Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Özet

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Özet

Bu protokolde, yakın zamanda piyasaya sürülen mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, deney kurulumu ve temel çalışması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. PLBR, hücre büyümesi, morfoloji, stres tepkisi ve tek hücre düzeyinde metabolit veya protein üretimi gibi biyoteknolojik ve mikrobiyolojik ile ilgili soruları araştırmak için tek bakteri ve mikro kolonilerin analizi için kullanılabilir. Cihaz, pertürbasyon çalışmaları için sabit çevresel koşulları mümkün kılan sürekli ortam akışına sahiptir, ancak buna ek olarak, istenen herhangi bir çevresel durumu taklit etmek için hızlı ortam değişikliklerine ve salınım koşullarına izin verir. Tek kullanımlık cihazları imal etmek için, mikrometre altı boyutlu SU-8 yapıları içeren bir silikon gofret, hızlı polidimetilsiloksan dökümü için çoğaltma kalıbı görevi gördü. Çipler kesildi, birleştirildi, bağlandı ve uzaysal-zamansal hücre analizi için güçlü bir araç olan hızlandırılmış görüntüleme için uygun yüksek çözünürlüklü ve tam otomatik bir mikroskop üzerine kuruldu. Burada, biyoteknolojik platform organizması Corynebacterium glutamicum PLBR'ye tohumlandı ve hücre büyümesi ve hücre içi floresan birkaç saat boyunca takip edildi ve akış sitometrisi gibi geleneksel analiz yöntemleriyle mümkün olmayan, tek hücre düzeyinde zamana bağlı popülasyon heterojenliğini çözdü. Cihaz imalatına ilişkin içgörülerin yanı sıra, ön kültürün hazırlanması, bakterilerin yüklenmesi, yakalanması ve tek hücrelerin ve kolonilerin PLBR yetiştiriciliği de gösterilmiştir. Bu cihazlar, sıkı çevresel kontrol altında tek bir bakterinin zamana bağlı fenomenlerini analiz etmek için mikrobiyolojik araştırmalara yeni bir boyut katacaktır. Basit ve nispeten kısa üretim süreci sayesinde, teknoloji herhangi bir mikroakışkan laboratuvarında kolayca uyarlanabilir ve özel ihtiyaçlara göre basit bir şekilde uyarlanabilir.

Giriş

Hızlandırılmış mikroskopi, canlı hücreleri in vivo¹ incelemek için güçlü bir araçtır. Bu arada, termal olarak indüklenen odak kayma telafisi de dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen tam otomatik mikroskopi platformları, kanser ve nöron hücresi araştırmalarından doku mühendisliği ve tek maya veya bakteri hücreleri^2-6 ile dinamik çalışmalara kadar zamana bağlı olayları incelemek için biyolojik araştırmalarda yaygın olarak uygulanmaktadır.

Hızlandırılmış görüntüleme sırasında hücre kültürü ortamları sağlamak için tipik olarak şeffaf kuyu plakaları, agar-pedler veya basitçe mikroskopi slaytları uygulanır⁷. Bazı araştırmalar için uygun olsa da, bu basit sistemler çevresel koşullar üzerinde çok sınırlı kontrole sahiptir ve daha karmaşık bozulmalara veya iyi tanımlanmış ve hızlı ortam değişikliklerine izin vermez. Seri üretimle üretilen tek kullanımlık mikroakışkan çip cihazları son zamanlarda piyasaya sürülmüştür, ancak çoğunlukla daha büyük ökaryotik hücre tiplerine göre uyarlanmıştır⁴. Büyüme takip edilebilse de, örneğin kesin hücre yakalama, koloni boyutu, büyüme yönü ve hücre çıkarma yeteneği ile ilgili iyi tanımlanmış büyüme araştırmaları sınırlıdır. Bakteri hücrelerinin 3 boyutlu ortamlarda kültürlendiği mikroakışkan habitatlar ve reaktörler^{geliştirilmiştir 8-10}, tek hücre düzeyinde kantitatif çalışmalarla uğraşırken dezavantajlara sahiptir. Genel popülasyon heterojenliği analiz edilebilirken, büyüme tek katmanlarla sınırlı olmadığı için birçok hücre parametresi tek hücre çözünürlüğü ile doğru bir şekilde belirlenemez.

Bu sınırlama, hücrelerin iyi tanımlanmış kanallarda ve habitatlarda yetiştirilmesini sağlayan mikro sistemlerin gelişimini tetikledi ve hücreler, tek hücre çözünürlüğü ve özellikle ortam arzı ve çevre koşulları üzerinde sıkı kontrol ile düz tek tabakalar halinde büyüyor^6,11,12. Bakteri hücrelerinin yetiştirilmesi için birkaç mikroakışkan sistem örneği gösterilmiştir^12-14. Bakteriler tipik olarak çok hızlı büyüme oranları sergilerler ve özellikle mikroskopi için hücre tek katmanları istendiğinde, birkaç mikrometre ve altında mikroakışkan yapılara ihtiyaç duyarlar. Keymer ve ark. mikrofabrikasyon arazilerde E. coli suşlarının büyümesini ve yayılmasını gösterdi^15,16. Popülasyon dinamikleriyle ilgilendikleri için tek hücreli çözünürlükle araştırma yapmadılar.

