Yöntem makalesi

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

10.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59721

⸱

8 Haziran 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genetic Medicine, Children's National Health System, 2Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 3Dana-Farber Cancer Institute, 4Department of Neurology, University of California San Francisco, 5DIPG Centre of Expertise Zurich, Universitats-Kinderspital Zurich

Bu makalede

Özet

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Özet

Ön ve tekrar cerrahi doku örnekleme ile ilgili komplikasyonlar moleküler alt sınıflandırma ve tedaviye tümör tepkisi temporal izleme yeteneğine sahip minimal invazif platformlar için ihtiyaç mevcut. Burada, hücre serbest DNA (cfDNA) tümör somatik mutasyonların tespiti için dPCR tabanlı yöntemi tarif, hasta biofluids kolayca kullanılabilir. Her tahlil için test edilebilir mutasyonlar sayısında sınırlı olsa da, bu yöntem yüksek düzeyde hassasiyet ve özgüllük sağlar. Mutasyon bolluk izlenmesi, MAF tarafından hesaplanan, böylece radyografik görüntüleme için çok gerekli bir ek sağlayan, tedaviye tümör tepkisi değerlendirilmesi için izin verir.

Giriş

Moleküler analizler için tümör dokusunun mevcudiyeti sınırlamaları nedeniyle, plazma, serum ve beyin omurilik sıvısı (CSF) dahil olmak üzere hasta biofluidlerde tümör somatik mutasyonları tespit edebilen son derece hassas yöntemlerin geliştirilmesi gerekir. . Örneğin, Pediatrik diffik orta çizgi gliomlar (DMGs) nöroanatomik konumu nedeniyle bir zorluk mevcut. Son on yılda, DMG doku örneklerinin moleküler profilleme bu tümör tip1 ' de sürücü mutasyonları ortaya çıkardı ve mutasyonların mekansal ve temporal heterojenliği ortaya koydu, bir hastalık içinde bir hasta karakterize etmek için biyopsi yapmak gerekli alt grup ve moleküler hedeflenen tedaviler teşvik2. Bu nedenle, klinik deneyler ön tanıda tümör moleküler profilleme için cerrahi biyopsileri entegre etmek için savunan3,4,5,6. Tedavi sırasında, DMGs 'de terapötik tepkinin izlenmesi, küçük değişiklikler veya tümör genomik evriminin algılanması için duyarlılık bulunmayan MRG ile sınırlıdır. MRG aynı zamanda, görüntüleme üzerinde gerçek ilerlemeyi taklit eden ve tümör tepkisi7' nin yorumlanmasını yanlış bildirebilir olan tümör bölgesinde pseudoprogresyon, geçici inflamasyon algılamaya eğilimli. Böylece, DMGs bir alternatif için yüksek bir ihtiyaç ile bir tümör türü temsil, tümör mutasyonları tespit ve klinik yanıt izleme minimal invazif araçlar. Bu ihtiyaçları ele almak için, orta çizgi gliomas8olan çocukların plazma, serum ve CSF 'den gelen cfdna 'da bulunan allelik frekansının, tümör mutasyonlarının algılanması ve ölçülmesi için bir protokol geliştirdik ve optimize ettik. Bu çocukluk DMGs genellikle (>% 80) göz önüne alındığında bir somatik lizin-to-metiyonin mutasyon konumu 27 histon varyant H 3.1 (H 3.1 K27M, olguların% 20) veya H 3.3 (H 3.3 K27M,% 60%)1, bu ve diğer mutasyonlar dmgs (i.e., ACVR1, PIK3R1) karakteristik için hedef cfdna kullanarak mutant allel kantifikasyon8. Bu tahlil dizi özgü astar ve prob kullanarak diğer tümör türlerinde Hotspot mutasyonları algılamak için uyarlanmış olabilir. Bu yaklaşımın çok yönlülüğü, cfDNA tabanlı tanılama araçlarının ve terapötik izleme entegrasyonlarından faydalanacak çeşitli kanserlere uygulanabilir hale getirir.

CfDNA 'da düşük allelik frekans mutasyonlarının hassasiyetle algılanması için, damlacık dijital PCR (dPCR) tabanlı bir yaklaşım kullanıyoruz. Bu yöntemle, PCR reaksiyon karışımı, dPCR platformunu (örn. RainDance) kullanarak, PCR başına 7-9 milyon damlacıklar ile genellikle deneysel olarak görülen, teorik en fazla 10.000.000 damlacıkları içine bölümlendirilir. Numune bölümleme yüksek derecesi nedeniyle, en az bir iki DNA molekülleri her damlacık mevcut olabilir. PCR amplifikasyon ve serisine özgü floresan prob hibridizasyon her damlacık ortaya çıkabilir, reaksiyonların milyonlarca gerçekleşir. Bu hassasiyeti maksimuma çıkarır ve nadir görülen mutant allinin algılanmasını sağlar, bu da wildtype DNA 'sının bir arka planına karşı algılanamayabilir. Kilitli nükleik asit (LNA) problarının kullanımı, uyuşmazlığın hybridizasyonunu kısıtlayarak ve doğru mutasyon tespiti9,10,11' i destekleyen testin özgüllüğünü geliştirir. Burada, numune işleme, cfDNA ekstraksiyon, hedef alleles, dPCR ve veri analizinin önamplifikasyonu yöntemlerimizi tarif ediyoruz.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (San Francisco, CA; IRB #14-13895) ve çocuk ulusal sağlık sistemi (Washington, D.C.; IRB #1339). Örneklerin toplanması ve hasta veya hastanın velisi bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra incelenmiştir.

