İnsan İdrar Türemiş Hücrelerden Elde Edilen Doğrudan Yeniden Programlanmış Miyotüplerde Ekson Atlama

Özet

Bu makalede, distropin mRNA ve protein düzeylerinin ekson atlama dan sonra restorasyon değerlendirmek için MYOD1-dönüştürülmüş idrar türetilmiş hücreleri kullanarak Duchenne musküler distrofi kasının verimli modelleme için ayrıntılı bir protokol açıklanır.

Özet

Duchenne musküler distrofi (DMD), ilerleyici ve ölümcül kas hastalığı, distrofin proteinyokluğunda sonuçlanan DMD geni mutasyonlar neden olur. Bugüne kadar, exon-53 atlama eğilimli morfolino oligonükleotidlerin sistemik enjeksiyondayalı Ulusal Nöroloji ve Psikiyatri Merkezi'nde bir araştırmacı başlatılan ilk-in-insan çalışmasını tamamladık. DMD'nin etkili tedavisi için, dmd hastalarından elde edilen miyoblastlarla in vitro testin, klinik deneylere başlamadan önce ilaçları taramak ve hasta yada uygunluğunu değerlendirmek için gerekli olduğu düşünülmektedir. Çok yakın zamanda, yeni bir MYOD1dönüştürülmüş idrar türetilmiş hücre (UDC) histon metiltransferaz inhibitörü ile tedavi (3-deazaneplanocin A hidroklorür), DMD hücresel bir model olarak bildirdi. Yeni otolog UDC, DMD'nin hastalığa özgü fenotiplerinin fenokopisini gösterebilir ve bu da kasla ilgili çeşitli hastalıklarda hassas tıbbın uygulanmasına yol açabilir. Bu makalede, myod1-dönüştürülmüşUDC'ler ile ters transkripsiyoner polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), Batı lekeleme ve immünositokimya kullanılarak distropin mRNA ve protein düzeylerinin ekson atlama dan sonra restorasyonu değerlendirmek için dmd kas hücrelerinin verimli modelleme için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

Giriş

Duchenne musküler distrofi (DMD), ilerleyici, ölümcül kas hastalığı, distropin protein^ihsızneden DMD geninde çerçeve-shift mutasyonlar neden olur 1 . Antisense oligonükleotid bazlı ekson atlama tedavisinin DMD için umut verici olduğu düşünülmektedir. Bu tedavi, dmd okuma çerçevesi²geri yüklemek için pre-mRNA splicing değiştirerek hafif Becker kas distrofisi benzeri fenotip için şiddetli DMD fenotip dönüşüm dayanmaktadır. Yakın zamanda, DMD'de exon 53 atlayarak ekson 53'ü tetiklenebilen fosforodiyamidate morphololo oligomer (PMO) viltolarsen'in tekrarlanan intravenöz uygulamasına dayanan ilk insan içi çalışmayı tamamladık ve mükemmel bir güvenlik profili, umut verici etkinlik ve kabul³edilebilir farmakokinetik parametreler (UMIN olarak kayıtlı: 000010964 ve ClinicalTrials.gov: NCT02081135) gösterdik.

Ancak, hastalık için uygun maliyetli ve etkili tedaviler geliştirmek için, DMD hastalarından elde edilen primer kas hücreleri kullanılarak in vitro testler ilaç taraması ve klinik çalışmalar üstlenmeden önce hasta uygunluk doğrulama için gerekli olan, yanı sıra insan deneyleri sırasında ekson atlama tedavilerin etkinliğini yansıtan biyobelirteçler⁴. Çok yakın zamanda, hastaya özgü MYOD1-dönüştürülmüşidrar türetilmiş hücreleri (UDCs)^5,,6 DMD⁷birincil miyoblast modeli olarak geliştirmek için yeni bir teknoloji bildirdi. Bu nedenle, miyoblastlar oluşturmak için, hastalardan idrar sadece toplama gereklidir ve hiçbir invaziv prosedür gereklidir. Bu makalede, ekson atlama dan sonra geri yüklenen distrofin mRNA ve proteini değerlendirmek için 3-deazaneplanocin A hidroklorür ile tedavi edilen MYOD1dönüştürülmüş UDC'ler kullanılarak DMD kasının etkin modellemesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Protokol

Ulusal Nöroloji ve Psikiyatri Merkezi Etik Komitesi bu çalışmayı onayladı (onay kimliği: A2017-018, A2018-029). Tüm bireyler idrar sağlamadan önce bilgilendirilmiş onay verdi. Tüm deneyler ilgili yönerge ler ve yönetmelikler altında gerçekleştirilmiştir.

1. UDC'lerin izolasyonu ve birincil kültürü

NOT: UDC'ler daha önce yayınlanmış bir protokol^8,9,10 bazı değişiklikler ile göre izole edildi.

