Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Özet

Bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) yöntemi daha önce ışık mikroskobu (LM) tarafından seçilen hücrelerdeki görüntü virüs kaynaklı hücre içi yapılar elektron mikroskobu (EM) yoluyla uygulanır. LM ve EM virüs ana bilgisayar etkileşimlerin tümleşik bir görünüm elde etmek için hibrid görüntüleme yaklaştıkça birleştirilir.

Özet

Yüksek çözünürlüğü nedeniyle, elektron mikroskobu (EM) tavsiyesine için vazgeçilmez bir araçtır. Ancak, bir virüs bulaşmış veya transfected hücre EM ile analiz ederken ana zorluklar enfeksiyon veya bu hücreler incelenmesi engelleyen transfection, düşük verimleri vardır. Bu zorluk üstesinden gelmek için ışık mikroskobu (LM) ilk enfekte veya transfected hücre subpopulation ayırmak için gerçekleştirilebilir. Böylece, floresan proteinler (FPs) kullanımı yararlanarak için viral proteinler erimiş, LM burada "pozitif transfected" hücre konumları kaydetmek için bir FP ifade ve bir destek alfasayısal bir deseni üzerinde büyüyen kullanılır. Daha sonra hücreleri daha fazla EM için (HPF) buz gibi yüksek basınç işlenmesi, ikame (FS) ve reçine katıştırma dondur. Ultra hızlı dondurucu adım sonra ultrastructural düzeyinde iletim elektron mikroskobu (TEM) tarafından analiz edilebilir seçili hücrelerin mükemmel membran koruma sağlar. Burada, numune hazırlama, görüntüleme ve korelasyon ayrıntılı olarak açıklayan adım adım bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) iş akışı sağlanır. Deneysel tasarım birçok hücre biyoloji soruları gidermek uygulayabilirsiniz.

Giriş

Belirli bir biyolojik süreç daha iyi bir resim elde etmek için iki mikroskobu yöntemleri birleştirerek fikri oldukça eskidir. Böylece, ilk çalışma "bağdaşık mikroskopi" kullanarak virüsler hakkında iki ayrı yayınları^1,2olarak 1960 yılında yayımlandı. Bu çalışmada yazarlar tarafından adenovirüse bakın iki mikroskobu teknikleri ile indüklenen çekirdeği morfolojisi değişimler analiz. İlk yayında adenovirus enfeksiyonu ile ilişkili morfolojik ayrıntıları açıklayan elektron mikroskobu (EM) gözlemler bildirilen¹vardı. İkinci bir yayında EM tarafından gözlenen farklı yapıları ışık mikroskobu (LM) görüntüleri daha önce EM²tarafından gözlenen yapıları doğası tanımlamak için histochemical boyama desenleri ile ilişkili.

Erken bu çalışmalarda, ancak, gözlemlerinde bağımsız deneyler hazırlanan farklı enfekte hücreleri kullanılarak yapıldı. "İlişki" gerçekten de, iki görüntüleme yöntemleri gelen bilgileri birleşimi olarak farklı deneyleri ile belirli bir biyolojik anlamak için elde edilmiştir tüm bulguları karşılaştırarak bir belirli fenomeni anlamaya içindi işlem.

Günümüzde, terim bağdaşık mikroskobu, olarak da bilinen bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), ile ortak yöntemleri (gözden başvuruları^3,4,5' te), giderek artan sayıda uygulanır Her iki görüntüleme teknikleri (LM ve EM) aynı örnek üzerinde yapılmaktadır ki. Her iki yöntem kombinasyonu, böylece, bu örnek³bir multi-modal, çok ölçekli ve çok boyutlu analiz sonuçları. LM bir protein veya proteinler türdeş olmayan hücre nüfus içinde ilgi ifade hücre altgrupları tanımlamasını sağlayan birçok farklı hücre, geniş bir bakış sağlamak gibi avantajları vardır. EM LM, belirli bir hücre içi olay bir yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayan çözünürlük sınırının üstesinden gelir. Ayrıca, EM floresan hücre altı içeriğinin tüm bağlı membran organelleri, büyük makromoleküllerin kompleksleri (Örneğin, ribozom, centrioles, vb) ve hücre iskeleti elemanları, böylece gibi görselleştirme sağlar sözde "boşluk" başvuru"⁶, ek mekansal bilgi sağlamak ve bağlam LM tarafından algılanan floresan noktaya.

Son yıllarda, CLEM sadece hücre biyologları⁵için aynı zamanda (başvuru⁷' gözden) tavsiyesine için güçlü bir araç haline gelmiştir başarılı virüs yayma kurşun karmaşık virüs-hücre etkileşimleri anlamaya istekli. Böylece, nasıl virüsler hücre ve organelleri kendi çıkarları için değiştirmek anlama patojenik virüsleri ortadan kaldırmak için antiviral ilaçlar geliştirmek için gerekli olduğunu.

Burada, CLEM yöntemi algılanmasını sağlayan LM viral proteinler floresan bir protein (FP) erimiş ifade hücre tarafından açıklanmıştır. Bu hücreler daha sonra soguk immobilize ve daha fazla ultrastructural analiz üzerinden iletim elektron mikroskobu (TEM) nasıl bu proteinler ifade yeniden düzenlemek hücre içi membranlar (Şekil 1) içine yeni ilgili bilgi sahibi olmak için hazırlanmış. CLEM tarihi^{8,9,10,11,12,13}için^{,14 yayınlandı Viroloji çalışmaların en kimyasal olarak sabit hücreleri ile sahne aldı ,15,16,17,18,19}. Bu esas olarak seviye-2 ve cryo-immobilizasyon hücre genellikle mümkün olmadığı-3 (BSL-2 ve BSL-3) laboratuvarları, Biyogüvenlik nedenlerle bulaşıcı malzeme ihracı ihtiyacı kaynaklanmaktadır. Hücre zarları en uygun bir koruma gerektiren bu soruları için Vitrifiye (HPF) buz gibi yüksek basınç yoluyla ancak,²⁰önerilir. Bu gibi durumlarda, burada açıklanan CLEM iletişim kuralı uygulanır. İlginçtir, özellikle bulaşıcı örnekleri ile çalışırken, HPF örneğin BSL-2 ve BSL-3 laboratuvarlarda daha önce kimyasal Inaktif yapıyor örnekleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Kimyasal fiksasyonu HPF tarafından takip en azından kısmen cryo-koruma yöntemleri^21,22avantajları kar için bir olasılık birleşimidir.