1. biyolojik numunelerin toplanması ve saklanması için ıRB protokolünün altında hüküm yapan hastalar

  1. Her hasta veya hastanın velisi, ilgili kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylanmış bir klinik deneme veya biorepository katılım için yazılı bilgilendirilmiş onay alındıktan sonra hasta örneklerini toplayın.
    1. Bu çalışmada bulunan hastalar radyografi ile beyin tümörü tanısı konuldu. Hiçbir dışlama ölçütü kullanıldı. Örneklerin toplanması ve hasta veya hastanın velisi bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra incelenmiştir.

2. kan toplama ve plazma veya serum ayrılması

  1. Kan toplama tüplerine bir 10,0 mL çizmek kullanarak kandaki numuneyi toplayın. Plazma için kan toplama, K2-veya k3-EDTA tüpler, heparin veya cfdna kan toplama tüpleri kullanın. Serum için kan toplama, pıhtılaşma aktivatörü ve ayrı serum jel içeren jel bariyer tüpler kullanın.
    Not: 10 mL çoğaltır denemeleri etkinleştirmek için tavsiye edilirken, en az 3 mL yeterli olacaktır.
  2. Dikkatli bir şekilde toplama tüpünü ters çevir 10 kez toplama tüp reaktifler ile kan örneği karıştırmak için.
  3. Serum, kan pıhtısına izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika içinde toplanacak olan kan örneklerini bırakın. Eğer kan işleme plazma elde etmek için, adım 2,4 hemen ilerleyin.
    Not: Plazma için işlenmiş numuneler santrifüjleme öncesinde en fazla 2 saat buz üzerinde tutulabilir. Ancak, kan çekmek için hızlı bir geçiş işleme cfDNA düşüşü en aza indirir.
  4. Santrifüjte kan toplama tüpleri 2.000 x g 'de 15 dakika santrifüj olarak 4 °c ' ye ayarlı plazma veya serum beyaz ve kırmızı kan hücresi katmanlarından ayırmak için.
  5. Beyaz kan hücresi tabakasını rahatsız etmemek (üst plazma/serum tabakası ve paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin alt tabakası arasında ince bir çizgi oluşturan), plazma/serum üst katmanını pipet (açık, sarı veya pembe renkte olabilir) 1 mL alquots 'da eşit Steril Polipropilen vida-Cap kriyovials içine.
  6. Konu kimlik numarasını, numune tipini (plazma veya serum) ve toplama tarihini kriyovilerin etiketine kaydedin.
  7. -80 °C ' deki dondurucuyu kullanıma kadar saklayın. A-80 °C dondurucu mevcut değilse, örnekleri-20 °C ' de bir haftaya kadar saklayın.

3. CSF toplama ve Işleme

  1. Bir şant, lomber delinme veya ameliyattan CSF toplayın.
    Not: Bu tür prosedürler sadece klinisyenler tarafından gerekli görülürse yapılmalıdır. Klinik kullanım için gerekli olan ek numunenin ötesinde araştırma amacıyla kullanılabilir.
  2. Toplanan CSF hacmini ölçün ve rengini not edin (kanlı, sarı, net).
  3. 10.000 x g 'de toplama tüpünü 4 °c ' de 10 dakika boyunca santrifüj ederek hücresel enkaz Pelet.
  4. CSF süpernatant 500 μL plakaya Polipropilen vida kapağı kriyovials içine eşit transfer.
  5. Konu kimlik numarasını, numune tipini ve numune toplama tarihini kriyovilerin etiketiyle kaydedin. Kullanıma kadar-80 °C ' de saklayın.

