Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

İnsan kanser hücre hatları, kanserin biyolojisini incelemek ve antikanser ajanlarını değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu hücre çizgileri mutlaka kaynak dokularının orijinal özelliklerini korumaz, çünkü morfolojileri, gen mutasyonları ve gen ekspresyon profilleri kültür sırasında uzun süreler boyunca değişebilir. Ayrıca, bu hücre çizgilerinin çoğu tek katmanlı olarak kültürlenir veya murine ksinograft olarak kullanılır, bunların hiçbiri fiziksel olarak tümör dokusunu temsil eder^1,2. Bu nedenle, antikanser ajanlarının klinik etkinliği kanser hücre hatlarında gözlenenle aynı olmayabilir. Bu nedenle, hasta kaynaklı tümör ksinograftları veya hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar) kullanan ex vivo tahlilleri ve tümör dokularının yapısını ve işlevini doğru bir şekilde yeniden üreten tümör sferoid modelleri gibi in vitro sistemler geliştirilmiştir. Artan kanıtlar, bu modellerin hastaların antikanser ajanlara yanıtlarını doğrudan ilgili kanser dokusuyla karşılaştırılabilir olarak tahmin ettiğini göstermektedir. Bu in vitro sistemler farklı tümör doku tipleri için kurulmuş dırı ve ilaç taraması için ilişkili yüksek verimli tahlil sistemleri (HTS) de geliştirilmiştir³, 4^,5,6,7. Hastalardan veya hasta kaynaklı tümör ksinograftlarından elde edilen primer tümörlerin heterojen eks vivo organoid kültürleri, kültür kolaylığı ve stromal dokudaki hücrelerin karmaşıklığını koruma yetenekleri nedeniyle son yıllarda önemli ölçüde ilgi kazanmıştır⁸,^9,10. Bu modellerin kanserin biyolojisinin anlaşılmasını geliştirmesi ve ilaç etkinliğinin değerlendirilmesini kolaylaştırması beklenmektedir in vitro.

Fukuşima ÇeviriSel Araştırma Projesi kapsamında F-PDO olarak belirlenen farklı tümör dokusu türlerinden bir dizi yeni PDO oluşturuldu. PDO'lar, kaynak tümörünkine benzer bir morfolojiye sahip büyük hücre kümeleri oluşturur ve altı aydan fazla kültürlenebilir¹¹. Karşılaştırmalı histoloji ve kapsamlı gen ekspresyon analizleri, PDO'ların özelliklerinin, kültür koşullarında uzun süreli büyümeden sonra bile, kaynak tümör dokularının özelliklerine yakın olduğunu göstermiştir. Ayrıca, 96 kuyulu ve 384 kuyulu plakalarda her PDO tipi için uygun bir HTS kurulmuştur. Bu tahliller birkaç moleküler hedefli ajanı ve antikorları değerlendirmek için kullanıldı. Burada endometriyal kanser için kullanılan standart kemoterapötikler (paclitaxel ve karboplatin), paclitaxel ve karboplatine yanıt vermeyen bir hastadan elde edilen F-PDO'lar kullanılarak değerlendirildi. Buna göre, paclitaxel ve karboplatinin bu PDO'ya karşı hücre büyümesi inhibitör aktivitesi zayıftı (IC₅₀: >10 μM). Ek olarak, önceki araştırmalar bazı F-PDO'ların kemoterapötik ajanlara ve moleküler hedefe bağlı ajanlara duyarlılığının klinik etkinlik^{11 , 12,13}ile tutarlı olduğunu bildirmiştir. Son olarak, antikanser ajanlarının neden olduğu PDO'ların yüksek sıralı yapısındaki değişiklikler üç boyutlu hücre analiz sistemi kullanılarak analiz edilmiştir^12,13. Antikanser ajanların PDO tabanlı HTS kullanılarak değerlendirilme sonuçları bu ajanlar için elde edilen klinik sonuçlarla karşılaştırılabilir. Burada, antikanser ajanların ve immünoterapinin PDO modellerini kullanarak gücünü değerlendirmek için kullanılabilecek daha basit ve daha doğru bir HTS için bir protokol sunulmaktadır.

İnsan kaynaklı materyalleri içeren tüm deneyler Helsinki Bildirgesi kapsamında gerçeklendi ve Fukuşima Tıp Üniversitesi etik komitesi tarafından önceden onaylandı (onay numaraları 1953 ve 2192; onay tarihleri sırasıyla 18 Mart 2020 ve 26 Mayıs 2016). Bu çalışmada kullanılan klinik örnekleri sağlayan tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

1. PDO'ların Kültürü

NOT: F-PDO'lar çeşitli heterojen morfolojiler sergileyen ve süspansiyon kültüründe büyüyen hücre kümeleri oluşturur (Şekil 1). Ayrıca, F-PDO'lar 6 aydan fazla kültürlenebilir ve gelecekte kullanılmak üzere kriyoprezizasyon yapılabilir.