Tek hücre düzeyinde büyüme¹⁷ ve floresan bağlantılı verimlilik analizi gibi çeşitli biyoteknolojik performans göstergelerini araştırmak için şu anda uygulanan pikolitre biyoreaktörü (PLBR)^18,19 geliştirdik. Mevcut mikroakışkan cihaz, yaklaşık bir pikolitrelik tanımlanmış bir kültür hacminde çevresel reaktör kontrolüne ve aynı anda sürekli tek hücreli gözleme izin verir. Bir veya iki tarafın medya besleme kanalına açık olduğu açık tek katmanlı kutu sistemleri^11,14 ile karşılaştırıldığında, PLBR kontrollü yakalama ve kültürlemeye izin verir. Tasarım, birkaç bitişik koloninin büyük bir popülasyon oluşturma riski olmadan uzun süreli bakteri yetiştiriciliğine izin verir. Ayrıca sistem, bakteri büyümesini hücre tek katmanlarıyla sınırlamak için 1 μm yüksekliğinde (hücre çapı sırasına göre) yetiştirme bölgelerini içerir. Buna karşılık, hidrolik direnci en aza indirmek için besleme kanalları 10 kat daha derindir.

Minyatür toplu yetiştirme sistemleriyle²⁰ karşılaştırıldığında, mevcut sistem, sürekli ortam akışı nedeniyle sabit çevresel parametrelerle ekime izin verir. Ayrıca, ortam bileşimi, sıcaklık, akış hızları ve gaz değişimi gibi çevresel parametreler saniyeler içinde kolayca kontrol edilebilir ve değiştirilebilir. Bu, örneğin besin mevcudiyeti veya stres uyaranları ile ilgili çevresel değişikliklere hücresel tepkinin spesifik araştırmalarına izin verir. Sadece birkaç mikrolitre aralığında olan azaltılmış ortam hacimlerine olan talep, araştırmacıların, örneğin bu spesifik çevresel koşullar altında hücre tepkisini çözen büyük ölçekli deneylerin süpernatantı ile hızlandırılmış görüntüleme sırasında hücrelerin bozulması gibi yeni çalışmalar yapmalarını sağlar¹⁷. Pikolitre biyoreaktör, araştırmacılara biyofiziksel koşulları sıkı bir şekilde kontrol eden ve hızlandırılmış görüntüleme için yüksek hassasiyetli şırınga pompaları ve otomatik parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılarak çalıştırılan sağlam bir sistem sağlar. Burada, cihaz tasarımı, üretimi ve örnek uygulamalar dahil olmak üzere eksiksiz bir protokolü rapor ediyoruz.

Protokol

1. Gofret İmalatı

1. CAD yazılımı kullanarak girişleri, çıkışları, ana kanalları ve PLBR'leri (Şekil 1A) içeren mikroakışkan cihazı tasarlayın.
2. Bu protokolde sunulan tasarım (Şekil 2), iki tohumlama girişi, iki farklı substratın karıştırılması için bir gradyan jeneratörü, bir çıkış ve altı PLBR dizisinden oluşur. Her dizi 5 PLBR içerir, bu da bir mikroakışkan cihaz içinde 30 paralel PLBR ile sonuçlanır.
3. İstenen çip düzenlerini içeren bir litografi fotoğraf maskesi oluşturun (Şekil 1B). Fotomaske, mikron altı çözünürlükte elektron ışını yazımı ile şirket içinde üretildi. Kullanılan maske, 5'i² arada cam plaka üzerinde bir krom tabakadan oluşuyordu.
   Not: Aşağıdaki tüm adımları temiz oda sınıfı 100 veya daha iyisi koşullar altında gerçekleştirin (Şekil 3A ve 3B'de bir proses akış şeması gösterilmiştir).
4. 4 inç silikon gofreti piranha (10:1 oranında sülfürik asit ve hidrojen peroksit) ve hidroflorik asit ile birkaç dakika temizleyin (Dikkat: tehlikeli kimyasallar). Deiyonize (DI) su ile yaklaşık 10 saniye durulayın.
5. Gofretleri 200 °C'de 20 dakika kurutun.
6. Gofret üzerine 1 μm SU-8 2000.5 fotorezist sıkın (1. katman) (4 ml direnç, 10 saniye sıkma, v = 500 rpm ve a = 100 rpm/sn, v = 1.000 rpm ve a = 300 rpm/sn ile 30 saniye sıkma).
7. Fazla solventi çıkarmak için kaplanmış gofreti 95 °C'de bir ocak gözüne yerleştirin (65 °C'de 1,5 dakika, 95 °C'de 1,5 dakika ve 65 °C'de 1 dakika; ideal olarak iki ocak gözü kullanın).
8. 1. katman fotomaskeyi (burada pikolitre reaktörlerinin yakalama bölgeleri) ve gofreti maske hizalayıcının içine yerleştirin ve gofreti 350-400 nm'ye maruz bırakın (vakum teması, 64 mJ/cm², t = 3 sn, I = 7 mW/cm²).
9. SU-8'in polimerizasyonunu başlatmak için 95 °C'de bir ocak gözü üzerinde maruz kalma sonrası pişirme yapın (65 °C'de 1 dakika, 95 °C'de 1 dakika ve 65 °C'de 1 dakika). Not: Bu adımdan sonra SU-8 katmanındaki yapılar görülebilir.
10. Gofret'i 1 dakika boyunca bir SU-8 geliştirici banyosuna yerleştirin ve gofreti birkaç saniye boyunca taze SU-8 geliştirici içeren ikinci bir kaba aktarın.
11. SU-8 geliştiricisini çıkarmak için gofreti izopropanol içinde durulayın ve gofret döndürücünün nitrojen akışını kullanarak gofretleri kurutun.
12. Gofretleri 150 °C'de 10 dakika sert bir şekilde pişirin.
13. Gofret üzerine 9 μm SU-8 2010 fotorezist sıkın (2. katman) (4ml direnç dağıtın, v = 500 rpm ile 10 saniye sıkın, a = 100 rpm/sn ve v = 4.000 rpm ile 30 saniye sıkın, a = 300 rpm/sn).
14. Fazla çözücüyü çıkarmak için SU-8'li gofreti 95 °C'de bir ocak gözüne yerleştirin (65 °C'de 15 dakika, 95 °C'de 45-60 dakika ve 65 °C'de 10 dakika). Not: kırışıklıklara ve kabarcıklara dikkat edilmelidir. Gofret 95 °C'ye kadar ısıtılırsa, buharlaşan çözücü küçük gaz kabarcıkları içinde kapsüllenebilir.
15. İstenilen düzende fotoğraf maskesini (burada besin temini için ana kanallar) ve gofreti maske hizalayıcısına yerleştirin ve 350-400 nm'ye maruz bırakın (sert temas, 64 mJ/cm², t = 10 sn, I = 7 mW/cm²)
16. SU-8'in polimerizasyonunu sonlandırmak için 95 °C'de bir ocak gözü üzerinde maruz kalma sonrası pişirme yapın (65 °C'de 5 dakika, 95 °C'de 3:30 dakika, 65 °C'de 3 dakika). Not: Bu adımdan sonra SU-8 katmanındaki yapılar görülebilir.
17. Gofreti 45 saniye boyunca bir SU-8 geliştirici banyosuna yerleştirin, gofreti taze SU-8 geliştirici içeren ikinci bir kaba aktarın ve 60 saniye boyunca geliştirin.
18. Herhangi bir SU-8 geliştirici kalıntısını gidermek için gofreti 20 saniye izopropanol ile durulayın ve gofreti basınçlı nitrojen kullanarak kurutun.
19. Son olarak, gofreti 150 °C'de sert bir şekilde pişirin. Sonuç olarak, PDMS kalıplama için ana kalıp olarak kullanılacak olan nihai gofret (Şekil 1C) elde edilir.
20. SU-3 yapı yüksekliklerini doğrulamak için profilometre ölçümleri yapın (Şekil 8C). Not: Yapı yüksekliğindeki yanlışlıklar, yetiştirme sırasında verimsiz hücre tuzağına veya hücre kaybına neden olabilir.

