Yöntem makalesi

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

6.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62668

⸱

14 Haziran 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1FUJIFILM Wako Bio Solutions Corporation, 2Medical-Industrial Translational Research Center, Fukushima Medical University, 3Department of Bioregulation and Pharmacological Medicine, Fukushima Medical University

Bu makalede

Özet

Kanser dokularına benzer ancak 96 kuyulu ve 384 kuyu plakalı in vitro yüksek verimli tahlil sistemleri için uygun olmayan, hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO) kullanan antikanser ilaçları değerlendirmek için son derece hassas bir in vitro yüksek verimli tahlil sistemi geliştirilmiştir.

Özet

Hasta kaynaklı tümör organoidlerinin (PDO' lar) geleneksel hücre kültürü modellerine göre hastalığın daha iyi tekrarlanabilirliğine sahip preklinik bir kanser modeli olması beklenmektedir. PDO'lar, tümör dokusunun mimarisini ve işlevini doğru ve verimli bir şekilde yeniden oluşturmak için çeşitli insan tümörlerinden başarıyla üretilmiştir. Bununla birlikte, PDO'lar antikanser ilaçları değerlendirirken 96 kuyu veya 384 kuyu plakaları kullanılarak in vitro yüksek verimli bir test sistemi (HTS) veya hücre analizi için uygun değildir, çünkü boyut olarak heterojendirler ve kültürde büyük kümeler oluştururlar. Bu kültürler ve tahliller, tümör dokusu iskeleleri oluşturmak için Matrigel gibi hücre dışı matrisler kullanır. Bu nedenle, PDO'lar düşük verime ve yüksek maliyete sahiptir ve uygun bir tahlil sistemi geliştirmek zor olmuştur. Bu sorunu gidermek için, antikanser ilaçların ve immünoterapinin gücünü değerlendirmek için PDO'lar kullanılarak daha basit ve daha doğru bir HTS kuruldu. 384 kuyu plakasında kültürlenen katı tümörlerden kurulan PDO'ları kullanan bir in vitro HTS oluşturuldu. Ayrıca, 96 kuyu plakalarında kültürlenmiş PDO'lar kullanılarak immün yanıtı temsil etmek için antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik aktivitesinin değerlendirilmesi için bir HTS geliştirilmiştir.

Giriş

İnsan kanser hücre hatları, kanserin biyolojisini incelemek ve antikanser ajanlarını değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu hücre çizgileri mutlaka kaynak dokularının orijinal özelliklerini korumaz, çünkü morfolojileri, gen mutasyonları ve gen ekspresyon profilleri kültür sırasında uzun süreler boyunca değişebilir. Ayrıca, bu hücre çizgilerinin çoğu tek katmanlı olarak kültürlenir veya murine ksinograft olarak kullanılır, bunların hiçbiri fiziksel olarak tümör dokusunu temsil eder1,2. Bu nedenle, antikanser ajanlarının klinik etkinliği kanser hücre hatlarında gözlenenle aynı olmayabilir. Bu nedenle, hasta kaynaklı tümör ksinograftları veya hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar) kullanan ex vivo tahlilleri ve tümör dokularının yapısını ve işlevini doğru bir şekilde yeniden üreten tümör sferoid modelleri gibi in vitro sistemler geliştirilmiştir. Artan kanıtlar, bu modellerin hastaların antikanser ajanlara yanıtlarını doğrudan ilgili kanser dokusuyla karşılaştırılabilir olarak tahmin ettiğini göstermektedir. Bu in vitro sistemler farklı tümör doku tipleri için kurulmuş dırı ve ilaç taraması için ilişkili yüksek verimli tahlil sistemleri (HTS) de geliştirilmiştir3, 4,5,6,7. Hastalardan veya hasta kaynaklı tümör ksinograftlarından elde edilen primer tümörlerin heterojen eks vivo organoid kültürleri, kültür kolaylığı ve stromal dokudaki hücrelerin karmaşıklığını koruma yetenekleri nedeniyle son yıllarda önemli ölçüde ilgi kazanmıştır8,9,10. Bu modellerin kanserin biyolojisinin anlaşılmasını geliştirmesi ve ilaç etkinliğinin değerlendirilmesini kolaylaştırması beklenmektedir in vitro.