1. Sterilize plastik şişelerde spontan micturition sırasında idrar örnekleri toplamak.
   NOT: Dış üretral deliğin sterilizasyonu gerekli değildir. Midstream idrar viral kontaminasyon riskini azaltmak için arzu edilir. Bir sonraki işlemden önceki stok süresi >1 saat ise, hücrenin canlılığını korumak için idrar örnekleri 4 °C'ye aktarılmalıdır. Ancak,çözünmez çökeltiler ortaya çıkabileceğinden <4 °C sıcaklıktan kaçınılmalıdır.
2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g tüm idrar numunesini santrifüj.
3. Süpernatant aspire, tüp içinde 1 mL bırakarak.
4. Kalan 1 mL idrarda peletleri ayrı ayrı askıya alın ve bunları tek bir 50 mL tüpte toplayın.
5. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 99 mL PBS, %1 penisilin/streptomisin (P/S), 0,5 g/mL amphotericin B'den oluşan 10 mL yıkama tamponu ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edin.
6. Tüpte 0.2 mL bırakarak süpernatant aspire.
7. Sodyum pirüuvat ve Ham'ın F-12 besin karışımı rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin ile desteklenen yüksek glikoz Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) bir 1:1 karışımı oluşan birincil orta 4,5 mL hücre peletre resuspend, hidrokortizon, epinefrin, T3, transferrin, %10 tetrasikliniçermeyen fetal sığır serumu (FBS), %1 P/S ve 0.5 μg/mL amphotericin B.
8. Jelatin kaplı altı kuyu plakası (her kuyunun toplam hacmi, 1,5 mL) üç kuyuda hücreleri tohum. Kültür 37 °C'de nemlendirilir ve %5 CO₂ 24 saat nemlendirilir.
9. Sonraki 3 gün boyunca birincil ortam adedinin 1,5 mL'sini ekleyin.
10. 4. günde, rekombinant insan EGF ile takviye büyüme ortamı 1.5 mL ile orta değiştirin, insülin, hidrokortizon, epinefrin, T3, transferrin, 15% tetrasiklin içermeyen FBS, 0.5% L-alanin-L-glutamin, 0.5% esansiyel olmayan amino asitler, ve 2.5 ng/ mL fibroblast büyüme faktörü-temel (bFGF), rekombinant insan trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), EGF, ve 1% P/S.
11. Büyüme ortamını her gün değiştirin.
    NOT: UDC kolonileri bir hafta içinde görünür.
12. UDC kültürü %80−90 konflufluent olduğunda, pbs ile orta ve yıkama hücreleri çıkarın, tüm hücreleri bölmek 0.25% tripsin-EDTA ve tohum 3.000-5.000 hücreleri / cm² yeni bir jelatin kaplı 60 mm çanak üzerine (geçiş 1).
    NOT: UDC'ler sıvı nitrojende depolanabilir. UDC'ler genellikle 60 mm kültür çanasında %60−70 birleşme yle üç stok tüpe ayrılır.