2. Polidimetilsiloksan Çip İmalatı

Not: Toz parçacıklarının üretim prosedürüne müdahale etmesini önlemek için aşağıdaki tüm adımlar ideal olarak laminer akış koşulları altında gerçekleştirilmelidir (Şekil 4'te bir proses akış şeması gösterilmiştir).

1. 10:1 oranında polidimetilsiloksan (PDMS) bazı ve kürleme maddesi karışımı hazırlayın. Opak görünen homojen bir çözelti elde edilene kadar dikkatlice karıştırın. İstenilen katman yüksekliği için gerektiği kadar hazırlayın (burada 3 mm).
2. PDMS karışımını, tüm kabarcıklar kaybolana kadar hafif vakum altında yaklaşık 30 dakika boyunca gazdan arındırın.
3. Kalıplama cihazını (veya Petri kabını) uygun SU-8 gofret ile hazırlayın ve PDMS karışımını içine dökün (Şekil 1D).
4. PDMS'yi fırında 80 °C'de 3 saat pişirin.
5. PDMS levhasını gofretten dikkatlice soyun. Temiz ve keskin bir neşter kullanarak levhayı tek talaşlar halinde kesin.
6. Cipsleri 90 dakika boyunca bir n-pentan banyosunda yıkayın, ardından iki aseton yıkama banyosu yapın (her biri 90 dakika). Herhangi bir solvent kalıntısını gidermek için cipsleri gece boyunca kurutun. Dikkat: PDMS yıkamasını çeker ocak altında gerçekleştirin. Not: N-pentan yıkama sırasında, monomerler ve dimerler kürlenmiş PDMS'den çıkarılır ve yıkama işlemi sırasında talaş boyutu geçici olarak iki katına çıkabilir.
7. Mikroakışkan PDMS çiplerini son deneye kadar kapalı kaplarda saklayın.
8. Deneyden hemen önce, boruları PDMS çipine bağlamak için kullanılan konektörlerden biraz daha küçük çaplı bir iğne (veya delgeç) kullanarak giriş ve çıkış deliklerini PDMS çipine delin
.
9. Mikroakışkan PDMS çipini izopropanol ile dikkatlice temizleyin ve yapılandırılmış PDMS tarafına yapışabilecek toz parçacıklarını çıkarmak için bant kullanın. Çip üzerinde hiçbir parçacık görülmeyene kadar bantı birkaç kez kullanın.
10. 170 μm inceliğinde bir cam slaytı aseton ve izopropanol ile art arda temizleyin. Son olarak deiyonize su ile temizleyin ve basınçlı nitrojen ile kurulayın.
11. Plazma aktivasyonundan önce, plazma temizleyiciyi ısıtın ve plazmayı yaklaşık 300 saniye çalıştırın. Plazma oksitlenmiş cam sürgü ve PDMS çipi (Güç 50 W, Zaman = 25 sn, oksijen akış hızı = 20 sccm).
12. Yapıştırmadan önce PDMS'yi ve cam çipi hizalayın. Son olarak, PDMS çipini dikkatli bir şekilde cam sürgünün üzerine yerleştirin (Şekil 1E). PDMS ve cam saniyeler içinde yapışacaktır. Not: Yapıştırma işlemi sırasında PDMS çipinin üstüne cımbızla itmeyin. Bu, kanalların ve küçük yapıların çatısının çökmesine neden olabilir.
13. Bağı güçlendirmek için, son PDMS cam yongasını 80 °C'de 10 saniye pişirin.

3. Bakteri Kültürünün Hazırlanması

Not: Tüm yetiştiricilikler, yetiştirme sırasında müdahale edebilecek istenmeyen parçacıkların birikmesini önlemek için steril filtrelenmiş ortamda hazırlanmalıdır.

