Method Article

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

DOI:

10.3791/50231

⸱

January 6th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer mikrodisseksiyon parankiminde dakika miktarlarda seçili hücrelerin iyileşme sağlayan bir tekniktir. Burada Transkriptomik çalışmaları için kullanılacak cerrahi yöntemlerle alınan insan pankreas adacık elde etmek için bir protokol açıklar. Tüm protokol böylece toplama kolaylaştırılması insan beta hücrelerinin içsel otofloresansı, geliştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer mikrodisseksiyon (LMD) parankim 1,2 dakika miktarlarda seçili hücrelerin ve dokuların iyileşme sağlayan bir tekniktir. Disseke hücreleri gibi Transkriptomik veya proteomik çalışmalar, DNA değerlendirmesi veya kromozom analizi 2,3 gibi soruşturmaların, çeşitli için kullanılabilir. LMD ait özellikle zor bir uygulama RNA 4 değişkenlik nedeniyle, hücreler örneğin pankreas gibi RNaz, yönünden zengin olan dokulardan gelen parçalanmış zaman özellikle belirgin olabilir, transcriptome analizdir. Hedef hücrelerin hızlı belirlenmesi ve toplanmasını sağlayan bir mikrodisseksiyon protokol doku işleme süresini kısaltmak için ve, sonuç olarak, RNA koruma sağlamak amacıyla, bu durumda önemlidir.

Burada Transkriptomik çalışmalar 5 için kullanılmak üzere cerrahi örneklerden insan pankreatik beta hücreleri elde etmek için bir protokol açıklar. 0.5-1 hakkında c pankreas Küçük parçalarm 3 kesit kadar hemen 2-metilbutane soğutulmuş dondurulmuş Tissue-Tek Ekim Bileşik gömülü rezeke pankreas numunelerin sağlıklı görünen marjları, kesilmiş ve -80 ° C'de depolanan edildi. 10 mikron kalınlığında, kırk seri bölümleri 1-2 dk kriyostat içinde kurutulur ve -80 saklanan cam slaytlar, ° C için ayrı ayrı transfer, -20 ° C ayar altında kriyostat üzerine kesildi

Hemen lazer mikrodiseksiyon işlem öncesi, bölümleri buz% 100 iki bir dakikalık inkübasyonlar tarafından, buz giderilen taze 30 sn için% 70 etanol hazırlanan buz DEPC-işlenmiş su 5-6 dips ile yıkandı ve susuz edildi Etanol 4 dk için ksilen (doku kurutma için kullanılan) takip etmektedir; doku bölümleri 3-5 dakika süreyle daha sonra o zaman hava kurutuldu. Önemli olarak, bütün adımları, ksilen içinde kuluçka dışında, buz gibi soğuk reaktifler kullanılarak yapıldı - daha önce açıklanan protokol 6 fazla bir değişiklik. Utbuz reaktiflerin yonu beta hücrelerinin içsel otofloresans belirgin bir artışa yol açmıştır, ve bunların karşılaşılmaktadır. Mikrodisseksiyon için, dört bölümden her zaman susuz: iki nem ve ağartma gelen doku korumak için, bir folyo sarılı 50 ml tüp içine yerleştirildi, geriye kalan iki hemen microdissected edildi. Bu prosedür (AutoLPC) modu catapulting Otomatik Lazer Basınç kullanan bir PALM MicroBeam enstrüman (Zeiss) kullanılarak yapıldı. 40-60 dk daha artık gerekli dört cryosections gelen beta hücre / adacık diseksiyon tamamlanması. Hücreler bir AdhesiveCap içine toplanmış ve 10 ul lizis tamponu ile lizlendi. Transkriptomik analiz için her biri tek bir RNA örnek 10 hücre microdissected örnekleri, Pico Saf RNA izolasyon kiti (Arcturus) kullanarak, RNA ekstre bir araya getirilmesiyle elde edilmiştir. Bu protokol böylece hızlı ve doğru bir şekilde tanınmasını ve c kolaylaştırılması, insan beta hücrelerinin içsel otofloresans artırırollection. Bu prosedürü daha da iyileştirilmesi tip 2 diyabet ile ilişkili değişiklikler daha iyi anlamasını mümkün etkileri olan, fenotipik farklı beta hücrelerinin diseksiyonu sağlayabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İnsan Pankreas Doku Dondurucu