Fukuşima ÇeviriSel Araştırma Projesi kapsamında F-PDO olarak belirlenen farklı tümör dokusu türlerinden bir dizi yeni PDO oluşturuldu. PDO'lar, kaynak tümörünkine benzer bir morfolojiye sahip büyük hücre kümeleri oluşturur ve altı aydan fazla kültürlenebilir11. Karşılaştırmalı histoloji ve kapsamlı gen ekspresyon analizleri, PDO'ların özelliklerinin, kültür koşullarında uzun süreli büyümeden sonra bile, kaynak tümör dokularının özelliklerine yakın olduğunu göstermiştir. Ayrıca, 96 kuyulu ve 384 kuyulu plakalarda her PDO tipi için uygun bir HTS kurulmuştur. Bu tahliller birkaç moleküler hedefli ajanı ve antikorları değerlendirmek için kullanıldı. Burada endometriyal kanser için kullanılan standart kemoterapötikler (paclitaxel ve karboplatin), paclitaxel ve karboplatine yanıt vermeyen bir hastadan elde edilen F-PDO'lar kullanılarak değerlendirildi. Buna göre, paclitaxel ve karboplatinin bu PDO'ya karşı hücre büyümesi inhibitör aktivitesi zayıftı (IC50: >10 μM). Ek olarak, önceki araştırmalar bazı F-PDO'ların kemoterapötik ajanlara ve moleküler hedefe bağlı ajanlara duyarlılığının klinik etkinlik11 , 12,13ile tutarlı olduğunu bildirmiştir. Son olarak, antikanser ajanlarının neden olduğu PDO'ların yüksek sıralı yapısındaki değişiklikler üç boyutlu hücre analiz sistemi kullanılarak analiz edilmiştir12,13. Antikanser ajanların PDO tabanlı HTS kullanılarak değerlendirilme sonuçları bu ajanlar için elde edilen klinik sonuçlarla karşılaştırılabilir. Burada, antikanser ajanların ve immünoterapinin PDO modellerini kullanarak gücünü değerlendirmek için kullanılabilecek daha basit ve daha doğru bir HTS için bir protokol sunulmaktadır.

Protokol

İnsan kaynaklı materyalleri içeren tüm deneyler Helsinki Bildirgesi kapsamında gerçeklendi ve Fukuşima Tıp Üniversitesi etik komitesi tarafından önceden onaylandı (onay numaraları 1953 ve 2192; onay tarihleri sırasıyla 18 Mart 2020 ve 26 Mayıs 2016). Bu çalışmada kullanılan klinik örnekleri sağlayan tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

1. PDO'ların Kültürü

NOT: F-PDO'lar çeşitli heterojen morfolojiler sergileyen ve süspansiyon kültüründe büyüyen hücre kümeleri oluşturur (Şekil 1). Ayrıca, F-PDO'lar 6 aydan fazla kültürlenebilir ve gelecekte kullanılmak üzere kriyoprezizasyon yapılabilir.

  1. Depolanan PDO'ların çözülmesi (gün 0)
    1. Çözülme ve tohum PDO'ları (örneğin, RLUN007, akciğer adenokarsinom)0. İlk olarak, steril 50 mL santrifüj tüpüne B-27 takviyesinin%1'ini ve epidermal büyüme faktörünün 30 ng / mL'sini içeren PDO'lar için 15 mL orta ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Donmuş şişeyi sıvı azot deposundan çıkardıktan sonra, PDO'ları 37 °C'lik bir su banyosunda 2 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Daha sonra, şişeyi su banyosundan çıkarın, şişeyi% 70 etanol ile silin ve ardından şişeyi biyolojik bir güvenlik kabinine taşıyın.
    3. Şişenin içeriğini PDO'lar için 15 mL orta içeren tüpe aktarın. PDO'ları ve ortamı, 3 mL'lik bir transfer pipeti ile beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetle karıştırın. Tüpü ~25 °C'de 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı atın. PDO peletini 5 mL taze ortamda yeniden biriktirin ve hafif pipetleme ile 25 cm2 şişeye (bkz. Malzeme Tablosu) aktarın. Son olarak, 37 °C'de bir inkübatörde PDO'ları% 5 CO2'dekültüre edin.
  2. Ortamı haftada iki kez değiştirin (3-7 gün). Hücre kümelerini çökeltmek için PDO süspansiyonu santrifüjüne çekin ve ortamın 4 mL'sini (%80 hacim) değiştirin. Hücreleri taze ortamda yeniden biriktirin.
    NOT: RLUN007'nin çoğunluğu 100-500 μm çapında hücre kümeleri olarak görünür. Ortadaki fenol kırmızısının rengi Şekil 1A'dagösterildiği gibi sarıya dönüştüğünde, ortamı daha sık değiştirin. Orta, değiştirmeyi izleyen gün sararırsa ve her hücre kümesi birleşerek çapı 1:2 olan >500 μm çapında daha büyük kümeler oluşturursa, geçiş 1:2'lik bir bölünme oranında olur.
  3. PDO'ların alt kültürü (gün 8-28)
    NOT: Tek hücre sayısını gerçekten ölçmenin zorluğu göz önüne alındığında, geçiş zamanlaması uygun bir hücre kümesi yoğunluğuna ve santrifüjlemeden sonra PDO peletinin boyutuna göre belirlenir (Şekil 1B). RLUN007 durumunda, PDO peletinin hacmi çözülmeden yaklaşık 2 hafta sonra 30 μL'ye (25 cm2 şişede doymuş yoğunluk) ulaşır.
    1. Bir 25 cm 2 şişeden ikiadet 25 cm2 şişeye (P1) transfer için, PDO süspansiyonu bir santrifüj tüpüne ve santrifüjü 200 x g'da yaklaşık 25 °C'de 2 dakika boyunca aktarın. PDO peletinin hacmini tahmin edin ve üstnatant atın. PDO peletini 5 mL taze ortamda 5 mL pipet kullanarak yeniden biriktirin. Pipet, düşük hızda beş kez hafifçe yukarı ve aşağı. Ardından, PDO süspansiyonunun (2,5 mL) hacminin yarısını iki şişeye aktarın ve her şişeye 2,5 mL taze orta ekleyin. %5 CO2'de37 °C'deki hücreleri kültüre edin.
    2. İki adet 25 cm2 şişeden bir adet 75 cm2 şişeye (P2) transfer için PDO süspansiyonu iki şişeden iki santrifüj tüpüne aktarın ve PDO'yu yaklaşık 25 °C'de 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin. Daha sonra, PDO peletinin hacmini tahmin edin ve peletin 2,5 mL taze ortamda (tüp başına) yeniden dirildi. Daha sonra, PDO süspansiyonu bir tüpte diğerinde olanla birleştirin ve 10 mL taze ortam içeren 75 cm2 şişeye aktarın. %5 CO2'de37 °C'deki hücreleri kültüre edin. Alt kültürlü PDO'ları ilk pasajdan yaklaşık 1 hafta sonra ikiadet 25 cm 2 şişeden bir adet 75 cm2 şişeye aktarın(Şekil 1C).