1. İstenen organizmaları içeren bir agar plakası kullanın (burada, C. glutamicum ATCC 13032) ve bir koloniyi 20 ml taze BHI ortamına aşılayın, gece boyunca (≈ 8-14 saat) 30 °C'de döner bir çalkalayıcı (120 rpm) üzerinde inkübe edin.
2. 10 μl ön kültürü, mikroakışkan kültivasyon sırasında kullanılacak olan istenen ortama (burada CGXII²¹) aktarın ve hücrenin döner bir çalkalayıcı (120 rpm) üzerinde 30 ° C'de gece boyunca büyümesine izin verin.
3. İstenilen miktarda hücre süspansiyonunu (deneyin başlangıcına bağlı olarak 10-500 μl arasında) mikroakışkan hücre ekimi sırasında kullanılacak olan istenen ortama (burada CGXII²¹) aktarın. Not: En iyisi, tohumlama için erken logaritmik fazdaki hücreleri kullanmaktır. C. glutamicum kültürü için tohumlama için en iyi optik yoğunluk (OD₆₀₀) 0.5-2 arasındaydı.
4. 1 ml bakteri kültürünü 2 ml'lik steril bir tüpe aktarın. Not: Bu, çalkalama şişesi ve mikroakışkan yetiştirme arasındaki transfer süresini en aza indirmek için mikroakışkan PDMS çipi monte edildikten hemen sonra yapılmalıdır. Tipik olarak transfer süresi yaklaşık 15 dakikadır ve oksijen sınırlaması ve sıcaklık değişikliklerinin neden olduğu metabolizma üzerindeki etkiyi önlemek için mümkün olduğunca küçük tutulmalıdır.

4. Deney Düzeneği

Not: Tüm adımlar ters çevrilmiş bir mikroskopla gerçekleştirilir.

1. Sistemi ısıtmak için deneyden 2 saat önce mikroskop inkübatörünü başlatın. Not: mikroskopi, sıcaklığı ve istenirse gaz akışını kontrol etmek için tam boyutlu bir inkübatör ile donatılmalıdır. Talaş sistemi sürekli olarak ortamla infüze edildiğinden ek nem kontrolü gerekli değildir.
2. İnkübatör sistemini açın, istediğiniz hedefi seçin ve gerekirse objektifin üzerine daldırma yağı ekleyin.
3. Çipi çip tutucunun içine monte edin. Gerekirse, sahne çalışması sırasında herhangi bir talaş hareketini önlemek için cam plakayı yapışkan bantla sabitleyin.
4. Numuneyi mikroskop üzerinde ortalayın ve PLBR dizilerine odaklanın.
5. Giriş ve çıkışları uygun borularla bağlayın (Şekil 1F). Boruyu bir atık rezervuarına bağlayın. Şekil 4D'de temsili bir çip görülebilir.
6. Şırıngaları pompalara yerleştirin ve ortam akışını başlatın. Orta, tampon veya gerekirse kaplama solüsyonu kullanın ve mikroakışkan kanalları yaklaşık 1 saat durulayın. Not: Kaplama solüsyonu, spesifik olmayan hücre yapışmasını önlemek için kanal duvarlarını kaplamak için kullanılır.
7. E. coli için, kanal duvarlarını kaplamak için% 0.1 BSA çözeltisi kullanılır. C. glutamicum için herhangi bir kaplamaya gerek yoktur. Kaplama işleminden sonra, hücre tohumlamadan önce çipi orta ile yıkayın.
8. Hücre tohumlama ve yetiştirmeden önce, sızıntı olmadığını ve sıcaklığın sabit olduğunu kontrol edin.

5. Bakteri Hücrelerinin Mikroakışkan Cihaza Tohumlanması

1. İstenen bakteri çözeltilerinin boruya bağlı uygun şırıngalarda mevcut olduğundan emin olun.
2. Tamponu veya kaplama çözeltisini ayırın ve hücre süspansiyonunu çipe bağlayın. Ölüm hacmini, istenmeyen hava kabarcıklarını en aza indirmek ve deney süresini azaltmak için, sadece şırıngalar yerine tüm iğneyi ve hortumu değiştirin.
3. PLBR'lerin çoğu istenen miktarda hücre ile dolana kadar hücre süspansiyonunu 200 nl/dk'lık hacimsel akış hızında kanallara infüze edin (Şekil 5A). Not: optimum tohumlama sonuçları, bakteri suşuna, OD_600'e ve ön kültürün büyüme ortamına bağlıdır. Bu parametrelerin, reaktör yapılarında yeterli sayıda hücre sıkışana kadar yakalama verimliliğini ve süresini artırmak için uyarlanması gerekir. C. glutamicum için tipik olarak OD₆₀₀ 0.5-2'lik bir hücre süspansiyonu kullanıldı; E. coli için OD₆₀₀ 0.5-1 arasındaydı.
4. Yalnızca az sayıda PLBR doldurulursa, akış hızını 800-1.200 nl/dk'ya yükseltin.
5. Hücre süspansiyonunu ayırın ve büyüme ortamını çipe bağlayın (Şekil 5B). Orta değişim sırasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olun. 100 nl/dk'da taze büyüme ortamı ile perfüz.