Resim 1 : Hücreleri çözümlenmesi için iş akışının şematik Gösterim CLEM. Desenli Safir diskler üzerinde büyüyen hücreler ilk FPs EM için onların işlemeden önce ifade hücreleri yerelleştirmek için LM tarafından incelenir. Bir kez yer alan hücreleri hemen HPF ve FS daha sonra reçine gömmeye sabitlenir. Polimerizasyon reçine, nerede hücreleri büyüyen destek üzerine (Safir diskler =) reçine bloğundan kaldırılması gerekir. Katıştırılmış hücreleri içeren blok içinden bir elmas bıçak ile FPs, ifade kalan hücreleri kesitli küçük bir yamuk için kırpılır. Ultrathin bölümleri yuvası ızgaralar üzerinde toplanan ve daha fazla bu hücreler ultrastructural bilgilerini elde etmek için TEM tarafından incelenir. Bu rakam uyarlanmış ve izni başvuru²⁹ile değiştirilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

1. hazırlanması desenli Sapphire hücre kültürü için diskler

1. (Bkz. Tablo reçetesi) desenli Safir diskler onların yüzeyleri, birinin üzerine 15 mL konik Santrifüjü tüp içine kazınmış bir alfasayısal desen aktarabilirsiniz.
   Not: Alternatif olarak, bir başvuru desen onları Bulucu kılavuz üstünde tepe ile kaplama karbon tarafından oluşturulduğu geleneksel 0.05 mm kalın Safir diskler alfasayısal desen olmadan kullanılabilir. Karbon desen uygulanmadan önce bu amaç için onlar etanol ile temizlenmelidir.
2. Onları iyice etanol ile yıkayın. Onları dışarı bir petri filtre kağıdı ile yayıldı ve koyup kuruyuncaya kadar bırakın. Bir cam slayt üzerinde ince uzun Cımbız kullanarak birbirinden ayrı yer onları.
3. Ters bir mikroskopla (4 X büyütme) koordinatları desen Safir her disk üzerinde okunabilir durumda olup olmadığını denetleyin.
   Not: yoksa, cımbız yardımıyla Safir diskler çevir.
4. Safir diskler bir kabında saklayın.
   Not: Protokol burada duraklatılmış.

2. hücre kültürü desenli Safir diskler ile

1. Desenli Safir diskler 5 min için bir ultraviyole (UV) crosslinker ile sterilize.
2. Safir diskler hücre kültür Biyogüvenlik kabini için al. Biyogüvenlik kabini etanol uzun cımbızla sterilize.
3. Hücre kültür orta yarısını ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) bir hücre kültür yemek için. Safir diskler uzun cımbızla dikkatlice hücre kültür çanak içine aktarın.
4. Tohum 1 x 10⁵ Huh7-Lunet hücreler, hücre kültür ortamına, kültür çanak diğer yarısında resuspended T7 polimeraz stabil ifade.
   Not: deneme bitiş noktasının hücre confluency olmalıdır şekilde numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı hesaplamak değil üzerinde 20-0. Yüksek hücre yoğunluğu hücreleri tehcir EM tarafından daha sonraki aşamalarında engel olacaktır. Ayrıca, bitti-confluency Safir diskler hücrelerden dekolmanı neden olabilir.
5. Safir diskler kültür çanak alt kısmında kalır ve alfasayısal koordinatları ters mikroskopla hala okunabilir olduğunu kontrol edin.
   Not: hücre kültürü ortamında diskler float, uzun cımbız diskler yukarıdan aşağıya doğru itin ve sonunda onları geri doğru yönlendirmeye çevirmek için kullanın.
6. Hücreleri daha önce bildirilen transfection aracının üretici talimatları başvuruları^21,23 ' ertesi gün transfect.

3. LM görüntüleme desenli Safir diskler üzerinde büyüyen hücre

1. 30 – 50 µL içeren bir metal görüntüleme plaka için deneme uç noktada Safir diskler transfer / konum spesifik olmayan arka plan floresans azaltmak için pH göstergesi-Alerjik orta.
   Not: burada açıklanan metal plaka (Şekil 2) Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (EMBL) atölye olarak dizayn edilmiştir. Bu tabak ya da benzer bir yokluğunda, cam-alt hücre kültür yemekleri de bunun yerine LM için kullanılabilir. Normal hücre kültür orta orta pH göstergesi olmadan değiştirmek önemlidir. Ayrıca photobleaching, reaktif oksijen türleri (ROS) birikimi ve hücreleri^24,25fizyolojik hasar için önde gelen neden olabilir çünkü uzun pozlama süreleri kaçınılması gerektiğini unutmayın.
2. Hücreleri bir ters widefield floresan mikroskop altında görüntü.
   Not: bir yeşil flüoresan protein (GFP) kullanırken-tagged protein, temsilcisi sonuçları, 450 – 490 nm ve 500-550 nm uyarma ve emisyon filtreleri, sırasıyla, gösterildiği gibi kullanılması gerekir.
3. Öncelikle faiz hücrelerinin farklı girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanarak yerlerini mi FPs. kayıt ifade hücreleri desenli Safir diskler koordinatlarını ayırmak için hücre düşük büyütme resim (10-20 X) edinmeniz.
   Not: çeşitli alanlarda dikiş hücreyi/hücreleri ilgi konumunu daha iyi bir genel bakış için yardımcı olabilir. Bu faz kontrast mikroskobu isteğe bağlı olarak kullanılır ve unutmayın.
4. Yüksek büyütme (floresan ve DIC) görüntüleri (63-100 X, petrol-daldırma hedefleri) aynı hücre/hücre-hücre içi alan içinde ilgi proteinin hücre altı yerelleştirme daha iyi ayırt etmek kazanmak.
   Not: DIC görüntüleri kavramsal bilgiler sağlar. Son korelasyon hücre "anatomik" yerlerinden daha hassas olduğu için bu bilgileri kez LM görüntüleri daha sonra EM filmler ile ilişkilendirmek için önemlidir. Gibi bazı Safir diskler cryo-immobilizasyon sırasında bozabilir, koşul başına triplicates hazırlamak için önerilir. Ayrıca, diğer hücrelere ultrastructure sonucu olarak hasar buz gibi eserler içeriyor olabilir iken bazı hücreler disklerinden HPF ve bu iletişim kuralı, sonraki adımları sırasında ayırmak. Bu nedenle, disk en az iki alanda sonunda çözümlenmesi için yeterince hücre olacak emin olmak için LM yolu ile yansıması. Önemlisi, bu iki alana disk karşı taraflarda olmalı. Bu şekilde hücreleri nerede gömülü reçine blok iki yarıyı da kesilebilir ve bu alanlarda bölümlerini elde edilebilir.