4. sıvı örneklerden cfDNA ekstraksiyonu

  1. Cfdna ekstraksiyon seti el kitabı12' deki yönergelere göre CFD çıkarma protokolünü gerçekleştirin.
    1. % 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tezgah alanı ve ekipman temizleyin.
      Not: Bir PCR kaput kullanımı, eldiven düzenli değişen ve tezgah alanı ve ekipman sık dekontaminasyon 10% çamaşır suyu ve 70% etanol protokolün tüm adımlar sırasında örnek kontaminasyonu önlemek için önemlidir.
    2. Çapraz kontaminasyon önlemek için ekstraksiyon kiti, örneğin, yıkama tamponları, reaktiflerin plakaya hazırlayın.
  2. Çıkarma başlamadan önce hasta örneklerini buzda çözün. Plazma/serum için, numune 1 ml kısım çözüyor. CSF için, çözülme 500 μL örnekteki alquot.
    Not: Ekstraksiyon protokolünün liziz adımları (4.5-4.8) plazma/serum ve CSF arasında farklılık gösterir, ancak adım 4,9 den itibaren, protokol her iki biofluid türü için aynıdır.
  3. Lizis adımı sırasında kullanım için 60 °C ' ye bir ısıtma bloğu ayarlayın (4,6).
  4. Liziz tamponu ve Carrier RNA karışımını 15 ml 'lik bir tüpte, 5,6 μL Carrier RNA ve 0,9 ml lizis buffer örneği için12ekleyerek hazırlayın.
  5. Plazma/serum için 100 μL proteinaz K, 1 ml örnek ve 0,8 ml lizis buffer/Carrier RNA karışımı, adım 4,4 ' de etiketli bir 2,0 ml tüpüne eklenir. Yüksek hızda 30 s için nabız vortekslenir tarafından Mix12.
    1. CSF için, 125 μL proteinaz K, 500 μL, 1 mL liziz tampon/taşıyıcı RNA karışımı ve 2,0 mL tüpüne 250 μL doku liziz tamponu ekleyin. 125 μL 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) ekleyerek 2 mL 'ye kadar tam hacim getirin. Yüksek hızda 30 s için nabız vortekslenir tarafından Mix12.
  6. Isıtma bloğu12' de 60 °c ' de 30 dakika için numuneleri Inküye.
  7. Isıtma bloğundan numuneleri çıkarın ve sıcaklığı 56 °C ' ye indirin. Numuneleri banka dönün ve lysate 'yi yeni etiketli 15 mL tüplere aktarın.
  8. Plazma/serum için, 1,8 mL nüklik asit bağlayıcı tamponu ekleyin ve 30 s için darbe voroserleme12' ye karıştırın.
    1. CSF için, 3,6 mL nüklik asit bağlama tamponu ekleyin ve 30 s için karışım12Pulse vorfatleme
  9. Örnekler, buz12' de 5 dk.
  10. Sütunu vakum konektörüne takın. Sütunu açın ve12sütununa 20 ml 'lik bir tüp Extender ekleyin.
  11. Tüp Extender duvarlarında damlacıklar bırakarak kaçınarak, tüp Extender altına doğrudan 15 mL tüp içeriğini pipet.
  12. Vakum konnektörü kapalıyken, vakum pompası üzerinde geçiş yapın. Basınç 900 mbar 'a kurulduktan sonra, vakum konektörünün vanasını açın. Örnek şimdi sütun üzerinden akacak.
  13. Tüm lysate sütundan boşaltıldı sonra, pompa kapatın ve vakum konektörü için kapı açmak, basınç gradyan giderici. Basınç 0 mbar ulaştığında, vakum konnektörü ve trapdoor valfi kapatın.
  14. 20 mL tüp Extender 'ı, bu örnekleri çapraz-kontamine gibi bir sütun bir komşu sütun üzerinde Extender geçmesi dikkatli olmak kaldırın. Tüp Extender 'ı atın.
  15. Ekleme 600 μL ilk yıkama arabelleği sütun12.
  16. Tüplerin kapakları açık bırakın ve vakum pompası açın. Basınç ölçer 900 mbar ulaşmasına izin, sonra sütun üzerinden yıkama tampon çizmek için açık konumuna vakum konnektörünün anahtarı açın.
  17. Vakum Pompası kapatın, basınç serbest bırakmak için kapı açın ve 0 mbar basıncı rahatlatmak. Vakum konektörünün vanasını kapalı konuma getirin.
  18. Sütun için ikinci yıkama arabelleği 750 μL ekleyin ve 4.16-4,1712arasındaki adımları yineleyin.
  19. Sütun için 750 μL MB dereceli etanol ekleyin ve 4.16-4,1712arasındaki adımları yineleyin.
  20. Sütunun kapağını kapatın ve sütunu yeni bir 2,0 mL toplama tüpünün içine yerleştirin. Vakum konektörünün bertaraf edilmesi12.
  21. 20.000 x g cinsinden sütun ile tüp Santrifüjü oda sıcaklığında 3 dakika12.
  22. Yeni bir koleksiyon tüpü içine sütun yerleştirin ve tüp kapağını açın. Üst üste bir laboratuar dokusu yerleştirin ve 56 °C ' de 10 dk12için Inküye yapın.
  23. Sütunu temiz 1,5 ml PCR-Clean tüp ve pipet 100 μL elüsyon tampon (veya moleküler biyoloji sınıfı h2o (MB h2o)) doğrudan sütunun ortasına yerleştirin. Bir pipet ucu ile sütuna dokunmayın. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 3 dakika bırakın.
  24. 20.000 x g 'de Santrifüjü oda sıcaklığında 1 dakika için elute cfdna12.
  25. Tekrar sütuna geri pipette ve 3 dakika oda sıcaklığında inküye.
  26. Santrifüjünü tam hızda tekrarlayın (üreticinin tavsiyesine göre), verimi artırmak için ikinci kez cfDNA 'yı 1 dakika boyunca elüt edin.
  27. CfDNA 'Yı 4 °C ' de etiketli DNase/RNase ücretsiz PCR-Clean tüplerinde saklayın veya doğrudan adım 5 ' e geçin.

5. cfDNA vakum konsantrasyonu

  1. Vakum konsantratördeki tutucuların içine eltilmiş cfDNA içeren tüpleri takın ve dengeleyin. Tüplerin kapakları açık. Vakum konsantratörün sıcaklığını 23 °C ' ye ayarlayın.
  2. Vakum konsantratörü açın, sonra buhar tuzağı açın. 40 dk veya 10.5-11 μL son hacmine kadar Santrifüjü örnekleri ulaşılır.
    1. Hacim 10,5 μL altında ise, 10,5 μL son hacmine ulaşmak için DNA süspansiyon tamponu veya MB H2O ekleyin.
  3. Kalan DNA parçalarını çıkarmak için tüpün duvarları boyunca tam hacmi pipet.
  4. Tüplerin duvarlarında damlacıklar toplamak için bir masa santrifüjinde örnekleri kısaca santrifüjler.
  5. Doğrudan ön amplifikasyon adımına (adım 8) veya 4 °C ' de depolama örneklerine geçin.
    1. Daha sonra kullanım için depolanırsa kontaminasyonu önlemek için bir laboratuar filminde tüpler kapakları sarma.

6. astar ve probların tasarımı ve hazırlanması

  1. İlgi hedef (ler) için ileri ve ters astar ve wildtype ve mutant LNA probları tasarım. Ticari olarak liyofilize astar ve problar (bkz. malzeme tablosu).
    Not: H3F3A p. K27M ve Pediatrik orta çizgi gliomlar için diğer hedef mutasyonları hedefleyen astar ve problar Için diziler Panditharatna ve ark., 20188' in tamamlayıcı tablo 3 ' te bulunabilir.
  2. Liyofilize astar ve sondaları açmadan önce, tüpleri kısaca santrifüjler. DNA süspansiyon tampon veya MB H2O uygun hacmi ekleyin, ürün spesifikasyonu sayfasında belirtildiği gibi, 100 μM konsantrasyonuna liyofilize astar ve probları yeniden pelletini.
  3. Hafifçe girdap, pipet yukarı ve aşağı birkaç kez mix ve kısaca santrifüjler ve prob kullanarak bir masa Santrifüjü.
  4. 90 μL DNA süspansiyon tamponunu veya MB H2O 'Ya 10 μl 100 μm stok ekleyerek 10 μm astar ve problar hazırlayın.
  5. 90 μL DNA süspansiyon tamponunu veya MB H2O 'Ya 10 μm astar eklenerek, 1 μm ileri ve ters astar (ön amplifikasyon için kullanılmak üzere).
  6. Astar ve sondaları hava geçirmez koyu kaplarda 4 °C ' de saklayın. Kontaminasyonu önlemek için kapaklar etrafında laboratuvar filmi Wrap ve ışığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo prob kapak. Uzun süreli depolama için-20 °C ' de düzenli olarak kullanılmakta olmayan problar saklayın.