6. Hızlandırılmış Görüntüleme

1. Zaman atlamalı görüntüleme için belirli PLBR'leri seçin. Tipik olarak, bir deneyin başında tek bir ana hücre içeren PLBR'ler seçilir. Bir deneyde araştırılabilecek ilgi bölgelerinin sayısı, istenen kare hızına ve mikroskobik kuruluma bağlıdır.
2. PLBR sayısına bağlı olarak uygun bir kare hızı seçin. Mikroskobun zaman atlamalı aralıkta istenen miktarda ROI'yi işleyebildiğinden emin olun.
3. Uygun filtre setlerini seçin (burada YFP). Kromofor ağarmasını önlemek için sahne hareketi sırasında ve her zaman atlamalı ölçümden sonra deklanşörü otomatik olarak kapatın.
4. Hızlandırılmış mikroskopi dizisini yapılandırın ve deneyi başlatın.
5. Tüm PLBR'ler aşırı büyüdükten sonra, deney durdurulabilir, mikroakışkan PDMS çipi atılabilir ve deney değerlendirilebilir.

7. Analiz

Not: Prosedürün aşağıdaki adımları veya bölümleri manuel olarak veya ImageJ vb. gibi görüntü analiz programları tarafından gerçekleştirilebilir.

1. Yetiştiriciliğin istenen tüm kriterleri karşıladığı ilgili PLBR'leri belirleyin, örneğin ana hücre sayısı, ana hücrelerin konumu vb.
2. Bir mikrokoloninin büyüme hızını belirlemek için, her zaman dilimindeki hücre sayısını sayın.
3. Zamanı ve ln'yi (hücre sayısı) çizerek maksimum büyüme oranını hesaplayın. Grafiğin eğimi [1/saat]'teki büyüme oranını temsil eder (bkz. Şekil 6).
4. Floresan veri analizi büyük ölçüde gerçekleştirilen deneye bağlıdır. Bu raporda, farklı izojenik mikrokoloniler arasındaki koloniden koloniye ve hücreden hücreye heterojenliği göstermek için bir örnek seçilmiştir (bkz. Şekil 7).

Sonuçlar

Cihaz İmalatı

Mikroakışkan PLBR sistemi, yüksek çözünürlüklü mikroskopi için uygun olan ince bir cam çip üzerine bağlanmış bir PDMS tabakası ile üretilir. İmalat iki ana adımdan oluşur: birincisi replikasyon master'ının imalatı (Şekil 1A, 1B ve 1C) ve ikincisi çip imalatı (Şekil 1D, 1E ve 1F). Protokole göre, ana kalıbı oluşturmak için standart fotolitografik mikrofabrikasyon teknikleri kullanılır. Temiz oda tesisi olmayan laboratuvarlar, ticari olarak temin edilebilen özelleştirilmiş SU-8 ana kalıpları edinebilir. Tekrarlayan PDMS kalıplama (Şekil 1A, 1B ve 1C) kullanılarak yüzlerce tek kullanımlık çip üretilebilir. PDMS kalıplama ve talaş montajı herhangi bir laboratuvarda yapılabilir ve temiz oda olanakları gerektirmez, ancak laminer hava akışlı çalışma alanları uygundur.

Süreç, mikroakışkan çip sisteminin tasarımıyla başlar. Tipik olarak, mikroakışkan çipi tasarlamak için CAD yazılımı kullanılır (Şekil 1A). CAD'den sonra, mikron altı çözünürlüğe sahip bir e-ışın yazıcısı (Şekil 1B) tarafından bir maske oluşturulur. Bu çalışmada, SU-8 wafer litografisi için kullanılan 5 inç krom maskesi oluşturulmuştur. Son silikon—SU—8 gofret, PDMS kalıplama için kullanılır (Şekil 1D). Bir pişirme adımından sonra, PDMS levhası, cam slaytlara geri dönüşü olmayan bir şekilde bağlanan talaşlar halinde kesilir (Şekil 1E). Son olarak, boru bağlanır (Şekil 1F).

Şekil 2, mikroakışkan sistemin tasarımını ayrıntılı olarak göstermektedir. İki tohumlama girişi, farklı substratların veya ortamların karıştırılması için bir gradyan jeneratörü ve bir çıkıştan oluşur. Ana kanalların boyutu 50 μm x 10 μm (G x Y). Her cihaz, her biri 5 PLBR içeren altı PLBR dizisinden oluşur. Bu, bir mikroakışkan cihaz içinde 30 paralelleştirilmiş reaktör ile sonuçlanır.

Şekil 3, replikasyon ana üretimini göstermektedir. Protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, ilk SU-8 katmanı, SU-8 litografisi ile üretilir (Şekil 3A). İkinci katman için de benzer bir prosedür uygulanır (Şekil 3B). Kanal geometrisini kontrol etmek için bir profilometre kullanarak PLBR'lerin ve ana kanalların yüksekliğini araştırdık. Şekil 3C'de gösterilen örnekte, ilk katman (yetiştirme katmanı) ölçülmüştür. Burada katman, BHI ortamında C. glutamicum yetiştiriciliği için uygun olan 1.200 nm'lik tutarlı bir yükseklik gösterir.

Şekil 4, PDMS karıştırma ile başlayan PDMS kalıplama prosedürünü (Şekil 4A), ardından kalıplama işlemini (Şekil 4B) ve son olarak yapıştırma adımını (Şekil 4C) göstermektedir. Şekil 4D, 170 μm kalınlığında cam plakayı, giriş ve çıkışları olan PDMS çipini (3 mm yüksekliğinde) ve boruya bağlı çelik iğneleri içeren son mikroakışkan çipi göstermektedir. Deneyden sonra çip atılabilir ve kapsamlı bir temizlik gerekmez. Ayrıca, montajı ve kullanımı kolaydır. Karmaşık ve zor bir dolgu işlemine gerek yoktur.