  1. Yağ dokusu, kan damarları, sinirler ve neşterin ve cımbız ile non-parankimal doku çıkarın ve parçaları (~ 0,5-1 cm'lik küpler) içine pankreatik doku kesti.
  2. Bir Cryomold merkezinde tek pankreas dokusu parça yerleştirin ve soğuk Tissue-Tek Ekim bileşiği ile tamamen kapsamaktadır. Kimin altında sıvı azot içinde önceden soğutulmuş 2-metilbutane ve ek dondurma ile kaplı bir kavanoza Cryomold koyun. -80 ° C'de dondurulmuş numune depolamak

2. Dondurulmuş Bölümler hazırlanması

  1. RNA denatürasyon önlemek için tüm adımları boyunca eldiven giyin.
  2. Dışarda soğuk% 100 etanol ve RNaz ile kriyostat bıçak, Numune tutucu ve fırça temizleyin. Kriyostat içindeki dondurulmuş doku yerleştirin.
  3. Doku, bıçak ve fırça -20 ° C'ye ulaşıncaya kadar bekleyin Beklerken kriyostat odası içinde SuperFrost Plus slaytlar ve pre-serin bunları etiketleyindoku -20 ° C'ye ulaşması için
  4. Numune tutucu üzerindeki Tissue-Tek Ekim Bileşik sürün ve üstüne dondurulmuş doku yerleştirin.
  5. Tissue-Tek Ekim Bileşik dondurulur kez cryoblock Döşeme ve bir jilet ile Tissue-Tek Ekim Bileşik herhangi bir aşırı kaldırın.
  6. Pankreatik doku bloğundan 40 ardışık 10 mikron dilim toplam kesin. Ayrıca biz mikrodiseksiyon sürecinde dilimleri içinde adacıklar belirlenmesini kolaylaştıracak pankreatik kısmın genel çizimler için kaydedilmek üzere ilk ve orta dilim kesmek tavsiye.
  7. Bıçak bıçak bölümüne uyacaktır sadece bölgeyi ısıtmak için parmağınızı (bir eldiven ile kaplı) ile slayt arka dokunarak SuperFrost Plus slayt merkezine bölümleri aktarın.
  8. -20 Kriyostat içindeki bölümlerde 1-2 dk ° C, kuru buz üzerinde yerleştirilen bir slayt kutunun içine koyun sonra kurulayın. Bölümlerini depolamak-80 ° C
  9. Gerekirse, kağıt havlu ve soğuk% 100 etanol ile bıçak temizleyin.

3. Dondurulmuş Bölümler Dehidrasyon

  1. Reaktifler hazırlayın: 30 ml taze hazırlanmış% 70 etanol, 30 ml DEPC işlenmiş su, 2x30 ml% 100 etanol ve 50 ml Cellstar borular (Şahinleri) içine 30 ml ksilen dökmek, soğuk ve buz üzerinde tüm reaktifler (ksilen hariç) tutmak.
  2. % 100 etanol ve RNaseZAP ile kaputun altında çalışma alanı temizleyin.
  3. Şöyle Süreç iki cryosections: buz DEPC-işlenmiş su 5-6 hızlı dips ile yıkayın, 30 saniye boyunca buz gibi soğuk% 70 etanol içinde düzeltmek, ksilen 4 dakika inkübe edilir, buz% 100 etanol içinde 1 dakika boyunca iki kez kurutmak oda sıcaklığında (25 ° C), ve 3-5 dakika boyunca kuru hava at. Cryosections başka bir çift ile bu adımı yineleyin.
  4. Işık ve nemden korumak için alüminyum folyo ile sarılmış bir 50 ml Cellstar tüp içine sırt sırta iki kurutulmuş cryosections yerleştirin.

4. PALM MicroBeam, Zeiss ile Beta-hücreleri Lazer Diseksiyon

  1. RNaseZAP ile mikroskop temizleyin ve RoboMover yılında Yapıştırıcı Cap monte.
  2. Filtre seti 09 (uyartım: 450-490 nm, emisyon> 515nm), AutoLPC modu,% 50 lazer enerjisi,% 65 lazer odak,% 100 lazer hız, AutoLPC çekim arasında 5 mm mesafe, 6 mikron mesafe aşağıdaki ayarları belirleyin -10100: hattına Çalışma yüksekliği.
  3. Aşamasında içine bir slayt yerleştirin.
  4. Mikroskopik (5x veya 10x objektif) altında autofluorescent beta hücreleri bulun.
  5. 40x lense geçiş, "Freehand" seçim aracı ile beta hücreleri seçin ve lazer kullanarak bunları microdissect.
  6. Tek AdhesiveCap içine dört susuz cryosections dokusu yakalayın.
    1 Yorum: Bir susuz cryosection ve beta hücreleri incelemek için zaman neden olacaktır doku bölümleri rehidrasyon önlemek için 10-20 dakikadan uzun olmamalıdırBozulması RNA.
    2 Yorum: kapısına kadar sahne taşıdıktan sonra görsel inceleme ile başarılı mikrodisseksiyon işlemi doğrulayın.

