Burada, Drosophila embriyo proteini ve RNA'nın toplanmasından ön gömülmesine ve gömülmesine, immünoboyamaya ve mRNA in situ hibridizasyonuna kadar tespiti ve lokalizasyonu için bir protokol tarif ediyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR) birçok biyolojik süreçte kritik bir rol oynar. Hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim ve yaşlanmadan nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyona kadar her hücresel aktivite Ryanodin reseptörleri (RyR) ile ilişkilendirilmiştir. Kalsiyum sinyalizasyonunun önemine rağmen, erken gelişimdeki işlevinin kesin mekanizması belirsizdir. Kısa gebelik periyoduna sahip bir organizma olarak, Drosophila melanogaster'in embriyoları, CICR ile ilişkili proteinlerin ve bunların gelişim sırasındaki düzenleyicilerinin dağılımını ve lokalizasyonunu araştırmak için birincil çalışma konularıdır. Bununla birlikte, lipit bakımından zengin embriyoları ve kitin bakımından zengin koryonları nedeniyle, faydaları embriyoları cam yüzeylere monte etmenin zorluğu ile sınırlıdır. Bu çalışmada, Drosophila embriyosunun slaytlara bağlanmasını önemli ölçüde artıran pratik bir protokol ve başarılı histokimya, immünohistokimya ve yerinde hibridizasyon için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Krom şap jelatin slayt kaplama yöntemi ve embriyo ön gömme yöntemi, Drosophila embriyo proteini ve RNA ekspresyonunun incelenmesinde verimi önemli ölçüde artırır. Bu yaklaşımı göstermek için, Drosophila melanogaster'ın erken embriyonik gelişimi sırasında RyR'nin iyi bilinen bir düzenleyicisi olan DmFKBP12 / Calstabin'i inceledik. DmFKBP12'yi sinsityal blastoderm aşaması kadar erken bir zamanda tanımladık ve gelişim sırasında DmFKBP12'nin dinamik ekspresyon paternini bildirdik: başlangıçta sinsityal blastodermde eşit olarak dağılmış bir protein olarak, daha sonra hücresel blastoderm sırasında korteksin bodrum tabakasına önceden lokalize olarak, erken gastrülasyonda üç mücevherli tabaka fazı sırasında ilkel nöronal ve sindirim mimarisinde dağılmadan önce. Bu dağılım, RyR'nin bu katmanlardan kaynaklanan hayati organ sistemlerinde oynadığı kritik rolü açıklayabilir: subözofageal ve supraözofageal ganglion, ventral sinir sistemi ve kas-iskelet sistemi.
Giriş
Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR), iskelet/düz kas ve kardiyak vasküler fonksiyon, hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim, yaşlanma, nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyon gibi birçok biyolojik süreçte kritik rol oynar1,2,3,4,5,6 . Ryanodin reseptörleri (RyR'ler) ve inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörleri (IP3R), düzenleyicileri protein kinaz A (PKA), Ca2 + / kalmodüline bağımlı protein kinaz II (CaMKII), FK506 bağlayıcı proteinler (F....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Üzüm suyu agar tabaklarının hazırlanması
- 150 mL damıtılmış suya 5 g agar ve 5 g sakkaroz ekleyin. Agar ve sakkaroz tamamen çözünene kadar bir mikrodalga kullanarak kaynatın. 50 mL% 100 üzüm suyu ve çözeltiyi birlikte karıştırın.
- Son konsantrasyonu% 0.5 propiyonik aside yapmak için 1 mL% 100 propiyonik asit ekleyin. Hazırlanan çözeltinin 25 mL'sini her plakaya dökün. Agar katılaştıktan sonra, ortamı 4 ° C'de saklayın.