Resim 2 : Büyüyen hücre LM görüntüleme için şema desenli Safir diskler. (A) Safir diskler iyi cımbız yardımıyla bir görüntüleme plakasına aktarılır. (B-C) Bu plaka özel Heidelberg EMBL atölyesinde nerede Safir diskler ile pH göstergesi olmadan hücre kültür orta görüntüsü ışık mikroskobu uyması için tasarlanmıştır. Metal bir slayt, 75 mm x 25 mm x 1 mm, dört-beş delik içine Safir diskler boyutuna sığacak şekilde 3 mm matkap ile öğütülmüş ile oluşur. Buna ek olarak, küçük oluklar 90 ° açıyla delik her tarafında öğütülmüş. Bu delikler diskler forseps ile onları işlenirken erişmek daha kolay. En iyi görüntüleme koşulları için izin vermek için cam coverslips No 0 (0.085 0.13 mm kalınlığında) delik UV tutkalla yapıştırılmış ve sertleşmesine UV ışık altında yer. (D) yüksek büyütme resim desenli Safir disk yüzeyinde kazınmış alfasayısal koordinatları tasvir. Desenli Safir diskler piyasada bulunan (bakınız Tablo reçetesi) vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. Cryo-desenli Sapphire büyüyen hücre immobilizasyon HPF yolu ile diskler

1. HPF için "A" ve "B" alüminyum taşıyıcılar yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) 1-hexadecene ile ıslanmış filtre kağıdı ile bir petri içinde. 1-hexadecene ile Petri kabına hücreleri içeren desenli Safir diskler bırakın.
   Not: diskler biraz hareket hücre kültür orta silsin için.
2. Safir diskler arasında bir "A" ve "B" alüminyum taşıyıcı (Şekil 3B) aşağıdaki gibi HPF tutucu topla. Dibinde, bir "B" taşıyıcı ile onun düz tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Safir diskler içeren hücreleri yukarı bakacak şekilde düz bu yanına koyun. Bir "Bir" taşıyıcı hücreleri karşı karşıya 0,1 mm derinliği ile ekleyin.
   Not: desenli Safir diskler geleneksel Safir diskler kalın olduğu için (sigara desenli 0,05 mm Safir diskler ile kullanılmak üzere tasarlanmış) ticari olarak mevcut "A" taşıyıcı EMBL bu 0.2 mm derinlik tarafında, aşağı 0.05 mm kesilecek vardı Atölye HPF tutucu (Şekil 3A) sığabilmesi için. Böylece 0.2 mm yan maruz kalmaktadır ve hala aşağı kesim tutulurken bu amaç için "Bir" taşıyıcı sonuna bir metal boru eklenir. Böylece düz kesilmiş tarafı aşağı sonra zımparalanabilir. Alternatif olarak, özel alüminyum taşıyıcı-ebilmek var olmak kullanılmış üstünde tepe-in desenli Safir disk (ticari olarak mevcut Tablo malzemelerigörmek), bu durumda HPF "sandviç" olmak sadece Safir disk ve bu taşıyıcı oluşur.
3. HPF makine yuvasýný kapatýn ve hücreleri dondurma.
   Not: Bu bir özel HPF makine için belirli iletişim kuralıdır. Diğer HPF makineleri alternatif olarak kullanılan^6,26olabilir. Her durumda, lütfen yeni nesil makineleri tedarikçilerden varlığını unutmayın.
   Dikkat: koruyucu gözlük ve işitme koruma kulaklık kullanın.
4. Donmuş "sandviç" geçici depolama için sıvı azot ile polistren bir kutuya koyun.
   Dikkatli olun: gözlük ve sıvı azot işlerken potansiyel tehlikeler hakkında bilgi almak için yerel güvenlik görevlileri ile temas halinde olsun.
   1. Karışıklığı önlemek için "bir numara ile işaretlenmiş her sandviç" bir ayrı 0.5 mL microcentrifuge tüp (polistiren kutu içinde) yerleştirin.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Donma ikame (FS) hemen gerçekleştirilemez, örnekleri cryo-tüplerde (ile ilk sayfalarında delik açılır) bir raf kriyojenik sıvı azot içinde tutulan kutuları içinde saklanabilir dewar ( Tablo malzemelerigörmek). Bu sıvı azot konteyner bir odada oksijen gaz sensörler, bir oksijen eksikliği durumunda boğulma önlemek için ile yer almalıdır.
      Dikkat: bir Biyogüvenlik kabini (aşağıdaki adım 5 ve 6) açıklanan tüm işlemler yapılmalıdır. Ayrıca, kullanılan reaktifler tehlikeli çoğu. Kullanmadan önce dikkatle okuyun üreticileri tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formları gibi Emanet memuru güvenli kullanımı sağlamak için ilgili yerel kurallar hakkında sormak için zorunludur. Bu kullanılan malzemelerin doğru bertarafı için yanı sıra aşağıda açıklanan ekipmanların doğru kullanımı için de yerel Enstitü nün sağlık ve güvenlik prosedürleri danışmak için gereklidir.

