Bu video, immün yetmezlik modelindeki bir sıçanda, insan damarı (IMA) kullanılarak stent yerleşimi sonrası intimal hiperplazi gelişimini inceleyen bir modeli göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan internal meme arter (İMA) Transplantasyon ve Stent: In-Stent Restenozis Geliştirme Eğitim Bir İnsan Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Damar stentlemesi sonrası intimal hiperplazi gelişimindeki patobiyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için kullanılan preklinik in vivo araştırma modelleri, translasyonel yaklaşımlar için kritik öneme sahiptir1,2.
Sıkça kullanılan hayvan modelleri arasında fareler, sıçanlar, tavşanlar ve domuzlar yer almaktadır3-5. Bununla birlikte, bu biyolojik süreçler hayvan damarlarında halihazırda çalışılmış olmasına rağmen insan araştırma modellerinde daha önce hiç uygulanmadığından, bu modellerin klinik ortamlara aktarılması zor olmaya devam etmektedir6,7. Bu videoda, bu translasyonel boşluğu gidermek için geliştirilen yeni bir insanize modeli sunuyoruz. Gösterilen prosedür tekrarlanabilir, kolay ve hızlı uygulanabilir olup, intimal hiperplazi gelişimini ve çeşitli stentlerin uygulanabilirliğini incelemek için uygundur.
Bu video, insan damarlarında stent tekniğinin nasıl uygulanacağını ve ardından immunodeficient sıçanlara transplantasyon işlemini göstermekte ve çoğalan hücrelerin kaynağının insan olduğunu tanımlamaktadır.
Protokol
1. İnternal Mammary Arter (IMA) Hazırlığı
- Arteriyel endotelyum, 2-french Fogarty arteriyel embolektomi kateterinin (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA) geçirilmesiyle soyulur. Endotelyal hasarın sağlandığından emin olmak için kateter, tüm damar boyunca iki kez çekilir.
- 8 mm uzunluğunda ve 2,5 mm-3 mm çapında herhangi bir insan stenti (örneğin Translumina, Yukon stent) kullanın. UYARI: Stent öncesi ve sonrası stenozu önlemek için stentin çapı, damar çapını %10'dan fazla aşmamalıdır. UYARI: Aynı çalışma içinde stentin uzunluğunu değiştirmeyin.
- İstenilen çapı elde etmek için uygun balon basıncını (stent paketinde belirtilen) kullanarak stenti yerleştirin.
- Stentlenmiş IMA'yı, transplantasyona kadar buz üzerinde 4 °C RPMI + heparin (500 IE/10 ml) içinde saklayın.
2. Hayvan Hazırlama
RNU Nude (Crl:NIH-Foxn1rnu) sıçanlar (300-350 g), standart sıçan yemi ve otoklavlanmış su ile ad libidum beslenerek, havalandırmalı scantainer kabinlerinde konvansiyonel koşullar altında barındırılır.
- Sıçanı bir indüksiyon kamerası kullanarak isofluran (%2,5-3) ile anestezi altına alın.
- Karın bölgesindeki tüyleri tıraş edin, sıçanı sırt üstü yerleştirin ve anesteziyi sürdürmek için burun ve ağız kısmına bir yüz maskesi takın.
- Karın bölgesini Provo-Iodine kullanarak genişçe dezenfekte edin, ardından %80 etanol kullanın - bu adımı iki kez tekrarlayın. Sıçanın yeterince anestezi altında olduğundan emin olmak için arka ayaklarını sıkarak refleksleri kontrol edin.
- Mikroskobik görünüm altında, infrarenal abdominal aortayı açığa çıkarmak için üst medyan laparotomi gerçekleştirin.
- Bağırsakları salinle nemlendirilmiş bir eldivenin içine yerleştirin. Nem kaybını önlemek için eldiveni bağırsakların etrafına katlayın.
- Damar dallarına zarar vermemeye dikkat ederek, aortayı infrarenal bölgeden bifurkasyona kadar disseke edin.
- Aortik kan akışını durdurmak için mikro klempler kullanın. Önce proksimal klempi, ardından distal klempi yerleştirin.
- Yaklaşık 0,5-0,7 mm'lik bir aort segmentini çıkarın ve geri kalan aortayı heparin (200 units) ile yıkayın.
- Stentli IMA'yı alın, uygun uzunluğa kısaltın ve boşluğa yerleştirin.
- 8-0 prolene sütür (Ethicon, Norderstedt, Almanya) kullanarak sürekli dikişlerle IMA'yı alıcı aortaya bağlayın.
- Önce birinci kranial klempi, ardından kaudal klempi dikkatlice açın.
- Transplante edilen IMA'da ve aortanın distal ucunda görünür bir nabız olmalıdır.
- Bağırsakları tekrar karın boşluğuna yerleştirin.
- Karın boşluğunu önceden ısıtılmış steril salin ile yıkayın.
- Karın duvarının kas tabakasını 6-0 prolene sürekli dikişler (Ethicon, Norderstedt, Almanya) kullanarak kapatın.
- Sıçan hâlâ anestezi altındayken, cilt altına 4-5 mg/kg Karprofen enjekte edin.
- Ameliyat sonrası 3 gün boyunca uygun post-cerrahi analjezik (örneğin Karprofen veya Meloksikam) uygulayın.