2. Retroviral yapı

1. POLIMERaz zincir reaksiyonu (PCR) ile MYOD1 (NM_002478.4) plazmidinin kodlama bölgesini yükseltin.
   NOT: MYOD1 amplifikasyonu için karışım ve termal döngücü için koşullar sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'degösterilmiştir.
2. MYOD1 dizisinin başarıyla yükseltilmelerini doğrulamak için amplifiye edilmiş PCR ürününün 1 μL'sini kullanarak yaklaşık 1.000 bp boyutunda tek bir bandı %0,7 agarose jel elektroforezi tespit edin.
3. Temizleme kitini kullanarak PCR ürününü temizleyin ve konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile belirleyin.
4. Karışımı, bir gecede 37 °C'de Tablo 3'te gösterildiği gibi, birden fazla klonlama bölgesinde enzim hedefli restriksiyon bölgelerinde tet-on sistemi ve püromisin dirençli genile retroviral vektörü sindirmek için kuluçkaya yatırın.
5. Retroviral vektörün başarılı bir şekilde sindirilmiş olduğunu doğrulamak için sindirilmiş ürünün 1 μL'sini kullanarak tek bir bandı %0,7 oranında agarose jel elektroforezi saplayın.
6. Sindirilmiş ürünü temizleme kitini kullanarak temizleyin ve spektrofotometre ile konsantrasyonunu belirleyin.
7. Güçlendirilmiş MYOD1 parçasını (2.1−2.3 adımla üretilen) sindirilmiş retroviral vektöre klonlamak için (2.4−2.6 adımlarında üretilen) füzyon içi klonlama reaksiyonu gerçekleştirin. Tablo 4'tegösterildiği gibi reaksiyonu ayarlayın, 50 °C'de 15 dakika boyunca reaksiyonuyguluyorve sonra buza yerleştirin.
8. Üreticinin talimatlarına göre E. coli yetkili hücreleri kullanarak dönüşüm gerçekleştirin(Malzeme Tablosu).
9. 10 g/L bacto tripto tripto, 5 g/L bakto maya ekstresi, 5 g/L NaCl, 15 g/L bacto agar ve 50 mg/L ampisilinden oluşan lb kültür plakası üzerinde kültür oluşturarak dönüştürülmüş yetkili hücreleri seçin.
10. LB kültür ortamında seçilen koloni ve kültürü bir gecede 37 °C'de 200 rpm'de bacto agar olmadan alın.
11. PLAzmid saflaştırma kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak MYOD1-intaklanmışretroviral vektörleri arındırın ve spektrofotometre kullanarak ölçün.
12. MYOD1'in, eklenen MYOD1 dizisi boyunca her iki tarafta da hedeflenen ileri ve ters astarlar tarafından yükseltilen PCR ürününün doğrudan sıralanmasıyla retroviral vektöre doğru şekilde yerleştirildiğinden onaylayın.
    NOT: FÜZYON klonlama başarılı olduğunda MYOD1 dizisi retroviral vektör dizileri arasında sıkışmış olarak saptayabilir.
13. Retroviral üretim için, 10 cm kollajen kaplı plakalar ve DMEM'de %10 FBS nemlendirilmiş %10 FBS ve 24 saat için %5 CO₂ ile 50.000 hücre/cm^2'de ambalaj hücrelerini tohumlayın.
14. Ambalaj hücreleri %80 biraraya geldiğinde, 30 μg MYOD1-insertliretroviral vektörleri, 30 g ambalaj vektörünü ve hücre delici peptid(Malzeme Tablosu)içeren transfeksiyon reaktifini girdap yaparak karıştırın ve 10 dakika kuluçkaya yatırın.
15. 37 °C ve %5 CO_2'denemlendirilmiş ambalaj hücreleri ve kültür ortamına kuluçkaya yatan karışımı ekleyin.
    NOT: Kollajen kaplama gereklidir. Transfeksiyon tohumlamadan sonra 24 saat veya daha fazla olabilir, çünkü paketleme hücreleri kültür plakasından kolayca çıkar.
16. 4 saat veya bir gecede sonra, taze büyüme orta orta değiştirin.
17. Viral supernatant toplamak ve cotransfection sonra 24 ve 48 h taze orta ile değiştirin ve supernatant birleştirir.
18. Viral supernatant konsantre etmek için, konsantratör reaktif ve inkübat ile karıştırın 37 °C gecede, sonra 4 °C 45 dakika için 1.500 x g santrifüj.
19. Retrovirüs supernatant'ı 0,45 m'lik gözenekler ile pvdf filtreden filtreleyin.
20. Üreticinin talimatlarına göre nicel PCR kiti ve termal çevrim sistemi kullanarak retroviral vektörtt kontrol edin.
21. Viral supernatant'ı küçük aliquotlara bölün ve -80 °C'de stoklayın.

3. UDC'lerde MYOD1-retroviral vektör ile enfeksiyon

1. 3.000-5.000 hücre/cm^2'de UDC'leri jelatin kaplı 60 mm çanak üzerine tohumlayın.
2. 24 saat tohumlamadan sonra, 8 μg/mL konsantrasyonda hekzadimethrine bromür ekleyerek 200 enfeksiyon çokluğu yla çözülmüş retrovirüse (adım 2.21) bulaştırın.
3. 37 °C ve %5 CO_2'denemlendirilmiş 24 saatlik bir kuluçkadan sonra, MYOD1transduced hücreleri seçmek için kültür ortamını 1 μg/mL puromisin içeren taze büyüme ortamıyla değiştirin. Her gün orta değiştirin.
   NOT: MYOD1-pozitif hücreler seçilirken genellikle 1 μg/mL puromisin kullanılır. Uygun doz belirlenmelidir. Transfected olmayan hücreleri içeren bir plaka kullanın ve 3−5 gün içinde tüm hücreleri öldürür dozu seçin. MIOD1-pozitif hücreler puromisin ekledikten sonra 7−10 gün içinde seçilmelidir. MYOD1transduced UDC'ler sıvı nitrojende depolanabilir.

4. 3-deazaneplanocin A hidroklorür (DZNep) ile tedavi edilen MYOD1-transjenes UDC'lerin miyojenik farklılaşması

NOT: Son zamanlarda, bu DZNep bildirilmiştir, bir histon metiltransferaz inhibitörü, önemli ölçüde MYOGENINekspresyonu teşvik edebilir , geç kas düzenleyici faktörlerden biri, ve aynı zamanda myotube farklılaşma^{yol 7}.