Cihaz Prensibi

Şekil 5, reaktör sisteminin çalışma prensibini göstermektedir. Hücreler mikroakışkan cihaza infüze edilir ve tek tek hücreler, sadece hücre-duvar etkileşimleri ile PLBR'nin içinde sıkışıp kalır. Kanal ve PLBR'nin hidrodinamik direncindeki farklılık nedeniyle, PLBR içinde sadece minimum akış meydana gelir. PLBR'nin tohumlanmasından sonra (Şekil 5A), bakteri çözeltisinden büyüme ortamına geçişle büyüme ve gözlem aşaması başlatılır (Şekil 5B). PLBR'ler aşırı büyüdükten sonra (Şekil 5C), deney tipik olarak durdurulur ve hızlandırılmış görüntüler analiz edilebilir. PLBR içindeki yakalama mekanizmaları ve akış profili için okuyucu Grünberger ve diğerlerine yönlendirilir.Daha fazla ayrıntı için ¹³.

Büyüme Oranı Analizi

Mevcut sistem, büyüme, morfoloji veya floresan sinyali gibi farklı biyolojik parametrelere göre çeşitli bakteri türlerini incelemek için uygulanabilir. İlk örnekte, endüstriyel olarak ilgili bir üretim organizması olan C. glutamicum, standart yetiştirme koşulları altında (T = 30 ° C, CGXII ortamı²¹) kültürlenmiştir. Şekil 6A, üç izojenik mikrokoloniden türetilen büyüme eğrilerini göstermektedir. PLBR'ler dolana kadar üstel büyüme sürdürülür, bu da herhangi bir besin sınırlamasının meydana gelmediğini gösterir. Şekil 6B, büyüyen bir C. glutamicum kolonisinin dört DIC hızlandırılmış mikroskopi görüntüsünü göstermektedir.

Floresan Analizi

Tek hücreli floresan mikroskobu için, araştırmacılar genellikle belirli bir fenotipi ölçülebilir bir çıktıya (bir floresan sinyali) bağlamak için GFP veya türevleri gibi spesifik floresan proteinleri kullanırlar. PBLR'nin floresan tabanlı hızlandırılmış çalışmalar için uygulanabilirliğini göstermek için, Ptac promotörü (pEKEx2-yfp-tetR) kontrolü altında plazmid kodlu bir YFP-TetR füzyon proteini üreten bir C. glutamicum suşunun floresan emisyonunu araştırdık18,22. Düşük indükleyici (IPTG) konsantrasyonlarının varlığında, Ptac'den gelen ekspresyonun, izojenik bakteri popülasyonlarında hücreden hücreye önemli varyasyona yol açtığı bilinmektedir. Bir ön kültürden başlayarak, birkaç izojenik mikrokoloni için büyüme ve tek hücreli floresan takip edildi. Şekil 7'de görüldüğü gibi, farklı mikrokoloniler arasında fenotipik heterojenlik ve tek ana hücreden başlayarak koloniler içinde tek hücre düzeyinde heterojenite gözlemledik. Bir koloni (Şekil 7B, PLBR 1) neredeyse hiç floresan emisyonu göstermezken, PLBR 2 hücreleri, Ptac promotöründen bazal yfp-tetR ekspresyonu nedeniyle düşük bir floresan emisyonu sergiledi. PLBR 3'te floresan emisyonu diğer kolonilere kıyasla oldukça güçlüydü ve popülasyonun geniş bir dağılımı gözlendi. Bu örnek, PBLR'nin hızlandırılmış floresan mikroskobu çalışmaları için uygulanabilirliğini göstermektedir. Tek hücrelerin floresansının tek bir zaman noktasında belirlenebildiği akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında, mevcut sistemler hücrelerin izlenmesine ve tek hücreli floresansın birçok nesil boyunca gerçek zamanlı olarak incelenmesine izin verir.

Şekil 1.PLBR çip üretim sürecine genel bakış. Ana kalıp imalatı: (A) Tasarım, (B) Litografi maske imalatı ve (C) Gofret üretimi ile başlar. PDMS-cam çip üretimi: (D) PDMS kalıplama ile başlar, ardından (E) cam ve PDMS yapıştırma ve (F) son çip montajı.

Şekil 2. PLBR çipinin tasarımı. (A) Tüm mikroakışkan çipin CAD çizimi; (B) Seçilen yerleşim konumlarının büyütülmesi: Düzen, iki orta giriş (a1), karıştırma kanallarına sahip bir gradyan üreteci (a2) ve 6 paralel PLBR dizisi (b1) içerir. b2, 100 μm genişliğinde bir sıvı kanalına gömülü bir PLBR'yi gösterir. PLBR'nin iç çapı 40 μm'dir ve besin kanalları 2 μm'dir. Tohumlama girişinin uzunluğu 40 μm'dir. Pembe renk ilk katmanı (yakalama ve yetiştirme bölgesi) ve mavi renk ikinci katmanı (sıvı taşınması) temsil eder.

Şekil 3.İki katmanlı gofret üretim sürecinin çizimi. (A) Bindirme yapılarını içeren ilk katmanın imalatı; (B) Akışkan kanalları, girişleri ve çıkışları içeren ikinci katmanın imalatı; (C) İlk katmanın temsili yüzey profilleri. Bu durumda, ilk katmanın yüksekliği 1.200 nm idi ve C. glutamicum'un karmaşık ortamda yetiştirilmesi için kullanıldı.

Şekil 4.Cihaz imalatı ve temsili çip. PDMS kalıplama işleminin gösterimi: (A) PDMS karıştırma ve gaz giderme; (B) PDMS kalıplama; (C) kalıp ayırma, kesme ve talaş yapıştırma. Son çip (Royal Society of Chemistry^13'ün izniyle çoğaltılmıştır): (D) 2 girişli ve 1 çıkışlı PDMS çipinin fotoğrafı; (E) Her biri 5 PLBR içeren altı paralel dizinin CAD görüntüsü; (F) Bir PLBR'nin SEM görüntüsü.