3. Temsili Sonuçlar
Histoloji için numuneler %4 formalin ile fikse edilmiş, dereceli bir alkol serisindeye dehidre edilmiş ve 1 gün boyunca %80 metilmetakrilat ve %20 dibütilftalat karışımında (MMA I), 1 gün boyunca %1 kuru benzoil peroksit içeren MMA I'de ve 4 °C'de 1-2 gün boyunca %3 kuru benzoil peroksit içeren MMA I'de (MMA III) infiltre edilmiştir. Ardından numuneler, önceden polimerize edilmiş bir taban üzerinde, su banyosundaki cam tüplerde taze MMA III içerisinde polimerize edilmiştir. Yavaş polimerizasyon, tüplerin gece boyunca 26 °C'de tutulması, ertesi sabah sıcaklığın 28 °C'ye çıkarılması ve ardından polimerizasyon gerçekleşene kadar 12 saat boyunca sıcaklığın kademeli olarak 0.5 °C artırılmasıyla sağlanmıştır. Polimerize bloklar, tungsten karbür bıçakla donatılmış bir MICROM HM 360 mikrotom kullanılarak 5 μm kalınlığında kesilmiştir.
Prolifere olan hücrelerin kaynağını belirlemek için (Şekil 1), lamlar ya yeşil floresan proteini (GFP) ya da sıçan MHC-I ve insan düz kas hücrelerini tanımlayan antikorlarla boyanmıştır. Bu çalışmalar için, IMA hücrelerinin stabil transdüksiyonu amacıyla lentiviral partiküller kullanılarak insan IMA, rapor gen GFP ile gece boyunca inkübe edilmiştir. İnsan kaynaklı bölünen yavru hücreler, GFP eksprese ederek tanımlanabilmektedir. Deparafinizasyon sonrası, lamlar bir buharlaştırıcı kullanılarak antijen geri kazanım solüsyonunda ısıtılarak ısıya bağlı epitop geri kazanımı gerçekleştirilir. Bloklama adımı için Image-iT FX sinyal artırıcı kullanılabilir. İnsan kaynaklı hücreler, GFP'ye karşı fare monoklonal antikorları (birincil antikor dilüentinde (Dako) 1:100 oranında seyreltilmiş) kullanılarak tanımlanmış ve ardından keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 488 (ikincil antikor dilüentinde 1:1000 oranında seyreltilmiş) ile işaretlenmiştir. Düz kas hücreleri, tavşan poliklonal anti-düz kas α-aktin (birincil antikor dilüentinde 1:100 oranında seyreltilmiş) ile işaretlenmiş, ardından keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 555 (ikincil antikor dilüentlerinde 1:1000 oranında seyreltilmiş) uygulanmıştır. Her bir antikor inkübasyon adımı, aralarda üç kez PBS yıkaması yapılarak 37 °C'de 1 saat boyunca gerçekleştirilir. Çekirdekler 10 dakika boyunca DAPI ile boyanır. Lamlar Prolong Gold antifade reajanı kullanılarak kapatıldıktan sonra, örnekler konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilmiştir.
Şekil 1. İnsan düz kas hücreleri olarak neointimal hücreler. A: Yeşil= insan kökenli hücreleri işaretleyen anti GFP; kırmızı= anti insan düz kas hücresi aktini; mavi= hücre çekirdeklerini tanımlayan DAPI. B: Yeşil= sıçan kökenli hücreleri işaretleyen anti sıçan MHC-I; kırmızı= anti insan düz kas hücresi aktini; mavi= hücre çekirdeklerini tanımlayan DAPI. Prolifere olan hücreler düz kas hücreleri olarak tanımlanmış olup GFP için pozitif, ancak sıçan MHC-I molekülü için negatiftir. Bu nedenle, prolifere olan hücreler insan kökenlidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Stent yerleşimi sonrası intimal hiperplazi gelişimini incelemek için farklı in vivo araştırma modelleri mevcut olsa da, bu modeller hala aşılması gereken translasyonel engellerle karşı karşıyadır. Ayrıca, büyük hayvan modelleri maliyetlidir; özel barındırma koşulları ve cerrahi ekipmanlar tüm laboratuvarlarda mevcut değildir.
İnsan intimal proliferasyonunun ve stent içi restenozun gelişimini incelemek için insan IMA'sı kullanımı daha önce organ kültürlerinde ex situ olarak ça...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.
Teşekkürler
Yazarlar, katkılarından dolayı Christiane Pahrmann'a teşekkür ederler. Sütür materyallerini sağladıkları için Ethicon, Norderstedt, Hamburg'a (Almanya) özel teşekkürler sunulur.
Finansman
Sonja Schrepfer, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) kurumundan araştırma bursu (SCHR992/3 1 ve SCHR992/4-1) almıştır. Bu çalışma, ISHLT Shumway Kariyer Geliştirme Bursu 2010 ve Falk Araştırma Fonu (Stanford Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2 French Fogarty kateteri | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Yukon Stent | Translumina GmbH, Hechingen, Germany | Çalışma protokolünüze göre seçtiğiniz stenti kullanın | |
| RPMI besiyeri | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparin | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| izofluran | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% etanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Mikro klemps | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| 8-0 Sütürler | Johnson & Johnson | 2808G | |
| 6-0 Sütürler | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Karprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Hedef geri kazanım çözeltisi, pH9 | Dako | S2368 | |
| Image-iT FX sinyal artırıcı | Invitrogen | I36933 | |
| fare monoklonal anti-GFP antikoru | BD Biosciences | 632381 | |
| primer antikor dilüent | Dako | S3022 | |
| keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| sekonder antikor dilüent | Dako | S0809 | |
| tavşan poliklonal anti-düz kas α-aktin | Abcam | ab5694 | |
| keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Prolong Gold solma önleyici reaktif | Invitrogen | P36930 |
Kaynaklar
- Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346(2009).
- Oyamada, S. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).
- Chamberlain, J. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).
- Deuse, T. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).
- Finn, A. V. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).
- Tellez, A. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).
- Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).
- Holt, C. M. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
- Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