7. pozitif kontroller seçimi

  1. Tümör dokusu genomik DNA (gDNA) numunesi (ler), bilinen bir allelik frekansdaki ilgi mutasyonunu olumlu bir kontrol olarak kullanılacak olan DNA konsantrasyonu ile seçin.
    1. Ön amplifikasyon adımında pozitif kontrol tümör dokusu DNA 'Sı 0,025 ng kullanın (adım 8).
      Not: Bu DNA girişi, dPCR üzerinde sağlam bir pozitif sinyal sağlar (gibi H3F3A p. K27M mutasyonu kullanarak tümör dokusu gdna seri dilüsyonları gerçekleştirerek belirlenir8) gerekli numune miktarını minimize ederken.

8. hedef alleles 'in ön amplifikasyonu

Not: Ön amplifikasyon Protokolü Jackson ve al., 201613' e göre.

  1. % 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tezgah alanı ve ekipman temizleyin.
  2. 1 μM ileri ve ters astar, cfDNA örnekleri, gDNA pozitif kontroller ve DNA polimeraz ana karışımı elde eder ve buzun üzerinde ayarlayın.
  3. Aşağıdaki gibi singleplex veya Multiplex önamplifikasyon için istenen sayıda cfDNA örneğini ve pozitif kontrolü önceden yükseltmek için gereken reaktiflerin hacmini hesaplayın:
    1. Singleplex ön amplifikasyon için (wildtype ve mutant alelleri 'i tek bir ilgi mutasyonu için önceden yükseltmek), 17,5 μL DNA polimeraz ana karışımı ekleyerek PCR reaksiyon karışımını hazırlayın ve örnek13başına 3,5 μL ileri ve ters astar (100 Nm) girin.
    2. Multiplex ön amplifikasyon için (iki adet wildtype ve mutant alelleri setinin iki mutasyona uğratılması için), örnek başına 17,5 μL DNA polimeraz ana karışımı ve her bir ileri ve ters astar (50 Nm) kümesi için 1,75 μL ekleyerek PCR reaksiyon karışımını hazırlayın 13olmak üzere.
      Not: numunelerin sayısı için yeterli PCR reaksiyon karışımını hazırlayın ve herhangi bir pipetleme hatası için% 10 ekstra ilave edin.
  4. 8-iyi PCR şerit tüp13her iyi içine PCR reaksiyon karışımı μl 24,5 dispense.
  5. Toplam reaksiyon hacmini 35 μL13' e getirmek Için 10,5 ΜL DNA örneğinden uygun şekilde dispense edilir. Karıştırın için tam ses seviyesini 10 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipet atın.
  6. 98 °C ' de 3 dakika boyunca PCR amplifikasyonu gerçekleştirin; 9 döngü 98 °C için 10 s, tavlama sıcaklığı 3 dakika, 72 °C için 30 s; ve 72 °C ' de 2 dk13için bir uzatma.
  7. Ön amplifikatörleşmiş ürünün tam hacmini etiketli DNase/RNase ücretsiz PCR-Clean tüplerine ve 140 μL TE DNA süspansiyon tamponunu (pH 8,0)13' te seyreltmeden aktarın.
  8. Laboratuvar filminde tüplerin kapakları sarın. Ön amplifikatörleşmiş ürünü 4 °C ' de saklayın. Uzun süreli koruma için-20 °C ' de saklayın.