1. 3,5 x 10⁴ hücre/cm²yoğunlukta kollajen kaplı kuyularda PLAKA MYOD1-transdükse UDCs . Kültür 37 °C ve %5 CO_2'denemlendirilir.
2. 24 saat sonra, l-alanin-L-glutamin, %5 at serumu, ITS takviyesi, 1 μg/mL doksisiklin ve 5 μM DZNep ile yüksek glukozlu DMEM'den oluşan büyüme ortamını farklılaştırma ortamına değiştirin.
   NOT: 10 mM DZNep çözeltisi -80 °C'de 3 ay saklanabilir. Bir buz çözme dondurucu kullanın ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri kaçının. Hem MYOD1 doksisiklin ve DZNep ile aktive proliferasyonu bastırmak ve UDCs miyojenik farklılaşması teşvik. Bu nedenle miyojenik farklılaşmain indüksiyonundan sonra doksisiklin ve DZNep eklenmesi önerilir. DZNep, MIYoD1-UDC'lerin doza bağımlı bir şekilde miyojenik farklılaşmasını teşvik eder. Öte yandan, yüksek konsantrasyonda sitotoksisite gösterir. Bu nedenle, miyojenik farklılaşma ve hücresel biyoyararlanım üzerindeki etkilerine bağlı olarak 1−10 μM arasında değişen Uygun DZNep konsantrasyonunu belirleyin.
3. 3 gün sonra, DZNep olmadan taze diferansiyasyon ortamıiçin farklılaşma ortamını değiştirin. Daha sonra, her 3 günde bir orta değiştirin.
   NOT: UDC'ler birbiriyle kaynaşır ve farklılaşmadan sonraki 1−2 hafta içinde miyotüpler oluştururlar.

5. MYOD1dönüştürülmüş UDCs exon atlama

NOT: Burada, hasta kaynaklı hücrelerde ekson atlamadeğerlendirmek için üç protokol açıklanmıştır: 1) ters transkripsiyoner polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) distrofin mRNA; 2) Batı leke tarafından geri distrofin protein sinyali semiquantification; ve 3) immünositokimya ile geri distrofin floresan sinyalinin yarı quantification. Tüm yöntemler doza bağımlı bir şekilde ekson atlama tespit edebilirsiniz.

1. RT-PCR ile ekson atlama verimliliğinin değerlendirilmesi
   1. Farklılaşmadan sonra 7 gün dmd hastalarından alınan MYOD1dönüştürülmüş UDC'lere transfekt antisense oligonükleotid (ASO) transfeksiyon için, ASO, transfeksiyon reaktifini(Malzeme Tablosu)karıştırın ve diferansiyasyon ortasını 1−10 μM'lik son konsantrasyona kadar_{karıştırın.}
   2. ASO ile 72 saat kuluçkadan sonra, ASO olmadan ortayı taze farklılaşma ortamına değiştirin.
   3. ASO transfeksiyonundan 3−7 gün sonra, farklılaşma ortamını çıkarın ve PBS ile 1x yıkayın. Hücre lisis tamponu ekleyin, UDCs lyse ve bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak toplam RNA hasat.
   4. RNA konsantrasyonu spektrofotometre ile ölçün.
   5. PcRtüplerinde tek adımlı RT-PCR reaksiyonu için gerekli reaktifleri Tablo 5'e göre birleştirin.
   6. PCR tüplerini karışımla birlikte bir termocycler yerleştirin. Tablo 6'yagöre termocycler çalıştırın.
   7. Mikroçip elektroforezini gerçekleştirin ve aşağıdaki gibi azı yağı konsantrasyonu kullanarak ekson atlama verimliliğini hesaplayın.
      Exon atlama verimliliği (%) = atlanan bant / (atlanan bant + atlanan bant) x 100
      NOT: PCR ürünlerini kısa süreli depolama için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de buzdolabında saklayın.
2. Batı lekeleme ile ekson atlama sonrası distrofin tespiti
   1. Transfect ASO ve kültür MYOD1-UDCs adımları 5.1.1 ve 5.1.2 göre.
   2. Ortamı her 3 günde bir değiştirin.
   3. 2 haftalık farklılaşmadan sonra, proteaz inhibitörleri içeren radyoimmünopreyağış (RIPA) tamponunu kullanarak kültürhücrelerinden toplam proteini ayıklayın.
   4. 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'de buz ve santrifüj üzerindeki lysates sonicate.
   5. Supernatant toplamak ve bir BCA protein tsay kiti kullanarak protein konsantrasyonlarını belirlemek.
   6. 0,5 mL'lik bir tüpe 15 μg toplam protein ekleyin ve proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu 10 μL'lik toplam hacme ekleyerek seyreltin.
   7. Tablo 7'degösterildiği gibi örnek arabellek, azaltıcı madde ve deiyonize su ekleyin. Hücre nin 10 dk boyunca 70 °C'de demesi.
   8. 8.95 g/L trisin, 6.06 g/L tris baz, 1.0 g/L sodyum dodecyl sülfat (SDS) içeren tris-asetat çalışan tamponu hazırlayın.
   9. Numuneyi (20 μL) tris-asetat %3−8 jel üzerine yükleyin ve 150 V'da 75 dakika elektroforez uygulayın.
   10. Metanol olmadan leketampon hazırlayın.
   11. PVDF membranı 20 s metanolde ve daha sonra kullanıma kadar (en az 10 dk) blottamponuna batırın. Mini jeller ve midi jeller kullanarak 8 x 12 cm kullanarak 6 x 8 cm boyutunda PVDF membran kesin.
   12. Blotlama kağıtlarını PVDF membranınkiyle aynı boyutta kesin ve kullanıma kadar bu lekeleri tamponunda bekletin.
   13. Elektroforezden sonra, jeli PVDF membranınkiyle aynı boyutta kesin ve jeli distile suda ıslatın.
   14. Lekeleme kağıtlarını, PVDF membranı ve jeli yarı kuru transfer aparatı üzerine yerleştirin(Şekil 1). 30 dk için 4 mA/cm^2'de aktarın.
   15. Membranı 2x distile suyla durulayın.
   16. Birincil antikorlar olarak anti-distrofin (1:500) ve anti-α-tubulin (1:1.200) antikor hazırlayın.
   17. HrP konjuge anti-fare antikor (1:100) ikincil bir antikor olarak hazırlayın.
   18. Membranları birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın, yıkama tamponuyla yıkayın, ardından oda sıcaklığında otomatik bir Batı işleme cihazı(Malzeme Tablosu)kullanarak ikincil antikorla kuluçkaya yatırın.
       NOT: Anti-α-tubulin antikor genellikle yükleme kontrolü olarak kullanılır. 1:500 anti-distrofin ve 1:1.200 anti-α-tubulin antikorları dahil olmak üzere karışık primer antikor solüsyonlar, antikor reaksiyonu aynı anda yapıldığında iyi çalışır.
   19. Membranı distile suda durulayın.
   20. Kemilüminesans algılama reaktifi ve şarj-coupled cihaz (CCD) kamera tabanlı görüntüleyici kullanarak proteinleri algılayın.
   21. Verileri uygun yazılımı kullanarak analiz edin.
3. İmmünositokimya ile ekson atlama sonrası distrofin insaptama
   1. UdC'leri 4.1−4.3 adımlarına göre kollajen kaplı 96 kuyu plakalı miyotubelara doğrudan yeniden programlayın.
   2. 5.1.2 ve 5.1.3 adımlarına göre ASO ve kültür MYOD1-UDC'leri transfect.
   3. 2 haftalık farklılaşmadan sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit le düzeltin.
   4. MYOD1-UDC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1 nonionic deterjanda geçirin ve 37 °C'de 15 dakika boyunca %10 keçi serumu olanlara bloke edin.
   5. Hücreleri bir gecede 4 °C'de birincil antikorla kuluçkaya yatırın.
   6. Hücreleri PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ikincil antikoriçerenleri kuluçkaya yatırın.
      NOT: Burada fare anti-distrofin (1:30) birincil antikor olarak kullanılır, anti-fare IgG ikincil antikor olarak kullanılır ve Hoechst (1:10.000) çekirdek boyama için kullanılır.
   7. Plakaları floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin ve aynı durumda her kuyuda floresan sinyalini otomatik olarak yarı ölçmek için bir analizör kullanın.