Şekil 3 : Şema desenli Safir Meclisi diskler HPF için iki alüminyum taşıyıcılar arasında. (A) 0.2 mm için 0,05 mm. (B) 0,16 mm kalın Safir disk alfasayısal deseni ile kazınmış yüzey üzerinde daha derin kendi tarafında kesilecek olan geleneksel "A" gemisi, Cut-away sayısı iki alüminyum taşıyıcılar HPF için içine monte edilir , aşağıdaki gibi: Safir disk "B" taşıyıcı düz tarafında bulunduğu hücreleri yukarı bakacak şekilde yerleştirilir. Bir kıyılmış "Bir" taşıyıcı hücreleri karşı karşıya 0,1 mm derinliği ile yakın "HPF sandviç" üstüne yerleştirilir. Alüminyum taşıyıcılar ve desenli Safir diskler piyasada bulunan (bakınız Tablo reçetesi) vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

5. Cryo-sabit hücre FS

1. FS makine kadar doldurun ( Tablo malzemelerigörmek) sıvı azot ile. Sıcaklığı-90 ° C için ayarlamak ve makine bu sıcaklık ulaşıncaya kadar bekleyin.
2. % 0,2 osmiyum tetroxide (OsO₄) içeren FS orta hazırlamak (v/v), % 0,1 uranyl asetat (UA) (w/v) cam distile aseton FS makine süre içinde aşağı soğutma.
   Not: hazırlamak için (örneğin) 12 mL FS orta, mix %4 OsO₄600 µL UA bir küçük cam kap içinde 0.012 g ile. Bu karışımı bir ultrasonik banyo aygıt için 5 dk. eklemek 11,4 mL Cam distile aseton bir pipet ile dağıtılması ve iyice karıştırın.
3. 1.5 mL microcentrifuge tüpleri 200-500 µL FS orta ile doldurmak, kapağını kapatın ve FS makineye aktarmak. 10 dakika soğumasını FS orta için bekleyin.
4. "Dondurulmuş sandviç hücreler sıvı azot FS orta içeren tüpler için soğutmalı uzun Cımbız kullanarak Safir diskler içeren" aktarın.
   Dikkat: cryo-koruyucu eldiven ve gözlük kullanın.
   Not: HPF "sandviç" kendiliğinden kullandıklarında daha sırasında demonte. Bu durumda, donmuş Safir diskler microcentrifuge tüpler için transfer edilir emin olun. Alüminyum taşıyıcılar göz ardı.
5. FS aşağıdaki gibi kadar sonraki gün²⁷çalıştırın:-90 ° c-80 ° c 8 h; -80 ° C'den-50 ° c 8 h için; -50 ° C ile-20 ° C 2 h için; -20 ° C ila 0 ° C 2 h için.

6. reçine donma gömme yerine örnekleri

Dikkat: bir Biyogüvenlik kabini aşağıda açıklanan işlemler yapılmalıdır. Ayrıca, kullanılan reaktifler tehlikeli çoğu. Kullanmadan önce dikkatle okuyun üreticileri tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formları gibi Emanet memuru güvenli kullanımı sağlamak için ilgili yerel kurallar hakkında sormak için zorunludur. Bu kullanılan malzemelerin doğru bertarafı için yanı sıra aşağıda açıklanan ekipmanların doğru kullanımı için de yerel Enstitü nün sağlık ve güvenlik prosedürleri danışmak için gereklidir.

1. FS makineden değiştirilen örnekler alıp 20 dakika buzda yerleştirebilirsiniz.
2. Örnekleri 20 dk için oda sıcaklığında tutmak ve onları iyice yıkayın (3 kez, 10 min her) cam distile aseton ile. Eğer onlar FS sonra hala microcentrifuge tüplerde alüminyum taşıyıcılar uzun cımbız ile atmak.
3. 1 h incubations % 100 reçine ile gece kuluçka ardından aseton, cam distile % 25, % 50 ve % 75 reçine kullanarak dört adımlı epoksi reçine serisi (üzerinde kalan Safir diskler) hücrelerde sızmak. % 100 reçine ertesi gün için 1 h alışverişi.
4. Dikkatle Safir diskler reaktif hamamlar % 100 reçine ile dolu monte akışı aracılığıyla yüzük içine koyun. Bu halkalar polimerizasyon kalıpları 10 Safir diskler için kullanılır.
   Not: Safir diskler tamamen altına koordinatlarla yukarı bakacak şekilde okunabilir bir şekilde basılması gerekir. Bu bir duman emme bağlı bir dürbün yardımı ile iade edilmesi. Alternatif olarak, bir dürbün bir Biyogüvenlik kabini içinde yerine kullanılabilir. Önemlisi, orada örnekleri tanımlamada yardımcı reaktifleri altta oyulmuş sayılar (1-10).  Buna ek olarak, örnekleri tanımlanması için bir kağıt etiket reçine bloğunda dahil olabilir.
5. 48 h için 60 ° C fırında örnekleri polimerize.

7. desenli Safir diskler polimerli reçine bloklarla kaldırılması

1. Fırından hücreleri içeren sert reçine blokları kaldırmak.
   Not: Protokol burada duraklatılmış. Aksi takdirde, onları kesmeden önce oda sıcaklığına kadar blok soğumaya bırakın.
2. Reçine blok erişimi için bir tıraş bıçağı ile gömme kalıpları kesti. Cımbız kullanarak silindirik reçine blokları kaldırmak.
   Not: Eğer bir kağıt etiket içinde dahil edilmemiş reçine polimerizasyonu, numarasını kalıcı bir kalem bloklarla önce engellemek ve 1.5 mL microcentrifuge tüplerde depolayabilirsiniz. Protokol burada duraklatılmış.
3. "Köpüren" durana kadar sıvı azot içeren bir polistren kutusu Safir diski içeren reçine blok ucu sokmak. O zaman, H₂o kaynar reçine blok ucu sokmak
4. Safir disk reçine blok uzakta-in düşene kadar gerektiği kadar olarak yukarıdaki iki adımı yineleyin.
   Dikkat: gözlük ve cryo-koruyucu eldiven kullanın.
   Not: Bu işe yaramazsa, bir jilet biraz polimerli reçine diskler çevresinde yeniden denemeden önce kaldırmak için kullanın. Protokol burada duraklatılmış.

8. hedef düzeltme ve Ultrathin TEM için kesit

1. Nerede faiz hücrelerinin bir ultramicrotome binoküler blok suratla inceleyerek mevcut alan reçine blok yüzündeki tanımlayın.
   Not: Koordinat modeli desenli Safir diskler gelen negatif baskı blok yüzünde korunur. Bu faiz hücrelerinin hedeflenen kırpma için yerleştirildiği alan kimliği sağlar. LM görüntüleri dikey blok yüz aynı konumunu bulma kolaylaştırmak amacıyla Kuzey gerekir.
2. Küçük düz piramit ilgilendiren bir yamuk şekli ile hücreyi/hücreleri içeren katıştırılmış hücre monolayer trim (~ 200 µm x 250 µm ortalama boyutu) temiz bir tıraş bıçağı ile.
3. 70-nm ultrathin bölümleri katıştırılmış hücre 35 ° elmas bıçak ile elde edilir.
4. Bölümlerde EM yuvası ızgaralar Ultra-ince cımbız yardımıyla yerleştirin.
   Not:: mesh kullanımını ızgaralar bölümleri kılavuz çubuklarıyla maskeli çünkü kaçınılmalıdır.
5. Izgaralar bir kılavuz çizgileri kutusunda saklayın.
   Not: Protokol burada duraklatılmış.

