memba konik daralma düşük laminar shear stress aterosklerotik plakların daha büyük gelişme yol açar merkezi lümen yakın lipid çekirdek tarafından karakterize yatkın fenotipe, sadece ince bir fibröz kapağı (Şekil 3A1) tarafından kapalı. Manşet konik iç lümen akış hızında bir artışa neden olur. Neredeyse hiçbir plak birikimi bu alanda görülmektedir. Doğrudan hemen vortekslerini ve salınım flo bir alanda arter sonuçları genişletilmesi darboğaz site mansapw parametreleri, daha istikrarlı bir fenotip (medya daha yakın lokalize yani daha az lipid çekirdeği) daha uzun plak gelişimine neden olur.
Şekil 1. kayma gerilmesi değiştirici - montaj ve yerleştirme (A) implante manşet şematik çizim:. Manşet sağ karotis arter (RCCA) etrafına yerleştirilir (LCCA = sol karotis arter) karşı taraf kontrol olarak hizmet vermektedir . (B), bir fare, in vivo MR anjiyografi: maksimum yoğunluk projeksiyonu üç boyutlu zaman-cast (beyaz ok) tarafından uyarılan konik bir daralma uçuş MR anjiyografi (Ayrıntılar için: 12 görmek için) görülebilir. (H = kafa, F = ayaklar, R = sağ, L = sol). Iç lümen ve manşet yarısında kabuğu dış yüzeyi üzerinde sağ üst köşesinde bir makroskopik görünümü verilir. Montaj yapıldığında, iki yarım kabuk değiştiren bir konik silindir formutanımlanmış bir şekilde geminin içinde akış dinamiği. Doğru uyum sağlamak için, manşet (sarı ok) dış yüzeyinde bir oluk bağlama sütür için bir yol gösterici olarak hizmet vermektedir.
Şekil 2 farklı akış dinamikleri ve kayma gerilmesi Bölgeleri tanımlanmış bir şekilde daralmış karotis arter manşet değiştirir akım dinamiği ve daha sonra kayma gerilmesi implantasyonu. Üst şematik çizimde farklı akış özellikleri belirtilir ve kayma gerilmesi için yerel yaklaşık değerler (Doppler ölçümleri 11 dayalı verilmektedir). Aşağıda, tek bir hayvan için implante manşet MRG upstream tarafından ölçülen boyun kesitsel T1-ağırlıklı MRG (Ayrıntılar için: 12 görmek için faz-kontrast hız görüntüleme) karşılık gelen akım hızları gösterilmektedir.
Şekil 3. Kayma gerilmesi ApoE knockout farelerde plak gelişimini tetiklediği sol üst köşesinde açılan boyun makroskopik görünümü gösterir ve kayma gerilmesi implantasyonu 8 hafta sonra, yüksek yağ (Batı tipi) diyet altında bir ApoE nakavt fare karotis arterler açık sağ karotis arter (RCCA) etrafında değiştirici. Manşet yukarı damar (*) opak beyaz bölgenin kapsamlı aterosklerotik plak birikimi bir site için karşılık gelir. Sarı ok, iki manşet yarıları bir araya getiren iş parçacığı gösterir. Buna karşın, plak birikimi hiçbir belirti ortak sol koroner arter (LCCA) vardır.
(A) - (C) Temsilcisi Sayın manşet implantasyonu 8 hafta sonra batı tipi diyet altında bir ApoE nakavt fare sağ karotis arter kesitleri boyandı. Şematik çizimde (noktalı çizgiler) karşılık gelen uçaklar nereye verire bölümleri bulunmaktaydı. (A) manşet ateroskleroz Memba büyük plak birikimine yol açar. Kısmen merkezi lümen (detay A1) yakın bulunmaktadır büyük lipid çekirdek (kırmızı oklar), bu plakların savunmasız karakterini karakterize eder. (B) (C) manşet doğrudan akış aşağı salınımlı akış, daha istikrarlı bir türü (yani az ya da hiç lipid çekirdek) plak gelişim orta yol ise manşet darboğaz düzlemine neredeyse hiç plak gelişimi, açıktır. (C1, C2 = manşet yarım kabukları, p = plaklar, yıldız = damar lümeni)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Deneysel varyasyonu en aza indirmek için, bu hemen hemen aynı yaştaki hayvanlar ve aynı diyet geçmişi ile çalışmak tavsiye edilir. Geçenlerde yayımlanan bir araştırma, yabani-tip farelerden uygulanan kayma gerilmesi değiştirici değişen akım dinamiği 13 ile indüklenen endotel disfonksiyonu ve erken inflamatuar yanıtlar araştırma için iyi bir model olabileceğini gösteriyor . Ancak, aterosklerotik plak gelişimi transgenik hiperlipidemik fare modelleri, soruşturma için gerekli olan (örneğin ApoE nakavt fare). Her...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Teşekkürler
Bu çalışmada, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), proje GZ PI 771/1-1 kısmen desteklenen; SFB 656 "Kardiyovasküler Moleküler Görüntüleme," Münster, Almanya (projeleri C6, Z2, B3 ve PM3); AB NoE "Tanı Moleküler Görüntüleme-Dimi "(WP 11.1 ve 11.2). Çalışmada ayrıca İngiliz Kalp Vakfı, İngiltere tarafından finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Isim | Şirket | Yorumlar | |
| Kesme gerilmesi değiştirici (polyetherketone) | Promolding BV http://promolding.nl | Hala runner bağlıyken atmalarını gönderilir. Böylece, tek öğeleri kullanmadan önce kesilmiş olması. |
Kaynaklar
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
- Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
- Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
- Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
- Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
- Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
- Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
- Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
- Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
- van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
- Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