Sonuçlar

UdC'leri kolayca ve invaziv olmayan bir şekilde toplayabiliriz. ÜUD'ler birincil hücre kültürüne başladıktan sonra bir hafta içinde koloniler oluşturdular belirgin bir proliferatif yetenek gözlemledik. UDC kültürü basitti ve prosedür doğru yapıldığında bakteriyel veya mantar kontaminasyonu nadirdi.

Şekil 2, udc kolonisinin birincil kültürden(Şekil 2A)ve MYOD1-UDC'lerden bir hafta sonra farklılaşmadan bir hafta sonra temsili faz-kontrast görüntülerini gösterir (Şekil 2B). Şekil 3, RT-PCR ile DMD hastalarından elde edilen UDC'lerde ekson atlamanın başarılı saptanmasıdır. Şekil 3A, DMD geninde 45-54 deletion olan 6 yaşındaki bir erkekten elde edilen DZNep-treated MYOD1-UDC'lerde antisense oligonükleotid tedavisinden sonra distrofinin RT-PCR analizini göstermektedir. Açık okuma çerçevesi exon 44 atlama ile restore edildi. 14. gün farklılaşmayı takiben, ekson atlanmasının doza bağımlı bir şekilde indüksiyonunu doğruladık(Şekil 3B). Üst bantlar yerel ürünleri, alt bantlar ise açık okuma çerçevesini geri yükleyen ekson 44 atlanan ürünleri gösterir.

Şekil 4, DMD hastalarından alınan UdC'lerde doza bağımlı bir şekilde Western bloting ile ekson atlayış tan sonra distrofinin başarılı saptanması dır. Ayrıca immünositokimya kullanarak geri yüklenen distrofin ekspresyonunu tespit ettik(Şekil 5). 96 kuyu plakasında ki antisense oligonükleotit (ASO) transfeksiyonundan 1 hafta sonra distrofinin yoğunluklarını floresan mikroskopla ölçtük(Şekil 5A). ASO ile tedavi edilen MYOD1-UDC'lerde kontrol ASO ile tedavi edilen MYOD1-UDC'lere göre belirgin olarak daha yüksek floresan sinyalleri gözlenmiştir (Şekil 5B).