9. TEM analiz Ultrathin bölümleri

1. Yuvası ızgara transmisyon elektron mikroskobu yuvasına yerleştirin. Düşük büyütme (genel bakış) görüntüleri, tam hücre profil ilgi hücrenin görünür nerede elde etmek.
   Not:: geri hücre profilleri ve bir başka hücrelere yerlerini daha önce LM tarafından alınan DIC sayısı karşılaştırarak referansları kullanarak hücreyi/hücreleri ilgi bulunabilir.
2. Yüksek büyütme görüntüleri cep/hücre ilgi, denemek ve bulmak, ultrastructural düzeyinde, daha önce LM tarafından gözlenen floresan sinyallerini karşılık gelen özellikler kazanır.
   Not: Montaj görüntüleri yüksek büyütmede hücreyi/hücreleri ilgi yüksek çözünürlükte bir genel bakış için elde edilebilir. Ayrıca, floresans görüntüleri karşılaştırarak önce 3D hücre yeniden inşa edebilmek için ardışık seri bölümler aynı hücrede görüntüler elde etmek genellikle gereklidir.

Sonuçlar

Burada sunulan yordam (Şekil 1), stabil T7 RNA polimeraz ifade desenli Safir diskler üzerinde tohumlari ve daha sonra hepatit C virüsü (HCV) iki etki alanı ifade bir plazmid ile transfected Huh7-Lunet hücreler kullanma mekansal protein NS5A, GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Şekil 4) ile etiketledi. Ertesi gün, nerede hücreleri büyüyen edildi, desenli Safir diskler, hücre kültürü yemekleri dışında alınan ve LM (Şekil 4, Şekil 2) aracılığıyla görüntüsü. AH-D1-GFP ifade bu hücreleri yeşil floresans sitozol varlığı ile tanımlanan ve safir diskler (rakamlar 5A, 5B) koordinat desen içindeki konumlarını kaydetmek için kaydedildi. Hemen onların LM muayene, faiz hücreleri içeren Safir diskler aşağıdaki iki alüminyum taşıyıcılar (Şekil 3) arasında monte ve cryo-immobilizasyon için HPF tarafından tabi. Hücreleri vardı sonra freeze yerine konan ve daha sonra gömülü bir epoksi reçine.

Safir diskler polimerli reçine bloklarla kaldırma üzerine alfasayısal desen baskı nerede faiz hücrelerinin bulunduğunu alanları alma izin blok yüzünde görünür oldu. Reçine blok geri kalanı uzakta faiz hücreleri barındıran küçük bir yamuk oluşturmak için kesilmiş. Seri ultrathin bölümleri bu yamuk elde edilen, EM yuvası ızgaralar üzerinde toplanmış ve daha fazla analiz tarafından TEM (Şekil 5C). Not uygun²⁸ olmasına rağmen el ile seri ardışık bölümlerde alma yoğun emek ve iyi eğitimli ve vasıflı personel gerektirir. Hücreleri daha önce LM tarafından tanımlanan aynı hücrenin hızlı tanıma sağlamak için bu CLEM Protokolü (Şekil 5A) tabi zaman düşük bir confluency olması önemlidir. Aksi halde, daha yüksek hücre confluency sahip büyük ölçüde başarılı EM düzeyinde hücrelerin yerini aşağı yavaşlatabilir.

TEM analiz ultrathin birkaç faiz (rakamlar 5 d, 5E) hücre bölümlerini değişken morfoloji üzerinden ayrılmış veziküller büyük birikimleri, hücre içi alanı huzurunda ortaya AH-D1-GFP, ifade sitozol tek lipid bilayer (Şekil 5E) tarafından çevreleyen.

Şekil 4 : İş akışı şematik Gösterim takip tasvir CLEM örnek gerçekleştirmek için Şekil 5 . Huh7-Lunet hücreleri stabil T7 RNA polimeraz ifade transfected kodlama amfipatik helix (AH) ve etki alanı 1 (D1) HCV NS5A protein, DNA plazmid ile etiketledi GFP (pTM_AH-D1-GFP) ile onun C terminalinde. NS5A protein bu parçası ifade transcriptionally T7 organizatörü (T7 Pm) ve hızle ikincil yapısı tarafından belirtilmiş bir encephalomyocarditis virüs (EMCV) IRES (iç ribozom giriş sitesi) öğe tarafından kontrol edilir. Safir diskler 24 h sonrası transfection (24 hpt) hücreleri büyüyen desenli ve AH-D1-GFP ifade LM tarafından tespit ve hemen HPF-FS için tabi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : CLEM yordamı örneği. (A) Huh7-Lunet hücreleri stabil GFP pozitif hücreler üzerinde desenli Safir diskler, plazmid ile transfection sonra 24 saat pTM_AH-D1-GFP yetiştirilen ayrılacak floresans mikroskobu tarafından analiz T7 polimeraz ifade. (B) daha yüksek büyütme görüntüsü CLEM tarafından analiz edilecek beyaz kesik dikdörtgen içinde seçili bir hücre. (C) TEM görüntüsü HPF, FS ve reçine gömme aynı hücreyi ultrathin bir bölümünü. (D) seri 70 nm ultrathin bölümler faiz hücre içeren bir yuvası EM kılavuz üzerinde şematik gösterimi. (E) soldaki: ilgi hücrenin iki bölüm, TEM genel bakış. Sağda: sarı dikdörtgenler sitozol tek bir membran ile üzerinden ayrılmış veziküller sayısının fazlalığı açığa soldaki seçili hücre içi alanlarda yüksek büyütme TEM görüntüleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Burada bir viral protein ifade hücre zarı üzerinde etkisini incelemek için sunulan CLEM metodoloji başarıyla çoğaltma ilişkili HCV aydınlatmak için yapıları, esas olarak çift cidarlı veziküller (DMVs)²¹, önce hem de kullanılmıştır Bu yapıları HCV kaynaklı²³oluşturmak için gerekli kritik yapı taşları belirlemek. HCV çoğaltma²¹çalışmaya CLEM kullanarak ilk çalışmalarda dikkat edin, biraz değiştirilmiş sürüm burada açıklanan protokolü uygulandı. Çalışma, alfasayısal desen, olmadan geleneksel 0.05 mm kalın Safir diskler kullanılmış o içinde başvuru desen tarafından yaratıldı onları Bulucu kılavuz üstünde tepe ile kaplama karbon ( Tablo malzemelerigörmek). Bu sürümü geçerli protokol, sonunda, "Bir" taşıyıcı HPF için doğrudan, Şekil 3olduğu gibiAazaltmayı gerek kalmadan kullanılabilir avantajı ile uygulanabilir. Alternatif olarak, iletişim kuralında belirtildiği gibi bir daha kalın "A" taşıyıcı yararlı olabilir ( Tablo malzemelerigörmek) bir "B" taşıyıcı, gerek kalmadan desenli Safir diskler ile.