1. Depolanan PDO'ların çözülmesi (gün 0)
   1. Çözülme ve tohum PDO'ları (örneğin, RLUN007, akciğer adenokarsinom)0. İlk olarak, steril 50 mL santrifüj tüpüne B-27 takviyesinin%1'ini ve epidermal büyüme faktörünün 30 ng / mL'sini içeren PDO'lar için 15 mL orta ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Donmuş şişeyi sıvı azot deposundan çıkardıktan sonra, PDO'ları 37 °C'lik bir su banyosunda 2 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Daha sonra, şişeyi su banyosundan çıkarın, şişeyi% 70 etanol ile silin ve ardından şişeyi biyolojik bir güvenlik kabinine taşıyın.
   3. Şişenin içeriğini PDO'lar için 15 mL orta içeren tüpe aktarın. PDO'ları ve ortamı, 3 mL'lik bir transfer pipeti ile beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetle karıştırın. Tüpü ~25 °C'de 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı atın. PDO peletini 5 mL taze ortamda yeniden biriktirin ve hafif pipetleme ile 25 cm² şişeye (bkz. Malzeme Tablosu) aktarın. Son olarak, 37 °C'de bir inkübatörde PDO'ları% 5 CO_2'dekültüre edin.
2. Ortamı haftada iki kez değiştirin (3-7 gün). Hücre kümelerini çökeltmek için PDO süspansiyonu santrifüjüne çekin ve ortamın 4 mL'sini (%80 hacim) değiştirin. Hücreleri taze ortamda yeniden biriktirin.
   NOT: RLUN007'nin çoğunluğu 100-500 μm çapında hücre kümeleri olarak görünür. Ortadaki fenol kırmızısının rengi Şekil 1A'dagösterildiği gibi sarıya dönüştüğünde, ortamı daha sık değiştirin. Orta, değiştirmeyi izleyen gün sararırsa ve her hücre kümesi birleşerek çapı 1:2 olan >500 μm çapında daha büyük kümeler oluşturursa, geçiş 1:2'lik bir bölünme oranında olur.
3. PDO'ların alt kültürü (gün 8-28)
   NOT: Tek hücre sayısını gerçekten ölçmenin zorluğu göz önüne alındığında, geçiş zamanlaması uygun bir hücre kümesi yoğunluğuna ve santrifüjlemeden sonra PDO peletinin boyutuna göre belirlenir (Şekil 1B). RLUN007 durumunda, PDO peletinin hacmi çözülmeden yaklaşık 2 hafta sonra 30 μL'ye (25 cm² şişede doymuş yoğunluk) ulaşır.
   1. Bir 25 cm 2 şişeden iki^{adet 25} cm² şişeye (P1) transfer için, PDO süspansiyonu bir santrifüj tüpüne ve santrifüjü 200 x g'da yaklaşık 25 °C'de 2 dakika boyunca aktarın. PDO peletinin hacmini tahmin edin ve üstnatant atın. PDO peletini 5 mL taze ortamda 5 mL pipet kullanarak yeniden biriktirin. Pipet, düşük hızda beş kez hafifçe yukarı ve aşağı. Ardından, PDO süspansiyonunun (2,5 mL) hacminin yarısını iki şişeye aktarın ve her şişeye 2,5 mL taze orta ekleyin. %5 CO_2'de37 °C'deki hücreleri kültüre edin.
   2. İki adet 25 cm² şişeden bir adet 75 cm² şişeye (P2) transfer için PDO süspansiyonu iki şişeden iki santrifüj tüpüne aktarın ve PDO'yu yaklaşık 25 °C'de 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin. Daha sonra, PDO peletinin hacmini tahmin edin ve peletin 2,5 mL taze ortamda (tüp başına) yeniden dirildi. Daha sonra, PDO süspansiyonu bir tüpte diğerinde olanla birleştirin ve 10 mL taze ortam içeren 75 cm² şişeye aktarın. %5 CO_2'de37 °C'deki hücreleri kültüre edin. Alt kültürlü PDO'ları ilk pasajdan yaklaşık 1 hafta sonra iki^{adet 25} cm 2 şişeden bir adet 75 cm² şişeye aktarın(Şekil 1C).