Bu sonuçlar, yeni tahkizimizin mRNA ve protein düzeyinde DMD hastalarından elde edilen MYOD1-UDC'lerde ekson atlamayı etkin bir şekilde değerlendirebileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Yarı kuru Batı lekesi için transfer yığınının şematik gösterimi. Leke tamponuna batırılmış iki kağıt negatif terminale serildi ve tampona batırılmış iki kağıt bunun üzerine yığıldı. Tampon da ıslatılmış olan jel, PVDF membran Üzerine hafifçe döşendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: UDC'lerin temsili görüntüleri. (A) ÜDC'lerin birincil kültürden bir hafta sonra faz kontrastlı görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200 μm. Inset: Beyaz dikdörtgendeki alanın büyütülmüş görüntüsü. (B) MyOD1-UDC'lerin farklılaşmadan bir hafta sonra faz kontrastlı görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Takizawa ve ark.^7'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: RT-PCR ile DMD hastalarından elde edilen idrardan türetilmiş hücrelerde (UDC) ekson atlamanın başarılı değerlendirilmesi. (A) 3-deazaneplanocin A hidroklorür (DZNep)-tedavi MYOD1-UDCs Duchenne musküler distrofi (DMD) bir exon 45-54 deletion ile hasta elde antisense oligonükleotid tedavisi sonrası distrofin RT-PCR analizi. DZNep ile tedavi edilen MYOD1-UDC'ler de kontrol olarak 1-10 μM konsantrasyonda kontrol antisense'i ile tedavi edildi. Üst bantlar okuma çerçevesinin dışında kalan atlanmamış ürünlerdi (Ex 45-54 silme). Alt bantlar açık okuma çerçevesini geri yüklenen exon 44-atlanan ürünler (Ex 44-54 silme ve Ex 44 atlandı) idi. (B) Atlama verimi mikroçip elektroforezi sistemi kullanılarak (ekson 44 atlanan transkript mularitesi)/(yerli + ekson 44 atlanan transkript azı doraketi [oklarla işaretlenmiş]) x 0 olarak hesaplandı. Tek yönlü ANOVA bonferroni sonrası hoc testi atlama verimliliği (n = 3 her grup için, ****P < 0.0001) karşılaştırmak için kullanılmıştır izledi. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Bu rakam Takizawa ve ark.^7'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: DMD hastalarından elde edilen idrardan türetilmiş hücrelerde (UDC) ekson atlanmasının Batı lekeleri ile başarılı bir şekilde değerlendirilmesi. (A) DZNep ile tedavi edilen MYOD1-UDC'lerde distropin için temsilci Western lekesi dinson 44 atlayıştan sonra ekson 45-54 deletion ile. Distrofin tespiti için anti-distrofin (C-terminaline karşı) kullanıldı. (B) Α-tubulin ekspresyonuna normalleştirilen bantların göreceli yoğunlukları, antisense oligonükleotid tedavisi olan ve olmayan hasta kaynaklı hücrelerde tek yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni'nin post hoc testi (n = 3 her grup için, **P < 0.01, ***P< 0.001, HI = sağlıklı birey) gerçekleştirerek karşılaştırıldı. Bu rakam Takizawa ve ark.^7'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: DZNep ile tedavi edilen MYOD1-UDC'lerde antisense oligonükleotid tedavisinden sonra distrofin için immünositokimyanın ısı haritaları 45-54 deletion ile DMD hastasından elde edilir. (A) Exon 45-54 silme exon 44 ekson atlama dayalı açık okuma çerçevesi restore. (B) Sinyal yoğunluğu, 96 kuyu plakası üzerinde 1 haftalık antisense oligonükleotid transfeksiyonundan sonra floresan mikroskop kullanılarak ölçüldü. Karşılaştırma için bonferroni sonrası hoc testi (her grup için n = 3-4, ****P < 0.0001) tek yönlü ANOVA kullanılmıştır. Bu rakam Takizawa ve ark.^7'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reaktif	Birim	Son konsantrasyon
2x PCR premix	12,5 μL	1 x
İleri astar	5 pmol	0,2 μM
Ters astar	5 pmol	0,2 μM
Şablon	80 ng
Sterilize distile su	25 μL'ye kadar
Reaksiyon başına toplam hacim	25 μL

Tablo 1: RT-PCR ile MYOD1 amplifikasyonu için karışım.

98 °C	10 s
55 °C	10 s	} 35 döngü
72 °C	10 s

Tablo 2: MYOD1 amplifikasyonu için termal döngücü için koşullar.