İlginçtir, bu protokolü sadece hücreleri açıklandığı gibi viral proteinler ile burada ve başka yerlerde^19,23transfected gibi BSL-1 örnekler, incelemek için aynı zamanda virüs bulaşan hücreleri incelemek için uygulanabilir. İnsan patojenler ile çalışma BSL-2 ve BSL-3 laboratuvarları için genellikle sınırlı olsa da, bazı ülkelerde cryo-immobilizasyon bu Biyogüvenlik koşullar altında gerçekleştirmek hala mümkündür. Bu BSL-2 ve vitrifiye yerel düzenlemelere veya bir HPF makine yokluğu nedeniyle mümkün olmadığı BSL-3 laboratuvarları, virüs bulaşan hücreleri hala eğer kimyasal fiksasyonu aldehitler ile önceden yürütülen bu yöntemi kullanarak hazırlanabilir, Yani daha önce BSL-2 veya BSL-3 tesisleri bırakarak. Ayrıca, aldehitler sonra hemen fiksasyon protokol geri kalanı burada açıklanan bir aynıdır floresans tutmak için su lazım. Hücreleri iki kez, kimyasal ve vitrifiye üzerinden sabit çünkü bu teknik gereksiz düşünülebilir. Ancak, bu Çift Kişilik fiksasyon Protokolü gerçekten HCV kaynaklı DMVs kimyasal fiksasyonu yalnız²¹' e tabi hücreleri bulundu DMVs ile karşılaştırıldığında bir daha fazla korunması yol açar.

Daha fazla değişiklikler ve okuyucu sorun giderme için bu el yazması Protokolü parçası boyunca notlar için denir. Bu notları tuzaklar önlemek için hem de bu yöntem işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sözde zorlukları aşmak için alternatifler açıklar.

Bu tekniği uygulamak için ana koşul HPF makinesidir. Ne zaman cryo-immobilizing HPF yoluyla hücreleri (bir HPF makine devamsızlık nedeniyle) mümkün değildir ya da ne zaman (membran korunması en uygun olması gerekli değil) gerekli değildir, hücreleri olabilir kimyasal olarak sabit ve daha sonra hazırlanan ve EM⁸tarafından^{analiz, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19}. Bu seçenek hücre kültür yemekleri gridded desenlerle hücreleri veya hücre kümeleri yeniden konumlandırma için ama Safir diskler kullanımı gerektirmez. Bu yemekler kullanımı en büyük avantajı onların daha büyük çapı ile karşılaştırıldığında daha büyük yüzey alanlarını tarama izin Safir diskler olduğunu. Böylece, bu CLEM iletişim kuralı uygulaması HCV¹⁵ karşı antiviral bir bileşik etkisini incelemek için veya noroviruses¹⁹mekansal proteinler tarafından indüklenen membran düzenlemeler görselleştirmek için başarıyla uygulandı. Bu yöntemin performansı sınırlayabilir bir başka konu ticari bir FS aygıtı olmaması. Bu durumda, temel ev yapımı FS sistemleri yerine kullanılabilir. FS otomatik işleme aksilikler azaltabilir olmasına rağmen ev yapımı aygıtları başarıyla örneğin Kent McDonald's³⁰ ve Paul Walther'ın laboratuarda kullanılıyor.

Kimyasal fiksasyonu ile ilgili olarak burada açıklanan protokol hücre içi yapılar²⁰en iyi bir koruma sağlar. Bu nedenle, yukarıda belirtilen HPF ve FS aygıtları mevcut olduğu durumlarda faiz hücrelerinin viktifiye tercih olacaktır.

Gelecekteki seçimli-e doğru bu CLEM yaklaşım sadece ultrastructural düzeyde 2D bilgi almak için aynı zamanda zar ve organel değişiklik virüslerin neden mimarisi hakkında 3D bilgi elde etmek için bu yöntemi kullanma imkanı bulunmaktadır. Elektron tomografi (ET) ve odaklanmış iyon demeti Tarama elektron mikroskobu (FIB-SEM) (yoğun açıklandığı²⁹), dahil olmak üzere 3D-EM yöntemleri de bu geçerli protokol^{21takip hazırlanan hücrelere uygulanabilir, 31}. Buna ek olarak, 3B bilgileri de LM düzeyinde z-yığınlar edinimi sağlar confocal mikroskop kullanarak elde. Aslında, LM ve EM veri kümeleri arasında kesin bir bağlantı istenen (bkz. Örneğin¹⁷) olduğunda bu seçenek önerilir. 2B TEM görüntüleri ile ilişki geliştirmek için 3D z-yığınlar AIDS yer alan bilgiler. Bu nedenle, böyle bir senaryoda, LM ve EM görüntüleri uygun en iyi seçilebilir ve sonra bir korelasyon yazılım mevcut, ec-CLEM eklenti Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² veya Landmark yazışmalar eklentinin gibi tabi Resmi J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), LM-EM görüntüleri örtüşen nesilde kaynaklanan.