Şekil 5. PLBR sisteminin çalışma prensibi. (A) Tohumlama aşaması; (B) Bakteri mikrokolonilerinin büyüme evresi; (C) Taşma aşaması. Royal Society of Chemistry'nin izniyle çoğaltılmıştır13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Şekil 6.C. glutamicum WT mikrokolonilerinin büyüme hızının belirlenmesi. (A) Üç PLBR yetiştiriciliğinin büyüme grafiği ve bunun sonucunda ortaya çıkan üstel eğriler (Kraliyet Kimya Derneği'nin izniyle çoğaltılan parçalar)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Büyüyen bir C. glutamicum kolonisinin hızlandırılmış görüntüleri.

Şekil 7. Popülasyon heterojenliğinin PBLR tabanlı analizi. Gösterilen, indükleyici IPTG'nin yokluğunda Ptac promotörü (pEKEx2-yfp-tetR) kontrolü altında bir yfp-tetR füzyonunu eksprese eden C. glutamicum'dur. (A) Deneysel iş akışı; (B) Koloniden koloniye heterojenlik ve hücreden hücreye heterojenlik gösteren üç izojenik mikrokoloni; (C) Tek hücreli floresansın ilgili mikrokoloniler içindeki dağılımı.

Şekil 8. Farklı PLBR'lerin taramalı elektron görüntüleri. Tuzak verimliliğinin optimizasyonu için tohumlama girişlerini gösteren SEM görüntüleri. (A) Daha küçük tohumlama girişleri (B) Daha küçük tohumlama girişleri (C) Daha büyük "açık" tohumlama girişleri (D) İki tohumlama girişi.

kadar

adım	sorun	Olası neden:	çözüm
Gofret İmalatı	Yumuşak pişirme sırasında SU-8'de sıkışan hava kabarcıkları	Sıcaklığın hızlı bir şekilde artması	95 °C ve 65 °C'de birkaç kez pişirin
Gofret İmalatı	Kaybolan ve kırılan SU-8 yapıları	Optimal imalat prosedürü değil; SU-8 yapılarında mekanik gerilme	Pişirme süresi, maruz kalma süresi gibi parametreleri optimize edin
Gofret İmalatı	SU-8 katmanlarından düşük veya yüksek veya düzensiz katman kalınlığına	Sıkma kaplama sırasında sorun	Sıkma kaplayıcı parametrelerini ve gofret aynasını kontrol edin
Talaş Yapıştırma ve Montaj	Çöken PLBR'ler	PDMS bağlama parametreleri optimal değil	Gücü, plazma maruz kalma süresini ayarlayın. ve yapıştırmadan sonra pişirme süresi
Talaş Bağlama ve Montaj	PLBR'lerdeki kirli yapılar ve partiküller	Çip düzgün temizlenmedi	Yüzey temizliği için scotch-tape uygulayın
Talaş Bağlama ve Montaj	Yetersiz PDMS-cam yapıştırma	Yapıştırma parametreleri optimal değil veya yetersiz temizlik	Oksijen plazmasının ayarlarını kontrol edin
Mikroakışkan Deneyi	Sıvı sızıntısı	Giriş/çıkış deliği düzgün şekilde delinmemiş	Delik delme işlemini optimize edin
Mikroakışkan Deneyi	Doldurma sırasında birçok küçük PDMS parçacığı	Delik düzgün bir şekilde delinmedi	Delik delme işlemini optimize edin
Mikroakışkan Deney, Biyolojik Yön	Hücre büyümesi yok	Temizleme prosedüründen kaynaklanan solvent kalıntısı	Hücre yüklemesinden önce talaşı daha kapsamlı bir şekilde yıkayın veya yapıştırmadan önce çözücünün buharlaşmasına izin verin
Mikroakışkan Deneyi, Biyolojik Yönü	Değişen büyüme oranları	Çeşitli nedenler	Ön kültürü ve sıcaklığı kontrol edin
Mikroakışkan Deneyi, Biyolojik Yönü	Yetiştirme sırasında hücre morfolojisi değişiklikleri	Besin sınırlamaları veya sıcaklık kayması	İnkübatörü ve akışı kontrol edin
Mikroakışkan Deneyi, Teknik Yönü	Zaman atlamalı mikroskopi sırasında pozisyonda kayma	Sıcaklık dalgalanmaları	Salınım olmayana kadar önceki deneylerde sıcaklık profilini kontrol edin
Mikroakışkan Deneyi, Teknik Yönü	Yetiştirme sırasında hücre kaybı	Biraz ila yüksek reaktör yüksekliği	Reaktör yüksekliğini optimize edin
Mikroakışkan Deneyi, Teknik Yönü	Bindirme yok	Çok düşük reaktör yüksekliği	Reaktör yüksekliğini optimize edin

Tablo 1. Sorun Giderme. Bu tablo, deneysel çalışma sırasında kritik yönleri, yaygın hataları ve olası çözümleri özetlemektedir.

Tartışma

Bakterilerin tek hücreli analizi için birkaç (PLBR) içeren bir mikroakışkan PDMS cihazının imalatını, deney kurulumunu ve ilgili çalışma prosedürlerini açıkladık.