Reaktif	Birim
10x K arabellek	2 μL
Retroviral vektör (500 ng/μL)	2 μL
Restriksiyon enzimi 1 (2−15 U)	1 μL
Restriksiyon enzimi 2 (2−15 U)	1 μL
Sterilize distile su	14 μL
Toplam hacim	20 μL

Tablo 3: Retroviral vektörü sindirmek için bir tüp için karışım.

Reaktif	Birim
Arındırılmış MYOD1 parçası	100 ng
Sindirilmiş retroviral vektör	100 ng
5x Enzim premixi	4 μL
Sterilize distile su	20 μL'ye kadar
Toplam hacim	20 μL

Tablo 4: Füzyon içi klonlama reaksiyonu için karışım.

Çözüm	Hacim/Reaksiyon (3L)	Son konsantrasyon
RNase içermeyen su	Değişken	-
Tek adımlı RT-PCR arabelleği	4	1 x
dNTP karışımı (her dNTP'den 10 mM içeren)	0.8	Her dNTP'nin 400 mM
İleri astar (10 mM)	1.2	0,6 mM
Ters astar (10 mM)	1.2	0,6 mM
Tek adımlı RT-PCR enzim karışımı	0.8	-
RNase inhibitörü (isteğe bağlı)	Değişken	5−10 adet/reaksiyon
Şablon RNA	50−400 ng
Toplam hacim	20

Tablo 5: Tek adımlı RT-PCR'nin bir reaksiyonu için gerekli bileşikler.

1 döngü	Ters transkripsiyon	30 dk	50 °C
1 döngü	İlk PCR etkinleştirme adımı	15 dk	95 °C
1 döngü	Denatürasyon	1 dk	94 °C
	Tavlama	1 dk	60 °C
	Uzantısı	1 dk	72 °C
1 döngü	Son uzatma	7 dk	72 °C
Tutun		∞	4 °C

Tablo 6: Tek adımlı RT-PCR için Termal döngü durumu.

Reaktif	Birim
Protein (15 μg)	10 μL
Örnek arabellek (4x)	5 μL
Azaltma aracı (10x)	2 μL
Deiyonize su	3 μL
Toplam hacim	20 μL

Tablo 7: Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için numune lerin hazırlanması.

Tartışma

Burada DMD hastalarından elde edilen MYOD1dönüştürülmüş UDC'lerde ekson atlamanın ayrıntılı bir protokolünü açıklıyoruz. Araştırma sistemini kullanarak, en iyi antisense dizilerini verimli bir şekilde taradık. MYOD1'edönüştürülmüş UDC'lerin hastalığın patofizyolojisinin araştırılmasında yararlı olabileceğini varsayıyoruz.

MRNA düzeyinde hasta kaynaklı hücreler kullanılarak ekson atlanmasının değerlendirilmesi, yeni ilaçların taranması ve klinik çalışmalara başlamadan önce hastanın uygunluğunun değerlendirilmesi için vazgeçilmezdir. Ekson atlama veriminin hesaplanması sadece mRNA düzeyinde değerlendirilebilir.

Distrofin restorasyonek ekson atlama faydalarını tahmin etmek için bir vekil biyomarker olarak önemlidir, çünkü protein düzeyinde ekson atlama ekson atlama değerlendirilmesi de önemlidir. Bugüne kadar, antisense oligonükleotid dizilerinin taranması genellikle birincil kas hücre hatları veya insan rabdomiyosarkom (RD) hücreleri de dahil olmak üzere ölümsüzleştirilmiş miyoblast hücre hatları kullanılarak yapılır, ancak bu proteini endojen bir şekilde ifade ettikleri için kas hücresi hatları veya RD hücre hatları kullanarak distrofin düzeylerinin iyileşmesini ölçemeyiz. DMD hasta kaynaklı MYOD1-UDC'lerde distrofin restorasyonunun doza bağlı bir şekilde tespit edilebilmektedir. Yeni telimizde, geri yüklenen proteinin Batı lekeleme ile değerlendirilmesinin ölçülebilirlikaçısından üstün olduğunu düşünüyoruz. Öte yandan, 96 kuyu plakası kullanılarak immünositokimya ile değerlendirilmesi aynı anda birçok aday bileşiklerin taranması için idealdir.