Belirli bir olay kinetik anlamak için geçici bilgi gerektiğinde, hızlandırılmış görüntüleme canlı hücreler EM ile birlikte dinamikleri izlemek için kullanılabilir. Faiz olay sırasında hücreler hemen, giderilen "daha sonra EM yolu ile çözümlenebilir bir donmuş anlık görüntü", immobilizasyon saat o anda hakkında ayrıntılı ultrastructural bilgi. Bu "dondurulmuş anlık görüntü", gerçek zamanlı gözlem sonra elde etmek için kimyasal olarak sabit³³ veya⁶cryo immobilize hücreler olabilir. Birçok hücresel süreçler kimyasal fiksasyonu difüzyon süreçlerinin daha hızlı oluşur, mümkünse, ultra hızlı donma gerçekleştirilmesi gerekiyor. Ancak, HPF makineleri onların etkili zaman çözünürlük³⁴farklı dikkate almak önemlidir.

Bu iletişim kuralı hücrelerinin bir epoksi reçine gömmek için tasarlanmış olmasına rağmen Ayrıca, hücreleri de düşük viskozite reçineler, Lowicryls, LR beyaz veya LR altın gibi içinde gömülü olabilir. Bu gömme medya kullanımı floresans^37,38 yanı sıra antigenicity^35,36korumak için olanak sağlar ve bu nedenle, çoğunlukla bölüm immunolabeling³⁹ sonrası gömmek için kullanılır ^{, 40} ve gömme sonra Şampiyonlar Ligi nerede yapılır bölüm CLEM^41,42,43,44. Her iki yaklaşımın (IMMUNO-EM ve bölüm CLEM) hangi özelliği olmayan yapıları kolayca yolu ile TEM ve/veya miscorrelation LM ve EM arasında karşı kontrol olarak sinyalleri bulunabilir bu deneylerin için çok önemli olmalı. Aynı şekilde, iki görüntüleme yöntemleri (LM ve EM) tarafından görüntülenmiştir antikorlar ile etiketleme Örneğin, (sahne öncesi katıştırma) LM transfected hücreleri tanımlamak ve çok daha doğru bir yerelleştirme elde etmek için⁴⁵ yapılabilir Onun belirli IMMUNO-EM tarafından (sonrası gömme sahne) etiketleme yoluyla GFP sinyal. Dikkate alınması gereken, ancak, o permeabilization LM antikorlar hücre mimarisi EM düzeyinde alt-optimal korunması neden olabilir hücre içi alanı erişime izin vermek için önce yapılır. Çok renkli bu deneyler için ilginç bir şekilde, bu iletişim kuralını da son derece uygundur GFP dışındaki Diğer Floresan Etiketler kullanımı ile (burada görüldüğü gibi) elde edilebilir. Sonuç olarak, bu iletişim kuralı, hem Şampiyonlar Ligi ve/veya EM tarafta bağlı olarak ele alınmaktadır sorular adapte birçok sözde olasılık vardır. Diğer alternatif iletişim kuralları kapsamlı açıklaması için^5,46için okuyucu denir. Mikroskopi yöntemleri nasıl birleştirilir ne olursa olsun, birlikte bir kazanç daha iyi virüs ve onların protein gerçek hayatta onların ailelerle etkileşimini anlamak izin verdiğiniz bilgilerin sonucudur.

Bu yöntem içinde en önemli adım faiz seri bölümler hücrelerinden koleksiyonudur. Temsil edici sonuçlar bölümünde vurgulanan, bu uzman kadrosu, hem de sabır gerektirir. Önemlisi, bu adımı iki nedenden dolayı geri EM düzeyinde hücreleri bulmak için önemlidir. İlk olarak, LM önceden katıştırma CLEM iletişim kuralı'nı bu sıralamada, koordinatları yalnızca LM düzeyinde ve reçine blok yüzündeki gömme sonra görülebilir. Ancak, onlar tarafından TEM bölümlerinde görünür olmaz. Bu nedenle, hedeflenen kesme blok yüzünde faiz (ROIs) bölgelerinde daha sonra elde edilen bölümleri belirli bir FP ifade hücreleri içerir emin olmak için bir jilet ile dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. İkinci olarak, "birkaç bölüm tarama" Şampiyonlar Ligi ve EM satın almalar arasında en iyi yer paylaşımı bulmak gereklidir. LM sonrası gömme aşamada yapılacağı yeri yöntemleri aksine, bu durumda LM-EM kaplama kadar kesin değildir. Düşük bindirme doğruluk Aksiyel çözünürlük LM ve EM, Em örnek işleme sırasında büzülme ve sıkıştırma sırasında⁴²kesit arasındaki farkları kaynaklanmaktadır. Yine de, tarihi yerler, kullanımı gibi etkili izleme Yöntemler geri hücreleri bulmak için yardımcı olur. Bu başka bir bir hücrenin konumu, hem de hücreleri ve onların çekirdek şekli içerir. Bu bağlamda, iletişim kuralında açıklandığı, DIC görüntüleri korelasyon geliştirmek için kritik olan hücreleri "anatomik" bilgi sağlar. Alternatif olarak, çekirdekleri veya diğer iyi tanınabilir hücre organelleri (mitokondri veya lipid damlacıkları) LM önce lekeli ve Simgesel kullanılan.