9. dPCR kullanarak hedef DNA 'nın algılanması ve ölçülmesini

  1. % 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tezgah alanı ve ekipman temizleyin.
  2. 10 μM astar ve problar, Genotipleme ana karışımı ve buz üzerinde DNA örnekleri ayarlayın. Damlacık dengeleyen yağı oda sıcaklığında saklayın.
  3. Damlacık stabilize yağ dışında tüm reaktifleri yavaşça girdap ve kısaca santrifüjler.
  4. Damlacık üreten cihaza bağlı sıkıştırılmış nitrojen gaz silindirinin ve ölçüm cihazının (malzeme tablosu) 90 psi olarak ayarlandığından emin olun.
  5. Cihaz yazılımı ile damla üreten aleti ve bilgisayarı açın. Yazılımı başlatın ve başlatmayı Başlat 'ı tıklatın.
    1. Bir hafta veya daha fazla kullanılmadı Eğer damla üreten enstrüman üzerinde yüksek basınçlı floş çalıştırın.
  6. PCR şerit tüpünün 8 kuyuları için dPCR reaksiyonu karışımı artı% 10 ekstra, 220 μL Genotipleme ana karışımı ekleyerek, 8,8 μL her biri 10 μm wildtype ve mutant problar, 39,6 μL her biri 10 μM ileri ve ters astar ve 17,6 μL damlacık stabilizasyon yağı14 .
  7. DPCR reaksiyon karışımını, tam ses seviyesini yukarı ve aşağı 10-20 kez pipetleme ile nazikçe karıştırın. Reaksiyon karışımına damlacık stabilizasyon yağı eklendikten sonra Vortex veya santrifüjleme yapmayın.
  8. Bir PCR 8-kuyu şeridi tüpü alın ve 38 μL dPCR reaksiyonu karışımı doğrudan her iyi14' ün altına dağıtın. Temiz pipet ucu ile herhangi bir kabarcıklar çıkarın.
    Not: Interlocked veya sıkıca birlikte paketlenmiş PCR şerit tüpler statik elektrik şarj neden olabilir, koalescence ve gürültülü sinyal dpcr verileri analiz ederken neden. Bu önlemek için, ayrı biyotehlike torbalar içine kısım şerit tüpler, çanta aşırı paketleme önlemek ve birlikte sürtünme tüpler tutmak.
  9. PCR şerit tüpünün uygun kuyularına 12 μL preamplified DNA örneği ekleyin. Negatif denetim için 12 μL MB H2O ekleyin.
    Not: CfDNA örneklerini çoğaltılan kuyularda analiz edin. CSF için, en azından yinelenen analiz ve plazma/serum triplicate her örnek analiz.
  10. Reaksiyonunu DNA örneğiyle karıştırmak için tam ses seviyesini 10 kat yukarı ve aşağı hafifçe pipet atın.
  11. Yeni bir damlacık üreten enstrüman çipini edinin ve PCR şerit tüpünün 1-8 kuyularından tam hacmi yongalı ilgili kanallar A-H içine pipet alın. Kanalların alt kısmına pipet ucu ile dokunmaktan kaçının.
  12. Yeni bir temiz PCR şerit tüp alın ve damlacık üreten enstrüman içine takın. Tarama veya manuel cihaz bilgisayardaki yazılım içine damlacık üreten enstrüman çip KIMLIĞI girin. 8 kanalın her biri için adlar girin. Dropletizing örnekleri başlatmak için Çalıştır 'ı tıklatın.
  13. Dropletization tamamlandığında, PCR şerit tüp çıkarın ve şerit tüp kapakları uygulayın.
  14. Şerit tüpünü termal bisikletçiler ve denge ile 80 μL su içeren başka bir şerit tüpüne aktarın.
  15. Termal Bisiklet koşullarını program14 as: 95 °c 10 dk; 45 iki sıcaklık döngüsü: 95 °C 30 s ve tavlama sıcaklığı 2 dakika; 98 °C için 10 dk; ve 10 °C ' de tutun.
    1. Rampa hızını 0,5 °C/s 'ye ayarlayın ve numune hacmini 80 μL14olarak ayarlayın.
  16. Termal Bisiklet tamamlandığında, şerit tüpünü çıkarın ve ölçüm aletle aktarın. PCR şerit kapakları çıkarın ve yüksek hızlı kapaklar ile değiştirin.
  17. Ölçüm cihazı ve bağlı bilgisayarı enstrüman yazılımı ile açın. Enstrüman yazılımını başlatın ve Kur 'U Çalıştır'ı tıklatın.
  18. Şerit tüpünü ölçüm cihazının içine yerleştirin.
  19. Yeni bir ölçüm aleti çipini edinin ve çip KIMLIĞINI elle tarayın veya manuel olarak girin. Yongası makineye takın.
  20. Metal kalkanı çipin üstüne yerleştirin ve cihazın kapağını kapatın.
  21. Bilgisayar yazılımında, dPCR çalıştırmak için bir ad girin ve her biri için 8 kanal (A-H). Hızlı mod 'u seçin (yüksek hızlı kapaklar ile kullanılmalıdır) ve ölçüme başlamak için Başlat 'a tıklayın.
  22. Miktarım tamamlandığında, metal kalkanı çıkarın (kaydedilecek ve yeniden kullanılabilir) ve PCR şerit tüpünü ve çipini bertaraf edin. Enstrüman bilgisayarında, Run log her çalıştırma için sonuç dosyaları içerir. Analist yazılımıyla analiz etmek için her örnek için. FCS dosyalarını kullanın.

10. veri analizi

  1. Analist yazılımını başlatın ve ham spektral verileri çözümlemek için. FCS dosyalarını açın. Analiz görünümü altında bozulmamışöğesini seçin. Örnek görünüm altında, her kutuda onay işareti olması için 8 örneğinin yanındaki kutuları tıklatın. Yazılım, sırasıyla x ve y eksenleri boyunca mutant (FAM) ve wildtype (hex) alelleri için sinyaller çizecektir.
  2. Üreticinin talimatlarına göre, bozulmamış damlacıklar üzerinde spektral tazminat uygulamak için hesaplanan matris işlevini kullanın15.
  3. Eksen Seçenekleri altında eksen ayarlarını yapın. X ekseni en az 0 ve en fazla 30.000 ve y ekseni en az-5.000 ve en fazla 10.000 için ayarlayın. Damlacık kümeleri belirlendiğinde, grafikte boş alanı azaltmak için eksenleri ayarlayın.
    Not: Mutant ve wildtype kümeleri pozisyonu kullanılan problar bağlıdır, fluorophore ve onların konsantrasyon.
  4. Negatif (kaynak en yakın küme), mutant (x ekseni en yakın küme) ve wildtype (y ekseni için en yakın küme) kapıları ayarlamak için pozitif kontrol tümör dokusu gDNA karşılık gelen örnek seçin. Kümelerin farklı ve kolayca başarılı bir tahlil tanımlandığından emin olun.
  5. Pozitif denetim örneği üzerinde sağ tıklayarak ve tüm ayarları seçili örneklere uygulamakiçin bu seçeneği tıklatarak, pozitif denetimin kapı ayarlarını tüm örneklere uygulayın.
  6. Grafik görünümünün altında, seçili tüm örneklerin grafiklerini görüntülemek için birden çok örnek sekmesini tıklatın. Görüntüyü a olarak dışa aktarın. TıF dosyası.
  7. Ekranın sol üst kısmındaki çalışma alanı sekmesinin altında dışa aktarma çözümlemesi 'ni (CSV) seçin ve analiz edilen veri dosyasını. csv dosyası olarak kaydedin.
  8. Her örnek için negatif, joker karakter ve mutant damlacık sayılarını görüntülemek üzere elektronik tablo yazılımında. csv dosyasını açın. Kullanarak MAF hesaplayın Poisson düzeltilmiş mutant damlacık sayımı her örnek için Poisson düzeltilmiş mutant artı wildtype damlacık sayar toplamı ile.
    Not: Poisson düzeltilmiş sayımı kullanın çünkü Poisson istatistik bu gerçeği için pozitif damlacıklar hedef DNA tek bir kopyasını daha içerebilir ve böylece pozitif damlacıkları özetlemek doğru bir sayı16verim olmayabilir için hesap.