2. Büyüme inhibisyonu HTS

NOT: Antikanser ajanlarının PDO'lara karşı büyüme inhibitör aktivitesi Şekil 2'degösterildiği gibi hücre içi ATP içeriği ölçülerek değerlendirilir. Bu adım, piyasada bulunan bir hücre canlılığı test kiti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. 0. günde, PDO'ları (örneğin, RLUN007) test için yeterli sayıda hücre kümesi bulunana kadar şişelerde kültüre edin. Tohumlamadan bir gün önce, PDO süspansiyonu 75 cm2 şişeden 15 mL'lik bir tüpe ve PDO pelet hacmini ölçmek için 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüje aktarın. Ardından, PDO peletini 15 mL taze ortamda yeniden biriktirin ve 75 cm2 şişeye geri aktarın. %5 CO2'de37 °C'deki hücreleri kültüre edin.
    NOT: Gerekli PDO pelet hacmi, her PDO'nun seyreltme oranına ve test için kullanılan 384 kuyu plakası sayısına bağlıdır. RLUN007 için, on adet 384 kuyu plakasına tohumlama için 200 μL hücre pelet hacmi gereklidir.
  2. 1. günde (ortamı değiştirdikten sonra 24 saat), 70 μm örgü filtresi içeren bir filtre tutucu ile hücre parçalanma ve dispersiyon ekipmanı kullanarak PDO'ları kıydırın (bkz. Malzeme Tablosu). Ardından, PDO süspansiyonunun 15 mL'lik kısmını 10 kat seyreltin. PDO süspansiyonunun 40 μL tohumunun 384 kuyulu ultra düşük ataşman sferoid (yuvarlak tabanlı) mikro plakalara (bkz. Malzeme Tablosu)bir hücre süspansiyon dağıtıcısı kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Hücre kümelerini kıymak için, piyasada bulunan hücre parçalanma ve dispersiyon ekipmanının kullanılması önerilir (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Tohumlamadan 24 saat sonra (2. gün), PDO'ları 0,04 μL test ajanı çözeltileri ile sıvı bir işleyici kullanarak 20 μM ila 1,0 nM (10 seri seyreltme) nihai konsantrasyon aralıklarında tedavi edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. 8. günde (test maddesi tedavisinden sonra 144 saat), test kuyularına hücre içi ATP ölçüm reaktifi ekleyin. Tabakları bir karıştırıcı kullanarak karıştırın ve 25 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bir plaka okuyucu kullanarak hücre içi ATP içeriğini lüminesans olarak ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
  5. Hücre canlılığını hesaplamak için, test kuyularındaki ATP miktarını, arka plan çıkarılarak aracı içeren kontrol kuyularındakine bölün. 6 gün boyunca büyüme hızını hesaplamak için, araç kontrol kuyularındaki ATP miktarını, tohumlamadan sonra araç kontrol kuyularındaki 24 saate bölün.
  6. Biyolojik veri analiz yazılımı kullanarak doz-yanıt eğrilerinden %50 inhibitör konsantrasyonu(IC 50)ve eğri (AUC) altındaki alanı hesaplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Z faktörü, 1 (sonsuz ayırma) ile <0 arasında değişen boyutsuz bir parametredir. Z = 1 - (3φc+ + 3φc-) / |μc+ - μ σ μc-| olarak tanımlanır;