2. Kaplama slaytları
- Slaytlara deterjanla ön işlemden geçirin. Slaytları 3 kez musluk suyuyla ve bir kez damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra slaytları 45....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekiller, yüksek lipid ve kitin içeren koryon Drosophila embriyolarının (Tablo 1) inceleme ve deney için cam slayt yüzeyine bağlanma zorluğunun üstesinden gelmek için kullanılan protokolleri açıklamaktadır. Şekil 1'de gösterilen krom şap jelatin slayt kaplama yöntemini kullanarak, Drosophila embriyolarının slaytların yüzeyine bağlanmasını arttırırken, Şekil 2'de gösterilen embriyo ön gömme yöntemi, dört erken gelişim aşamasının.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
RyRs ve IP3Rs aracılı kalsiyum sinyalizasyonu, hem omurgalı hem de omurgasız hayvanların birçok fizyolojik ve patolojik sürecinde temel bir yoldur1,2,3,4. İnsanlarda, RyR2 genindeki CPVT ile ilişkili R4496C mutasyonu gibi nokta mutasyonları, kardiyomiyositin sarkoplazmik retikulumundan kalsiyum sızıntısına yol açarak kardiyak disfonksiyona neden olur. Bu mutasyonlar, fiziksel aktivite sırasında.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (#31771377 / 31571273 / 31371256), Ulusal Eğitim Bakanlığı'ndan Yabancı Seçkin Bilim İnsanı Programı (#MS2014SXSF038), Ulusal Eğitim Bakanlığı Merkez Üniversiteleri Araştırma Fonu (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45) tarafından desteklenmiştir ve XZ, Shaanxi İl Eğitim Departmanının Anahtar Programı (#2019TS082 / 2019TS079), Üstün Doktora Tezi Fonu (#20JS138 / 2019TS079) tarafından desteklenmektedir. Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı Gençlik Projesi (#2020JQ-885).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| -20& derece; C Buzdolabı | Meiling Biyoloji & Tıbbi | DW-YL270 | Naip depolama için |
| kullanılır-80 derece; C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı | Thermo | Forma 90 Serisi | Naip depolama için kullanılır |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Üzüm suyu agar plakalarının hazırlanması |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab parçaları | Roche | 11093274910 | Digoxigenin etiketli bileşiğin tespiti için |
| Biyokimyasal inkübatör | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin'in çözümü | Pekin'de Sinopharm Kimyasal Reaktifi | 69945460 | Drosophila Embriyo Gömme |
| Santrifüjü Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hibridizasyon | |
| Santrifüj tüpü | Denville | C-2170 | Drosophila Embriyo Toplama |
| Krom Şap | Sinopharm Kimyasal Reaktif Pekin | 10001018 | Kaplama Slaytları |
| Sabit sıcaklıkta su banyosu | Jintan Henfeng Aletleri | KW-1000DC | Hematoksilen-Eozin Boyama, İmmünohistokimya, Yerinde Hibridizasyon ve Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama |
| Dako REAL EnVision Algılama Sistemi | Dako | K5007 | İmmünohistokimyasal reaksiyonda veya in situ hibridizasyon reaksiyonunda, primer antijen antikoruna bağlanır ve hedef boyama ile işaretlenir. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Yerinde Hibridizasyon |
| DIG RNA Etiketleme Kiti | SP6 ve T7 RNA polimeraz | ||
| >Drosophila melanogaster | Bloomington Stok Merkezi | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | Drosophila melanogaster mutant |
| stoklarıElektrikli yüksek kurutma fırını | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | Slaytları ve parafin gömme kaplama için |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoksilen-Eozin Boyama |
| Etanol | Sinopharm Pekin'de Kimyasal Reaktif | 100092680 | Parafin Gömme, Hematoksilen-Eozin Boyama, İmmünohistokimya, Yerinde Hibridizasyon ve Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama |
| Pekin | 10010328 | Kaplama Slaytlarında | Sinopharm Kimyasal Reaktifi |
| Altın klorür | Sigma-Aldrich | 379948 | Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama |
| Hematoksilen | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoksilen-Eozin Boyama |
| Yüksek Saf PCR Ürün Saflaştırma Kiti | Roche | 11732668001 | PCR ürünlerinin |
| saflaştırılması içinAkıllı sabit sıcaklık ve nem kutusu | Sinek bakımı için | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pekin'de Önceden Gömülü |
| Metanol | Sinopharm Kimyasal Reaktifi | 10014108 | Drosophila Embriyo |
| Toplama Mikroskobu | ZEISS | Observer.A1 | Hematoksilen-Eozin Boyama, İmmünohistokimya, Yerinde Hibridizasyon ve Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama |
| Mikroskobu Slaytları | MeVid Labware İmalatı | P105-2001 | Kaplama Slaytları |
| Nötr Sakız | Pekin'de Sinopharm Kimyasal Reaktif | 10004160 | Hematoksilen-Eozin Boyama |
| 40026768 | N-heptan | Sinopharm Kimyasal Reaktif | Koleksiyon |
| Parafin dilimleyici | Huahai bilim aleti | HH-2508III | em>In-situ< / em> Hibridizasyon |
| Parafin | Sinopharm Pekin'de Kimyasal Reaktif | 69019461 | Parafin Gömme |
| pH / mV Metre | Sartorius | PB-10 | Bir çözeltinin pH değerini belirlemek için |
| Pekin | 10018461'da gümüş nitrat Sinopharm Kimyasal Reaktif | Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama | |
| Ultra saf su sayacı | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Pekin'de |
| Ksilen | Sinopharm Kimyasal Reaktif | 10023418 | Parafin Gömme |
Kaynaklar
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