Bu makalede, MYOD1-dönüştürülmüşUDC'ler ile birlikte RT-PCR, Western blotting ve immünositokimya kullanılarak mRNA ve protein düzeylerinde geri yüklenen distrofinin ekson atlamadan sonra yeniden distropimi değerlendirmek için etkili bir modelleme DMD kas için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. UDC'ler invaziv olmayan ve kolay bir şekilde toplanabilir. Bu nedenle, kas bozukluklarının türüne bakılmaksızın, yepyeni in vitro tsay'ın çok çeşitli temel ve çevirisel çalışmalara uygulanabileceğini varsayıyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 1 P / S Çözelti Stabilize	Termo Fisher	15070-063	Hücre kültürü
Amfoterisin B	Sigma Aldrich	A2942
Anti-distrofin	Abcam	ab15277	Western blot (WB)
Anti-distrofin	Leica	NCL-DYS1	İmmünositokimya (ICC)
Anti-fare IgG, Dylight 488	Vektör Laboratuvarları	DK-2488	ICC
Anti-&alfa;-tubulin	Sigma	T6199	Western bot ve
ICC BZ-X800	KEYENCE	BZ-800	Floresan mikroskop
CELLBANKER	ZENOAQ	CB011	Sıvı nitrojen hücre stoğu
ChemiDoc MP Görüntüleme Sistemi	Bio-Rad	170-8280J1	WB
CloneAmp HiFi PCR premiks	Clontech	639298	Retroviral üretim
cOmplete Proteaz İnhibitörü Kokteyl	Roche	4693116001	için protein ekstraksiyonu
; Yetkili Hücreler	TAKARA	9057
ECL Prime Western Blotting Tespit Reaktifi	GE sağlık	RPN2232
WB EGF	Peprotech	AF-100-15	Hücre kültürü
Endo-Porter	GeneTools	2922498000	ASO transfeksiyonu
Ekstra Kalın Leke Filtre Kağıdı	Bio-Rad	1703965	WB
EzFastBlot HMW	Atto	AE-1460	WB
fibroblast büyüme faktörü-bazik	Sigma-Aldrich	F0291	Hücre kültürü
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Hücre kültürü
GP2-293 paketleme hücreleri	Clontech	631458	Retroviral üretim
Jambon F-12 Besin Karışımı	Thermo Fisher Scientific	11765-054	Hücre kültürü
GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	10569-010	Hücre kültürü Sodyum
piruvat içermeyen yüksek glikozlu DMEM	GE Healthcare	SH30022.01	Hücre kültürü
HiSpeed Plazmid Saflaştırma Kiti	QIAGEN	12643	Retroviral üretim
Histofine Basit Leke MAX PO	NICHIREI BIOSCIENCE INC.	424151	WB
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	ICC
İnsan PDGF-AB	Peprotech	100-00AB-10UG	Hücre kültürü
iBind Flex Çözümü	Thermo Fisher Scientific	SLF2020	WB
iBind Flex Western Cihazı Thermo	Fisher Scientific	SLF2000	WB (Otomatik mezental işleme cihazı)
Immobilon-P Transfer Membranı (PVDF)	MERCK	IPVH304F0	WB
In-Fusion HD klonlama Kiti	Clontech	639648	Retroviral üretim
ITS Sıvı Medya Takviyesi	Sigma-Aldrich	I3146	Hücre kültürü
MILTEX HV 0.45 & mu; m filter	MERCK	SLHV033RS	Retroviral üretim
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Mikroçip elektroforezi
MYOD1 (GFP etiketli)	ORIGENE	RG209108	Retroviral üretim
NanoDrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Spektrofotometre
Esansiyel olmayan amino asitler	Thermo Fisher	11140-050	Hücre kültürü
NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme Kiti	Clontech	740986.20	PCR temizleme
NuPAGE %3-8 Tris-Asetat Protein Jelleri	Invitrogen	EA03785BOX	WB
NuPAGE Antioksidan	Invitrogen	NP0005	WB
NuPAGE LDS Numune Tamponu	Invitrogen	NP0007	WB
NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan	Invitrogen	NP0009	WB
NuPAGE Tris-Asetat SDS Çalıştırma Tamponu	Invitrogen	LA0041	WB
Bir Adım TB Yeşil PrimeScript RT-PCR Kiti	TAKARA	RR066A	Retroviral vektör
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-250	Hücre kültürü
Pierce BCA Protein Test Kiti	Thermo Scientific	23227	WB
Polibren Enfeksiyonu / Transfeksiyonu Reaktif	Sigma-Aldrich	TR-1003	Retroviral enfeksiyon
pRetroX-TetOne-Puro Vektör	Clontech	634307	Retroviral vecor
Puromycin	Clontech	631305	Hücre kültürü
QIAGEN OneStep RT-PCR Kiti	Qiagen	210212	PCR
REGM Bullet Kit	Lonza	CC-3190	UDC'lerin
büyüme ortamı için malzemeREGM SingleQuots	Lonza	CC-4127	UDC'lerin birincil ortamı için malzeme
Retrovirüs Titre Seti	TAKARA	6166	Retroviral vektör
Retro-X Konsantratörünün titre	Clontech	631455	Retroviral üretim
RIPA tamponu Thermo	Fisher Scientific	89901	WB
RNeasy kiti	Qiagen	74104	RNA ekstraksiyonu için PCR
Tetrasiklin içermeyen fetal sığır serumu	Clontech	631106	Hücre kültürü
Triton-X	MP Biyomedikaller	9002-93-1	ICC
Tripsin-EDTA (% 0.05)	Gibco	25300054	Hücre kültürü
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001	WB
Xfect transfeksiyon reaktifi	Clontech	631317	Plazmitlerin ambalaj hücrelerine transfeksiyonu