2. Büyüme inhibisyonu HTS

NOT: Antikanser ajanlarının PDO'lara karşı büyüme inhibitör aktivitesi Şekil 2'degösterildiği gibi hücre içi ATP içeriği ölçülerek değerlendirilir. Bu adım, piyasada bulunan bir hücre canlılığı test kiti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. 0. günde, PDO'ları (örneğin, RLUN007) test için yeterli sayıda hücre kümesi bulunana kadar şişelerde kültüre edin. Tohumlamadan bir gün önce, PDO süspansiyonu 75 cm² şişeden 15 mL'lik bir tüpe ve PDO pelet hacmini ölçmek için 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüje aktarın. Ardından, PDO peletini 15 mL taze ortamda yeniden biriktirin ve 75 cm² şişeye geri aktarın. %5 CO_2'de37 °C'deki hücreleri kültüre edin.
   NOT: Gerekli PDO pelet hacmi, her PDO'nun seyreltme oranına ve test için kullanılan 384 kuyu plakası sayısına bağlıdır. RLUN007 için, on adet 384 kuyu plakasına tohumlama için 200 μL hücre pelet hacmi gereklidir.
2. 1. günde (ortamı değiştirdikten sonra 24 saat), 70 μm örgü filtresi içeren bir filtre tutucu ile hücre parçalanma ve dispersiyon ekipmanı kullanarak PDO'ları kıydırın (bkz. Malzeme Tablosu). Ardından, PDO süspansiyonunun 15 mL'lik kısmını 10 kat seyreltin. PDO süspansiyonunun 40 μL tohumunun 384 kuyulu ultra düşük ataşman sferoid (yuvarlak tabanlı) mikro plakalara (bkz. Malzeme Tablosu)bir hücre süspansiyon dağıtıcısı kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Hücre kümelerini kıymak için, piyasada bulunan hücre parçalanma ve dispersiyon ekipmanının kullanılması önerilir (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Tohumlamadan 24 saat sonra (2. gün), PDO'ları 0,04 μL test ajanı çözeltileri ile sıvı bir işleyici kullanarak 20 μM ila 1,0 nM (10 seri seyreltme) nihai konsantrasyon aralıklarında tedavi edin (bkz. Malzeme Tablosu).
4. 8. günde (test maddesi tedavisinden sonra 144 saat), test kuyularına hücre içi ATP ölçüm reaktifi ekleyin. Tabakları bir karıştırıcı kullanarak karıştırın ve 25 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bir plaka okuyucu kullanarak hücre içi ATP içeriğini lüminesans olarak ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
5. Hücre canlılığını hesaplamak için, test kuyularındaki ATP miktarını, arka plan çıkarılarak aracı içeren kontrol kuyularındakine bölün. 6 gün boyunca büyüme hızını hesaplamak için, araç kontrol kuyularındaki ATP miktarını, tohumlamadan sonra araç kontrol kuyularındaki 24 saate bölün.
6. Biyolojik veri analiz yazılımı kullanarak doz-yanıt eğrilerinden %50 inhibitör konsantrasyonu_{(IC 50)}ve eğri (AUC) altındaki alanı hesaplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Z faktörü, 1 (sonsuz ayırma) ile <0 arasında değişen boyutsuz bir parametredir. z = "1" - (3φc+ + 3φc-) >

3. Büyüme inhibisyonu için hücre toplama ve görüntüleme sistemi ile HTS

NOT: Protokol 2'yi kullanan verilerde büyük bir sapma varsa (testteki varyasyon [CV] katsayısı %20'den fazla olduğunda), seçilen boyuttaki PDO'lar hücre toplama ve görüntüleme sistemi kullanılarak 96 kuyu veya 384 kuyu plakalarına tohumlanabilir (Şekil 2). Protokol, önceki bölümdeki 2.1 ve 2.2 adımlarında açıklananla aynıdır. Bu adım, piyasada bulunan bir hücre toplama ve görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. 1. günde, hücre toplama ve görüntüleme sisteminde 40 μL orta/ayrıca hedef plaka ile 384 kuyulu ultra düşük ataşmanlı bir küresel mikro plaka ayarlayın.
2. Hava kabarcıklarını çıkarmak için toplama haznesini(bkz. Malzeme Masası) 6 mL kültür ortamı ve 2 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj ile doldurun. Ortamda asılı PDO'ları (PDO pelet hacmi, 4 μL) toplama odasına ekleyin ve sisteme ayarlayın.
3. Odayı en az 1 dakika bekletin, ardından dağılım, böylece hücre kümeleri odanın dibine yerleşir; ardından, odanın taranmasını gerçekleştirin.
4. Hücre kümelerinin otomatik seçimi için sistemde malzeme çekme boyutunu 140-160 μm (alan 15.386-20.000^{μm 2)}olarak ayarlayın. Ardından, taranan görüntülerdeki seçili hücre kümelerinin kalitesini kontrol edin ve malzeme çekme ipuçlarını (bkz. Malzeme Tablosu) hedef plakaya kullanarak kuyu başına on hücre kümesi aktarın.
5. 2.3. adımdan sonraki iletişim kuralı adımlarını gerçekleştirin.

4. Antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik için HTS

NOT: Bu adım, elektrik empedansı ölçüm cihazı olan ticari olarak kullanılabilen bir sistem (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilir. PTO'ların sitolizini antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik (ADCC) ile monoklonal antikorlar ve doğal öldürücü (NK) hücrelerle değerlendirmek için kullanılır (Şekil 3). NK hücreleri, üreticinin talimatlarına uyarak NK hücre üretim kiti kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinden üretilir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. ADCC faaliyetinin ölçümü
   1. 0. günde, 96 kuyulu bir plakayı (bkz. Malzeme Tablosu)gece boyunca 4 °C'de 50 μL 10 μg/mL fibronektin çözeltisi (0,5 μg/kuyu) ile kaplanın.
   2. 1. günde, fibronektin çözeltisini çıkardıktan sonra, arka plan empedansını ölçmek için her kuyuya 50 μL kültür ortamı ekleyin.
   3. Tohumlamadan önce, PDO'lara 5 mL hücre kültürü ayrıştırma reaktifi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu)(RLUN007: 75 cm² şişede PDO peletinin 100 μL'si) ve PDO'ları dağıtmak için₂₀ dakika boyunca 37 °C'de bir CO 2 inkübatöründe kuluçkaya yatırın. Trypnizasyonu durdurmak için 5 mL orta, santrifüj ekleyin ve ayrışma reaktifini çıkarın. PDO'ları taze ortamla durulayın ve 40 μm hücre süzgecinden filtreleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
   4. Hücre canlılığı çözümleyicisi kullanarak hücre sayısını sayma (bkz. Malzeme Tablosu).
   5. PDO süspansiyonu bir rezervuara aktarın ve çok kanallı bir pipetör kullanarak karıştırın. PDO süspansiyonu 96 kuyu plakasında 5 x^{10 4} hücreli/kuyudaki kuyulara ekleyin. Her kuyu 100 μL'lik son bir hacim içerir. Daha sonra plakayı 30 dakika boyunca yaklaşık 25 °C'de biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin.
   6. Plakayı 37 °C'de bir CO₂ inkübatörde cihaza aktarın. Empedans sinyallerindeki değişiklikleri hücre indeksi olarak her 15 dakikada bir kaydedin.
   7. NK hücrelerini PDO tohumlama ile aynı gün 37 °C su banyosunda çözün. Hücreleri şişeden NK hücreleri için 10 mL orta içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu)ve yaklaşık 25 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatant atın ve hücre peletini 10 mL taze ortamda yeniden dirildi. Hücre sayımından sonra, hücre yoğunluğunu 1 x 10⁶ hücre/mL'ye ayarlayın ve 75 cm² şişeye aktarın. NK hücrelerini 37 °C'de_%5 CO 2 inkübatörde kültüre edin.
   8. 2. günde, antikor çözeltilerini (fosfat tamponlu salin) steril V-bottom 96 kuyu plakalarında son konsantrasyonun 10 katına hazırlayın.
   9. Her kuyudan 60 μL orta çıkarın ve PDO'lara 10 μL trastuzumab veya cetuximab çözeltisi (10 μg/mL, 1 μg/mL ve 0,1 μg/mL) ekleyin. Plakaları bir inkübatördeki cihaza geri aktarın ve hücre indeksini 1 saat boyunca kaydedin.
   10. NK hücre süspansiyonu 50 mL tüpe aktarın ve hücre numarasını sayın. Hücreleri 300 x g'da 5 dakika santrifüj edin ve NK hücre yoğunluğunu PDO'lar için ortamla 1 x^{10 6} hücre/mL ve 2 x^{10 6} hücre/mL'ye ayarlayın.
   11. 1:1 veya 2:1 hedef (RLUN007) hücre oranındaki efektör (NK) hücrelerine 50 μL NK hücre süspansiyonu ekleyin. Antikorların son konsantrasyonları 1 μg/mL, 0,1 μg/mL ve 0,01 μg/mL'dir. Plakayı yaklaşık 25 °C'de 15 dakika tutun ve plakaları cihaza geri verin.
2. Veri toplama ve analiz
   1. Analiz yazılımı kullanarak hücre dizinini yüzde sitoliz değerlerinedönüştürme (bkz. Malzeme Tablosu ).
   2. Sitoliz yüzdesi, NK hücreleri tarafından öldürülen hedef hücrelerin yüzdesini, yalnızca hedef hücrelere (PDO' lar) karşı bir denetim olarak ifade eder. Her zaman noktasında örnek kuyuların dizininden yalnızca NK hücreleri içeren kuyuların hücre dizinlerini çıkarın. Antikorların eklenmesinden hemen önce her değeri hücre indeksine normalleştirin. Aşağıdaki denklemi kullanarak normalleştirilmiş hücre indeksini yüzde sitolizine dönüştürün: % sitoliz = (1 - normalleştirilmiş hücre indeksi [örnek kuyular]) / normalleştirilmiş hücre indeksi (hedef tek başına kuyular) x 100.