Son olarak, her ne kadar bu el yazması bu tekniğin kullanımı Viroloji etütler odaklanmıştır, bu deneysel tasarım kapsamını daha genel biyoloji soruları gidermek için Genişletilebilir olduğunu belirtmeyi çekicidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
UV Crosslinker	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230 Vac, 254 nm UV ampullerle donatılmış, her biri 8 Watt.
Desenli safir diskler	Mühendislik Ofisi M. Wohlwend, Sennwald, İsviçre	627	0,3 mm çapında ve 0,16 mm kalınlığındadırlar, ayrıca hücrelerin yeniden konumlandırılmasına izin vermek için kazınmış alfanümerik bir desene sahiptirler. Sadece e-posta ile sipariş edilebilirler: martin-wohlwend@bluewin.ch.
İnce ve uzun cımbız	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	72919-SS	"Style SS", safir diskleri işlemek için.
Hücre kültürü ortamı	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	41965-062	Dulbecco'nun 2 mM L-glutamin, esansiyel olmayan amino asitler, ml başına 100 birim penisilin, 100 ve mikro ile desteklenmiş modifiye Eagle ortamı (DMEM); ml başına g streptomisin ve% 10 fetal buzağı serumu (DMEM tamamlandı, aşağıya bakınız). Her biri 500 mL olmak üzere 10 şişe içeren paket.
L-glutamin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	25030-123	Her biri 100 mL'lik 20 şişe içeren paket.
Esansiyel olmayan amino asitler	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	11140-068	Her biri 100 mL'lik 20 şişe içeren paket.
Penisilin / Streptomisin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	15140-163	Her biri 100 mL'lik 20 şişe içeren paket.
Fetal baldır serumu	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, ABD	F7524	50 mL şişe
Ters mikroskop	Olympus Deutschland, Hamburg, Almanya	CKX41	Trinoküler kafa seçenekleri ve floresan yükseltme özelliğine sahip ters çevrilmiş bir mikroskoptur.
T7 RNA-polimerazı stabil bir şekilde eksprese eden Huh7-Lunet hücreleri	Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratuvarında mevcuttur	Mevcut değil	Prof. Bartenschlager ile şu adresten iletişime geçin: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfeksiyon Reaktifi	Mirus Bio LLC, Madison, ABD	MIR 2304	Geniş spektrumlu, düşük toksisiteli, DNA transfeksiyon reaktifi. 0.4 mL'lik flakon
Ters çevrilmiş geniş alan floresan mikroskobu	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Almanya	Zeiss Observer.Z1	Canlı hücre kültürlerini içeren deneyler için ters floresan mikroskobu.
1-hexadecene	Merck, Darmstadt, Almanya	8220640100	100 mL
"A" alüminyum tutucu şişesiMühendislik	Ofisi M. Wohlwend, Sennwald, İsviçre	241	Bu, bu protokol için kullanılan ve 0,1 ve 0,2 mm'lik 2 farklı derinliğe sahip olan tutucudur. Sadece e-posta ile sipariş edilebilir: martin-wohlwend@bluewin.ch.
HPF Mühendislik Ofisi için "B" alüminyum tutucular	M. Wohlwend, Sennwald, İsviçre	242	Bu, bu protokol için kullanılan tutucudur. 0,3 mm kalınlığındadır. Sadece e-posta ile sipariş edilebilirler: martin-wohlwend@bluewin.ch.
HPF için "A" alüminyum tutucu (desenli safir disklerle çalışmak için özel)	Mühendislik Ofisi M. Wohlwend, Sennwald, İsviçre	737	Bu, "B" tutucuya veya "A" tutucunun baskısına ihtiyaç duymadan desenli safir disk (mevcut protokole alternatif olarak) ile tek başına kullanılabilen tutucudur. 0,84 mm kalınlığındadır. Sadece e-posta ile sipariş edilebilir: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Safir diskler	Mühendislik Ofisi M. Wohlwend, Sennwald, İsviçre	405	Bu safir diskler, 0,3 mm çapında ve 0,05 mm kalınlığında "geleneksel" olanlardır. Desenli safir diskler yerine alternatif olarak CLEM için de kullanılabilirler.
Bulucu ızgaraları	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, Philadelphia, ABD	LF135-Cu	Bu 135 gözenekli ızgaralar, karbon kaplama yoluyla "geleneksel" safir diskler (yukarıda açıklanmıştır) üzerinde alfanümerik bir desen oluşturmak için kullanılır, böylece CLEM için kullanılabilirler. 100 ızgara / şişe.
HPF makinesi	ABRA Fluid AG, Widnau, İsviçre	HPM 010	Bu HPF makinesi bu protokol için kullanılmıştır.
HPF makinesi	Leica Microsystems, Viyana, Avusturya	EMPACT 2	"EMPACT 2", bu protokolde kullanılmış olan HPM makinesinin kullanımına alternatif olarak (yukarıda açıklanmıştır).
Kriyo tüpler	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	Z763667-500EA	Kriyo ile hareketsiz hale getirilmiş numunelerin sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolanması için. 500 kriyovial içeren paket.
Sıvı nitrojen dewar	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Almanya	GZ-05094-60	1600 kriyo tüp kapasiteli kriyo rafları ile donatılmış, kriyo hareketsiz hale getirilmiş numunelerin sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolanması için.
Otomatik dondurarak ikame (AFS) makinesi	Leica Microsystems, Viyana, Avusturya	EM AFS2	Bu makine, dondurarak ikame ve aşamalı sıcaklık düşürme (PLT) tekniklerini gerçekleştirir ve reçinelerin düşük sıcaklıkta gömülmesine ve polimerizasyonuna izin verir.
Osmiyum tetroksit (OsO4)	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	19150	% 4 sulu çözelti, 10 x 2 mL ampul içeren bir kutu.
Uranil-Asetat (UA)	Serva, Heidelberg, Almanya	77879.01	25 gr (UA)-2 H2O içeren şişe.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Almanya	329	"Sonorex Super RK 31", FS ortamını hazırlarken OsO < sub > <4 / sub> ve Ua'yı karıştırmak için bu protokolde kullanılan sulu temizleme çözeltisi için yüksek güçlü bir ultrasonik temizleme banyosudur.
Camla damıtılmış aseton	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	10015	Şişe 100 mL
Stereomikroskop	Leica Microsystems, Viyana, Avusturya	Leica M80	Günlük incelemeler için rutin stereomikroskop, görüntü yakalamak için bir kamera ile donatılmıştır.
Epoksi reçine	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	14120	Embed 812, üreticiler tarafından verilen oranlarda karıştırılması gereken birkaç bileşen içeren bir kittir.
Halkalardan akış Leica	Microsystems, Viyana, Avusturya	16707157	100 adet içeren paket.
Reaktif banyoları	Leica Microsystems, Viyana, Avusturya	16707154	100 adet içeren paket.
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Viyana, Avusturya	Leica EM UC7	Oda sıcaklığında yarı ve ultra ince kesitlerin hazırlanması için ultramikrotom.
Ultra 35 & derece elmas bıçak	Diatome Ltd., Nidau İsviçre	AGG339-735	Bu bıçağın kenar uzunluğu 3 mm'dir.
Ultra ince cımbız	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	E78318	"Stil 3X", EM ızgaralarını işlemek için.
EM yuvası ızgaraları	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	G2010-Cu	100 ızgara / şişe.
EM ızgara saklama kutusu	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	71155	100 ızgara kapasitesine sahiptir.