Yumuşak litografi tekniklerini kullanan mikrofabrikasyon, çeşitli boyutlar ve bakteri morfolojileri için cihaz boyutlarının hızlı bir şekilde ayarlanmasına olanak tanır. Şu anda pikolitre biyoreaktörünü farklı mikrobiyal organizmaların yetiştirilmesi ve yetiştirme verimi ile ilgili olarak optimize ediyoruz. Yakalama verimliliğini artırmak için reaktör geometrisi de optimize edilmektedir. Şekil 8 , şu anda doğrulanmış olan dört yeni PLBR cihazını göstermektedir. Tüm şekillerde tohumlama kanalı genişlik ve şekil açısından yeniden tasarlandı. Uygulamada, bunun sıkışan hücre sayısı üzerinde bir etkisi var gibi görünüyor, ancak daha fazla araştırmaya ihtiyaç var. Reaktör boyunca daha yüksek konveksiyonel akışa ve daha fazla hücrenin sıkışmasına yol açan ek taşma kanallarının dahil edilmesiyle yakalama verimliliğine ilişkin önemli iyileştirmeler de sağlandı. Bununla birlikte, aynı zamanda, yetiştirme sırasında hücrelerin yıkanması riskini de artırır.

Cihaz, tek hücre düzeyinde büyüme ve üretim süreçlerini araştırmak için onlarca yıldır kullanılan makro ölçekli ekimlere ilginç bir alternatiftir. Bununla birlikte, bazı önemli gereksinimleri vardır: Birkaç pikolitre biyoreaktörünün paralel izlenmesi için, odak kayması kompanzasyonu ile yüksek çözünürlüklü ve tam motorlu mikroskobik kurulum zorunludur. Ek olarak, ölçümler boyunca istenen yetiştirme sıcaklığını sabit tutmak için bir inkübasyon sistemine ihtiyaç vardır.

Cihaz imalatında %95 başarı oranı elde ediyoruz. Ana sorunlar, verimsiz PDMS-cam yapıştırma, PDMS çatı çökmesi veya sıvı sızıntısı ile ilgilidir (en çok ortaya çıkan sorunların giderilmesi için Tablo 1'e bakın). Deneysel çalışma kısmen steril olmayan koşullar altında yapılsa da, kapalı akışkan sistem nedeniyle deneyler sırasında nadiren kontaminasyon görüyoruz. PDMS mikroakışkan cihazları optik olarak şeffaftır, bu nedenle yüksek çözünürlüklü in vivo görüntüleme için kullanılabilir. PDMS uygulama için mükemmel gibi görünse de, hidrofobik moleküller için yüksek bir afiniteye sahiptir ve bu da tüm hücre biyokatalitik işlemlerinde yaygın olarak kullanılan çözücülerin kullanımını sınırlı hale getirir. Bununla birlikte, protokolü bu tür uygulamalara uyarlamak için uygun kaplamalar mevcuttur.

Önerilen PLBR, çeşitli bakteri türlerinin hücresel ve hatta hücre altı olaylarının uzay-zamansal analizi için çok uygundur. Mevcut yaklaşımın önemli bir avantajı, geleneksel yöntemlerin aksine mikrokoloni büyümesini doğrudan ölçme yeteneğinde yatmaktadır. Ayrıca PLBR, tanımlanmış ve sabit koşullar altında kültürlemeye izin verir. Sistem, az miktarda reaktif veya malzemenin kullanımını kolaylaştırdığından, ucuz, özelleştirilebilir ve yüksek verime uygun olma avantajlarını taşır. Geleneksel yöntemlerde, mikrobiyal yetiştirme analiz edilirken tüm popülasyonun ortalama değerleri dikkate alınır. Ayrıca, mevcut yöntemler, numunelerin bozulmasına ve dolayısıyla ölçümde hatalara yol açabilecek manuel numune almaya ihtiyaç duyar. PLBR, mikrobiyolojide biyoproses geliştirme ve popülasyon heterojenlik analizi için yeni bakış açıları sunar. PLBR, biyoproses geliştirme içindeki çeşitli uygulamalar için umut verici bir araçtır ve hücreden hücreye heterojenliğin analizi, hücre soyları içindeki spesifik hücre kümelerinin analizi, mikrobiyal üretim suşlarının taranması ve hücre fenotiplerinin gerçek zamanlı araştırılması gibi çeşitli araştırma alanlarında uygulanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Silikon gofret 100 mm çapında, P/BOR < 100>	Si-MAT, Silikon Malzemeler, Almanya
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Almanya
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Almanya
SU-8 Geliştirici mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Almanya
Polidimetilsiloksan (PDMS) Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti	Dow Corning; Farnell GmbH, Almanya
Dağıtım iğneleri Hassas uçlar  27 g; İç çap = 0,2 mm, dış çap = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Almanya
Cam plakalar D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Almanya
Delgeç AKA 5130-B-90	Harris Tek Damarlı
Boru Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain; VWR International GmbH, Almanya
Tek Kullanımlık Şırıngalar – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Almanya	552-183143
Şırıngalar, 1 ml steril cam şırıngalar	YENİLİKÇİ LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Almanya
Chemicals
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
Urea	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
MgSO4&boğa; 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
Biotin	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
Prokatechuic asit	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
Glikoz-Monohidrat	Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya
BHI	Becton, Dickinson
CellsCorynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Almanya
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Almanya
Ekipman
Gofret Temizleyici SSEC 3300	Katı Hal Ekipmanları LLC
Spin Kaplayıcı SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Maske Hizalayıcı MA-6	Karl Suess
Sıcak Plaka HP30A - 2	Torrey Pines Bilimsel Laboratuvar
fırını Memmert UN 200	Memmert
Plazma Temizleyici FEMTO	Diener Elektronik, Almanya
neMESYS şırınga pompaları	Cetoni GmbH, Almanya
Manyetik karıştırıcı CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Mikroskop Nikon Eclipse Ti	Nikon Mikroskopi
Mikroskop inkübüatörü	Pecon GmbH, Almanya
Santrifüj minispin plus " siyah çizgi"	Eppendorf	9776501
Fotometre Biyofotometre plus	Eppendorf	6132000008
Çalkalayıcı şişeleyici/inkübatör 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Almanya
Profilometre, Dektak 150 Stylus Profil Oluşturucu	Veeco