Antikanser ajanlarını değerlendirmek için PDO'lar ve 384 kuyu mikro plakaları kullanılarak son derece doğru bir HTS geliştirilmiştir ve her PDO için bir HTS geliştirilmesi daha önce10 , 11,12,13olarak bildirilmiştir. HTS'nin performansı CV'ler ve Z'faktörü hesaplanarak değerlendirildi. Z'faktörü, test kalitesinin ve performansının doğrulanması için yaygın olarak kabul edilen bir yöntemdir ve bu değer > 0,514ise, test HTS için uygundur. RLUN007 kullanan 384 kuyu plaka testinde kontrol datum noktaları, Şekil 4'tegösterildiği gibi CV değerleri% 5.8 ve hesaplanan Z'-faktörleri 0.83 ile çok az değişkenlik gösterdi. Bu sonuçlar, bu tahlilin HTS için yüksek performansa sahip olduğunu göstermektedir. PDO'ların HTS kullanarak antikanser ajanlarına duyarlılığını araştırmak, büyüme inhibisyonu, özellikle epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) inhibitörleri (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib ve rosiletinib) ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri için standart klinik tedaviler olan paclitaxel ve pozitif kontrol olarak mitomycin C ile tedavi edilen sekiz antikanser ajan ile tedavi edilen RLUN007 kullanılarak değerlendirildi. Her PDO için antikanser ajanlarınınIC 50 ve AUC değerleri Şekil 4'tegösterilmiştir. RLUN007, tüm EGFR inhibitörleri ve diğer antikanser ajanlar için yüksek hassasiyet (IC50 < 2 μM, AUC < 282) gösterdi. Tüm veriler için hesaplanan sigmoid eğrileri, antikanser ajanlarının büyüme inhibitör aktivitesinin doğru bir şekilde ölçülebileceğini gösterdi.

Hücre toplama ve görüntüleme sistemi, veriler yukarıdaki metodoloji kullanılarak önemli ölçüde değiştiğinde kullanılır. Hücre kümelerini zarar vermeden doğru bir şekilde seçen hücre toplama ve görüntüleme sistemi, hücre kalıntılarını tahlil sisteminden dışlamak için hücre kümesi boyutunu hizalayarak doğru HTS tahlillerine olanak tanır. Sistem kullanılmadığında CV değeri &,0, Z'faktör değeri 0,23 (veriler gösterilmedi) idi. Bununla birlikte, CV ve Z'faktör değerleri sistem kullanılarak sırasıyla % 6.4 ve 0.81 oranında geliştirilmiştir.

Hücrelerin sayısını, morfolojisini ve bağlanmasını uzun süre izleyen elektriksel empedans ölçüm cihazını kullanarak ADCC aktivitesine sahip PDO'ların sitolizini araştırmak için, 96 kuyulu bir plakada efektör hücreler olarak antikorlar (trastuzumab ve cetuximab) ve NK hücreleri ile tedavi edilen RLUN007 kullanılarak empedans sinyallerindeki değişiklikler değerlendirildi. Sadece hedef hücrelerden oluşan kontrol ile karşılaştırıldığında, sitoliz yüzdesi zamanla artmıştır. Antikorlar olmadan 1:1 ( Şekil 5A,C) veya 2:1 (Şekil 5B,D ) E:T oranında 6 saat sonra% 45 veya%75'eulaştı. Trastuzumab kullanan NK hücre aracılı sitoliz, sırasıyla 6 saat 1:1(Şekil 5A, 1 μg/mL) ve 2:1(Şekil 5B

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation, lisans devri ile F-PDO ve F-PDO medyasının ticari sahibi fujifilm Wako Pure Chemicals'ın bir yan kuruluşudur.