Sonuçlar

Şekil 1 ön amplifikatörleşmiş plazma (sol üst panel) ve CSF (sağ üst panel) CFDNA, dmg ile Iki çocuktan H3F3A p. K27M mutasyonu başarılı tespiti için temsili sonuçları gösterir. cfDNA örnekleri çoğalmakta analiz edildi, ancak her örnek türü için yalnızca bir temsilci grafik gösterilir. DPCR çizimleri, PCR başına 7-9 milyon damlacık (çoğu hedef DNA içermeyen negatif damlacıklar) ile başarılı damlacıklar üretimi gösterir. En az 7.000.000 damlacıkları PCR başına iyi başarılı bir dropletization gösterir, daha az 7.000.000 tahlil başarısızlık gösterir, bu durumda Kullanıcı veri analizi ile devam etmemelidir. Şekil 1 , sırasıyla x ve y eksenleri boyunca mutant ve wildtype kümeleri arasında net bir ayrım gösterir. Güçlü joker karakter kümeleri, şablon DNA 'Sı bulunduğundan cfDNA çıkarma işleminin başarılı olduğunu gösterir. Mutant kümeleri, sırasıyla plazma ve CSF örnekleri için% 1,60 ve% 39,92 ' lik bir MAF, mutasyonun olumlu algılanmasını gösteren bir gösterir. Bu hastalar için, dPCR sonuçları, biyopsi tümörü dokusu8' in genomik analizi ile teyit edilen tümör mutasyonu durumuna uygun olarak görülmektedir. Negatif kontrol (sol alt panel) 0 mutant ve 0 wildtype damlacıkları gösterir, PCR reaksiyon karışımı hiçbir kontaminasyon olduğunu belirten. Pozitif kontrol tümör dokusu gdna (sağ alt panel) seçilen belirli bir tümör örneği için beklenen allelik frekansında Saptanan mutasyonu gösterir.

Şekil 2' de, dmg ile bir çocuktan plazma cfdna 'Da, H3F3A p. K27M, ilgi mutasyonunun başarısız algılanması için temsili sonuçlar gösterilir. Mutasyon durumu, tümör dokusunun genomik analizi ile doğrulandı8. İki adet PCR kuyusundan temsili sonuçlar gösterilir (üst paneller). Negatif damlacıklar da dahil olmak üzere toplam damlacıklar sayısı, 7-9 arasında bir PCR iyi, başarılı dropletization gösteren. Y ekseni boyunca çizilen wildtype kümeleri, yaklaşık 7-8000 wildtype damlacıkları her PCR için iyi plazma cfDNA, gösteren başarılı cfDNA ekstraksiyon (örnek hedef wildtype DNA olduğu gibi) gösterir. Ancak plazma örneğinde 0 mutant damlacıkları tespit edilir. Sol alt panel negatif kontrolü gösterir (MB H2O) hiçbir wildtype veya Mutant damlacıkları ile; ve sağ alt panel pozitif mutasyon algılama ile olumlu kontrol preamplified tümör dokusu gDNA (0,025 ng) gösterir. Bu şekilde gösterildiği gibi, plazma içinde mutasyon algılama olmaması mutlaka hastanın ilgi mutasyonu için joker olduğu anlamına gelmeyebilir, yanlış negatiflerin gerçekleşmesi gibi8. Bazı durumlarda, önceden biyopsi sırasında toplanan plazmada mutasyon kaçırılarak, daha sonra aynı hastada elde edilen plazmada daha sonraki bir zaman noktasında tespit edilir8.

figure-results-1
Şekil 1 : Başarılı algılama H3F3A Orta çizgi gliomları olan çocuklardan önceden güçlendirilmiş plazma ve CSF cfDNA 'da p. K27M mutasyonu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2 : Faiz mutasyonu limanda bilinen bir hastanın ön amplifikatörleşmiş plazma cfdna numunesi analizinden elde edilen yanlış negatif sonuçlar, H3F3A p. K27M, tümör. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Burada hasta sıvı biyopsisi ile cfDNA 'daki tümör mutasyonlarının allelik sıklığını tespit etmek ve ölçmek için yöntemimizi sunduk. Ön analitik numune işleme, cfDNA ekstraksiyon, PCR tahlil tasarımı ve veri analizi de dahil olmak üzere bu yöntemin başarısı için kritik adımları vurguluyoruz. Kullanılan örnek hacmi sınırlamak için, cfDNA 1 mL plazmadan ayıklanır ancak sadece 500 μL CSF. CSF 'den çıkarılırken, 1 mL idrardan çıkarma Protokolü (cfDNA ekstraksiyon kiti el kitabı12' nin ardından), üreticinin tavsiyesine göre kullanılır. Plazma ile CSF arasında gerekli numune hacminin farkı, beyin tümörlü hastaların CSF 'ine kıyasla Plazmadaki tümör spesifik cfDNA düzeylerinden kaynaklanmaktadır, mutasyon tespiti için daha büyük numune hacimleri gerektirir8. Örnek kullanılabilir ise, daha yüksek DNA verimi üretmek için 1 mL 'den fazla plazma ayıklanabilir. Ancak, pediatrik hastalar durumunda, mümkün olduğunda kullanılan kan miktarını en aza indirmek için önemlidir, kan çekmek gibi basit bir prosedür bile radyasyon tedavileri geçiren kanserli pediatrik hastalara yorulma olduğunu. Plazma 1 ml plakaya ayıklanması da çoğaltmak ekstraksiyonları sağlar, böylece tahlil (örneğin, DNA ekstraksiyon veya örnek kontaminasyon başarısızlık durumlarında) tekrarlanabilir.