5. Microdissected Beta Hücre Zenginleştirilmiş Doku parçalanması

  1. RoboMover dan AdhesiveCap çıkarın.
  2. AdhesiveCap bir kapak ve 42 de ters inkübe ° C 30 dakika boyunca içine Pipet 10 ul ekstraksiyon tamponu (XB, PicoPure RNA İzolasyonu Takımı, Arcturus).
  3. 10,000 xg'de aşağı spin ve kuru buz üzerinde lizat koydu. RNA ekstraksiyonu yapılır kadar -80 ° C'de saklayın.
  4. Tekrar 3. adımları yineleyin.) 5.) Diğer tüm bölümler.

6. RNA Ekstraksiyon

  1. Tüm on 10 ul lizatları birleştirin
  2. % 70 Etanol (DNaz Tedavi dahil) 1:1 oranında Ekstraksiyon Tamponu (XB) kullanarak, PicoPure RNA İzolasyonu Takımı, Arcturus protokole göre oda sıcaklığında çalışarak RNA izolasyonu ile devam edin.

7. RNA Analizi

  1. Bir Agilent 2100 Bioanalyser (picoChip'in) kullanarak kalite ve miktar analizi için 1 ul RNA kullanın. Kantitatif değerlendirme çip üzerinde paralel olarak yüklü bir RNA için referans standart olarak yapılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 'de gösterildiği gibi, modifiye dehidrasyon protokol daha önce yayınlanmış protokol 6'ya göre beta hücrelerinin otofloresans bir iyileşmeye yol açmıştır. Açıklanan protokol uygulama, 39 cerrahi pankreas örneklerin her biri 31'544'704 mikron 3 doku / pankreas numunenin bir ortalaması (- 81'522'153 um 3 8'742'390 aralığı) için seri cryosections 40 oluşturmak için kullanılan Tablo 1 de gösterilmiştir. Bu, 150 mikron çapında, 35,000 ya da β-hücreleri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz cerrahi pankreas örnek insan adacık lazer mikrodiseksiyon (LMD) için güvenilir bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bir LMD mikroskop mevcuttur kaydıyla, bu işlem böylece hem non-diyabetik ve tip 2 diyabetik bireylerin insan adacık materyale erişimin artırılması, kısmi pancreatectomies gerçekleştirirken herhangi bir araştırma kurumunda uygulanması olabilir. Bu adacık izolasyonu için sunulan pancreata yetersizliğinden ötürü verilen özellikle önemlidir. Uygun olup açıdan kollajenaz sindirimi ile adacık izolasyon ile karşılaş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu projenin çeşitli aşamalarında yardım, tavsiye ve kritik girişi sağlanan bütün arkadaşlarımıza teşekkür etmek istiyorum. Bu video makalenin Üretim IMIDIA (fonlarla desteklenen http://www.imidia.org ), Eğitim ve Diyabet Araştırma Alman Merkezi (DZD için Araştırma (BMBF) için Alman Bakanlığı http://www.dzd -ev.de ) ve Teknoloji Dresden Üniversitesi Üniversite Hastanesi Carl Gustav Carus. Bu yayın için önde gelen iş hibe anlaşması n ° 155005 (IMIDIA), Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve EFPIA verilen mali katkı oluşmaktadır hangi kaynaklar altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt destek aldı şirketlerin ayni katkılar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
2-metilbutane (izopentan) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opak, 500 ul) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Borular (50 ml) Greiner Bio-one 210 261 desteği etek ile
Cellstar Borular (50 ml) Greiner Bio-one 227.261
Dietil pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Donmuş karbondioksit
Mutlak etanol VWR 20821.310
Sıvı azot
Boya fırçasını
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-yol gömme kalıpları (kesilmiş), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 En içten 22x22 mm, derinlik 21 mm
Arcturus PicoPure Dondurulmuş RNA İzolasyonu Takımı Applied Biosystems KIT 0204
Plastik kelepçe
Ustura
RNaz-Alerjik DNaz Seti Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Bisturi /cerrahi bıçak Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus yapışma mikroskop slaytlar Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek Ekim Bileşik Sakura 4583 ya da 0807000022
Cımbız BRAUN BD168R
Ksilen VWR 28975.291

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962(2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionPancreatic IsletsHuman TissueTissue PreparationCryosectioningAutofluorescence DetectionRNA PreservationTranscriptomic AnalysisPALM MicroBeamAdhesiveCap Collection

Related Articles