Kesinlikle gerekli olmayan herhangi bir örnek kullanımı azaltmak için bir çaba, cfDNA genellikle niceleyilmiş değildir. Bununla birlikte, sırasıyla plazma ve CSF 'de 0.2-2 ng/μL ve 0.6-13 ng/μL arasında bir dizi cfDNA konsantrasyonu bulduk. Düşük miktarda cfDNA, ve tümör spesifik mutant allel düşük bir frekanslı mevcut olduğu gerçeği, dPCR için kullanılan astar aynı kümesini kullanarak bir ön amplifikasyon adım önemli ölçüde örnek hedef DNA miktarını artırmak için gereklidir, yardım mutasyon algılama8. DNA süspansiyon tamponunda ön amplifikatörleşmiş ürünün seyreltilmesi, gerçek pozitif farklılaştırmaya yardımcı olan teknik çoğaltır için yeterli hacim sağlar. Mutant damlacıkları sayısı düşük olduğu için (örneğin, 0-2 arasında bir plazma örneğinde mutant damlacıkları arasında), teknik çoğaltır dahil mutasyon durumunu çözmek için anahtarıdır. Bir PCR iyi 0 mutant damlacıkları verebilir iken, diğer iki tek bir plazma örneği için 1-2 verim olabilir triplicate analiz; Böylece, çoğaltır eklenmesi mutasyon durumunu belirlerken daha fazla doğruluk sağlar. MAF daha sonra yineleme değerlerinin ortalaması olarak hesaplanır.

Multiplexed ön amplifikasyon (wildtype ve mutant iki mutasyon aleli önamplifikasyonu) tek bir numune yarar artırır, aynı başlangıç malzemesi iki mutasyonlar için test etmek için kullanılabilir gibi. Daha da önemlisi, bir Multiplex önamplifikasyon ürün burada açıklandığı gibi, daha fazla basitlik için dPCR sırasında singleplex içinde analiz edilebilir. Ancak, hem önamplifikasyon PCR ve dPCR Multiplexed olabilir. Multiplexing olduğunda, koşullar her iki astar ve prob setleri için optimize edilmelidir: Primer tavlama sıcaklıkları PCR amplifikasyonunda birlikte çalışmasına benzer olmalıdır ve problar farklı kümeleri oluşturmak için tasarlanmalıdır (floresan sinyaline ve yoğunluğu). Yeni bir astar ve prob kümesini doğruladıktan sonra, üreticinin önerdiği aralığa göre optimum tavlama sıcaklığını belirlemek için bir tavlama sıcaklığı degradesini çalıştırın. Hasta cfDNA örneklerinde problar test etmeden önce, farklı girişlerin sentetik DNA yapıları ve/veya tümör dokusu gDNA kullanarak bunları doğrulamak (yani, 10 ng kadar).

Daha fazla özgüllük ve hedef DNA prob hibridizasyon düşük uyuşmazlık ile mutant alelleri tespiti için, kilitli nüklenik asit (LNA) problar kullanılır. LNA 2 '-oksijen ve 4 '-riboz yüzük9karbon bağlayan bir metilen Köprüsü ile nükle asit analog. Metilen Köprüsü, nüklik asidin esnekliğini kısıtlayan, termal çift yönlü stabiliteyi artıran ve DNA 'yı hedef alan prob hybridizasyonunun özgüllüğünü geliştiren sert bir bikik konformasyona kilitler10,18, 19. Eğer bir tek temel UYUŞMAZLıĞı LNA prob ve şablon DNA arasında varsa, prob ve hedef arasında Dubleks oluşumu istikrarsızlaştıracaktır. Bu nedenle, LNA probları prob bağlamasının özgüllüğünü geliştirir ve daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı11' e neden olur. Non-CNS-hastalıklı pediatrik hastalarda plazma ve CSF Analizi H3F3A p. K27M hedefleyen LNA probları ile bizim tahlil özgüllüğü kurmuştur, eşit veya az 0,001% bir allelik frekans yanlış pozitif olarak kabul edildiğini belirlemek için 8. problar ve astar tasarımını optimize etmek için ek hususlar için, GC içeriği dahil, amplikon boyutu, Probe Reporter boyalar, ve Quenchers, dpcr üretici yönergelerine bakın14,17. Yöntemimiz RainDance sistemiyle kullanılmak üzere optimize edilse de, protokol diğer dPCR platformlarıyla kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Burada sunulan yöntem, cfDNA 'da nadir görülen tümör mutasyonları tespit etmek için tercih edilen platformda kalan dPCR tarafından elde edilen yüksek hassasiyet ve hedef zenginleştirme gücünü çizer. Güçlü olsa da, dPCR tek bir tahlil için test edilebilir mutasyonlar sayısında sınırlıdır. Bir alternatif dPCR, tek bir örnek yardımcı programını artırarak, birçok genler arasında birden çok mutasyonlar algılayabilen yeni nesil sıralama (NGS) ' dir. NGS, CSF 'de mutasyonlar algılayabilir ve beyin sapı gliomas20olan hastaların plazmasında, şu anda cfdna 'da tümör mutasyonları tespit ederken dPCR 'den daha az duyarlıdır, PCR tabanlı yaklaşımlarda% 0,001 ' e istinaden 0.1-10% MAF algılama limitleri21 . dPCR Ayrıca NGS 'den daha hızlı dönüş süresi elde ederek ilgi mutasyonlarının hızlı bir şekilde algılanmasını sağlar. PCR yaklaşımı kanser türleri arasında uygulanabilir ve HotSpot mutasyonları ve metilleştirilmiş cfDNA22algılamak için genişletilebilir.

Sıvı biyopsisi gerçekten kendi bebeklikte ve belirli hastalıklara terzilik için daha fazla gelişme gerektirecektir. Tümör gelişimi bağlamında tümör izlenmesi, yüksek hassasiyetle ortaya çıkan mutasyonları tespit edebilen bir platformun gerekli olacağını bir sonraki zorluk olacaktır. Ayrıca, çeşitli biyomoleküllerin (peptidler, sitokinler, RNA) algılayabilen platformlar, tedaviye tümör tepkisini değerlendirmede ve kişiselleştirilmiş klinik müdahalelerin ilerleyen yanı sıra son derece yararlı olacaktır.

Açıklamalar

Bu yazıda açıklanan yöntem, uluslararası bir patent başvurusu "kanser biomarkers tespiti için Yöntemler" Cavis Nazarian & Eshini Panditharatna tarafından dahildir.

Teşekkürler

Yazarlar tüm hastaların ve aileleri cömertliği kabul etmek istiyorum. Bu çalışma smashing ceviz Vakfı (Middleburg, VA), V Vakfı (Atlanta, GA), Gabriella Miller Kids Ilk veri kaynak merkezi, klinik ve translational Science Institute of Children 's National (tarafından finanse tarafından desteklenmektedir 5UL1TR001876-03), Musella Vakfı (Hewlett, NY), Matthew Larson Vakfı (Franklin Gölü, NJ), Pediatrik beyin kanseri araştırması için Lilabean Vakfı (gümüş bahar, MD), çocukluk beyin tümörü Vakfı (Germantown, MD), Çocuk beyni Tümör doku konsorsiyum (Philadelphia, PA) ve çocukluk kanseri Araştırması (Atlanta, GA) ralli Vakfı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Süspansiyon Tamponu (pH 8.0)TeknovaT0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Kan Alma Tüpleri (10 mL)Becton Dickinson Diagnostics367525Plazma toplama için
Kırmızı BD Hemogard Kapatma (10 mL) ile BD Vacutainer Plastik Serum tüpüBecton Dickinson Diagnostics367895Serum toplama için
Çamaşır suyuGenel Laboratuvar Tedarikçisi
Tamponu ATLQiagen19076
Hücresiz DNA Kan Alma TüpleriStreck218961cfDNA kan alma tüpleri (isteğe bağlı)
CentriVap KonsantratörLabconco7810010
İleri PrimerEntegre DNA Teknolojileri, Inc.Özel tasarım
MiniAmp Termal DöngüleyiciThermofisher ScientificA37834
Moleküler Biyoloji Sınıfı Mutlak Etanol (200 kanıt)Genel Laboratuvar Tedarikçisi
Mutant ProbEntegre DNA Teknolojileri, Inc.Özel tasarım
PAXgene Kan ccfDNA tüpleriPreAnalytiX768115cfDNA kan alma tüpleri (isteğe bağlı)
PCR 8 kuyulu şerit tüp kapaklarıVWR10011-786
PCR 8 kuyulu şerit tüplerAxygenPCR-0208-C
Pipet (p20, p200, p1000)Genel Laboratuvar Tedarikçisi
Pipet filtre uçları (p20, p200, p1000)Genel Laboratuvar Tedarikçisi
Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakatli 2x Master MixNew England Biolabs IncM0494S
QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asit El Kitabı QiagencfDNA ekstraksiyon kiti el kitabı (2013 baskısı)
QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asit KitiQiagen55114cfDNA ekstraksiyon kiti (Protokol Adımı 4) 
QIAamp MinElute Virüs Döndürme KitiQiagen57704Küçük (< veya =200 &mikro; L) numune hacimleri
Qiavac 24 PlusQiagen19413QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asitler kiti ile kullanım için
Raindance Sarf Malzemesi KitiBio-Rad20-04411Damlacık üreten cihaz çipleri, miktar tayin cihazı çipleri, yüksek hızlı kapaklar dahil PCR şerit kapakları ve damlacık stabilize edici yağ içerir
Raindance Sense CihazıBio-RadMiktar Tayin cihazı ( Protokol Adımı 9)
Raindance Kaynak CihazıBio-RadDamlacık üreten cihaz (Protokol Adım 9'da kullanılır)
RainDrop Analyst II YazılımıRainDance TechnologiesAnalist yazılımı (Protokol Adım 10)
Soğutmalı Buhar TuzağıSavantRVT5105-115
Ters PrimerEntegre DNA Teknolojileri, Inc.Özel tasarım
Smartblock 2 mLEppendorf05 412 506
TaqMan Genotipleme Master MixThermofisher Scientific4371353
Thermomixer CEppendorf14 285 562PM
WT ProbuEntegre DNA Teknolojileri, Inc.Özel tasarım
Veri Analizi için kullanılan

Kaynaklar

  1. Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
  2. Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
  3. Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
  4. Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21(2017).
  5. Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14(2017).
  6. Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64(2018).
  7. Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951(2017).
  8. Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
  9. Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
  10. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
  11. Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81(2012).
  12. Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257(2013).
  13. Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
  14. Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
  15. Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
  16. Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617(2017).
  17. Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
  18. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
  19. Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
  20. Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
  21. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
  22. Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hücre Dışı DNADijital PCRMutasyon TespitiTümör GenotiplemesiBiyoakışkan AnaliziAlel FrekansıSpektral KompanzasyonDamlacık KantifikasyonuBoylamsal İzleme
Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.