3. Büyüme inhibisyonu için hücre toplama ve görüntüleme sistemi ile HTS

NOT: Protokol 2'yi kullanan verilerde büyük bir sapma varsa (testteki varyasyon [CV] katsayısı %20'den fazla olduğunda), seçilen boyuttaki PDO'lar hücre toplama ve görüntüleme sistemi kullanılarak 96 kuyu veya 384 kuyu plakalarına tohumlanabilir (Şekil 2). Protokol, önceki bölümdeki 2.1 ve 2.2 adımlarında açıklananla aynıdır. Bu adım, piyasada bulunan bir hücre toplama ve görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. 1. günde, hücre toplama ve görüntüleme sisteminde 40 μL orta/ayrıca hedef plaka ile 384 kuyulu ultra düşük ataşmanlı bir küresel mikro plaka ayarlayın.
  2. Hava kabarcıklarını çıkarmak için toplama haznesini(bkz. Malzeme Masası) 6 mL kültür ortamı ve 2 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj ile doldurun. Ortamda asılı PDO'ları (PDO pelet hacmi, 4 μL) toplama odasına ekleyin ve sisteme ayarlayın.
  3. Odayı en az 1 dakika bekletin, ardından dağılım, böylece hücre kümeleri odanın dibine yerleşir; ardından, odanın taranmasını gerçekleştirin.
  4. Hücre kümelerinin otomatik seçimi için sistemde malzeme çekme boyutunu 140-160 μm (alan 15.386-20.000μm 2)olarak ayarlayın. Ardından, taranan görüntülerdeki seçili hücre kümelerinin kalitesini kontrol edin ve malzeme çekme ipuçlarını (bkz. Malzeme Tablosu) hedef plakaya kullanarak kuyu başına on hücre kümesi aktarın.
  5. 2.3. adımdan sonraki iletişim kuralı adımlarını gerçekleştirin.

4. Antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik için HTS

NOT: Bu adım, elektrik empedansı ölçüm cihazı olan ticari olarak kullanılabilen bir sistem (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilir. PTO'ların sitolizini antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik (ADCC) ile monoklonal antikorlar ve doğal öldürücü (NK) hücrelerle değerlendirmek için kullanılır (Şekil 3). NK hücreleri, üreticinin talimatlarına uyarak NK hücre üretim kiti kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinden üretilir (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. ADCC faaliyetinin ölçümü
    1. 0. günde, 96 kuyulu bir plakayı (bkz. Malzeme Tablosu)gece boyunca 4 °C'de 50 μL 10 μg/mL fibronektin çözeltisi (0,5 μg/kuyu) ile kaplanın.
    2. 1. günde, fibronektin çözeltisini çıkardıktan sonra, arka plan empedansını ölçmek için her kuyuya 50 μL kültür ortamı ekleyin.
    3. Tohumlamadan önce, PDO'lara 5 mL hücre kültürü ayrıştırma reaktifi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu)(RLUN007: 75 cm2 şişede PDO peletinin 100 μL'si) ve PDO'ları dağıtmak için20 dakika boyunca 37 °C'de bir CO 2 inkübatöründe kuluçkaya yatırın. Trypnizasyonu durdurmak için 5 mL orta, santrifüj ekleyin ve ayrışma reaktifini çıkarın. PDO'ları taze ortamla durulayın ve 40 μm hücre süzgecinden filtreleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    4. Hücre canlılığı çözümleyicisi kullanarak hücre sayısını sayma (bkz. Malzeme Tablosu).
    5. PDO süspansiyonu bir rezervuara aktarın ve çok kanallı bir pipetör kullanarak karıştırın. PDO süspansiyonu 96 kuyu plakasında 5 x10 4 hücreli/kuyudaki kuyulara ekleyin. Her kuyu 100 μL'lik son bir hacim içerir. Daha sonra plakayı 30 dakika boyunca yaklaşık 25 °C'de biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin.
    6. Plakayı 37 °C'de bir CO2 inkübatörde cihaza aktarın. Empedans sinyallerindeki değişiklikleri hücre indeksi olarak her 15 dakikada bir kaydedin.
    7. NK hücrelerini PDO tohumlama ile aynı gün 37 °C su banyosunda çözün. Hücreleri şişeden NK hücreleri için 10 mL orta içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu)ve yaklaşık 25 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatant atın ve hücre peletini 10 mL taze ortamda yeniden dirildi. Hücre sayımından sonra, hücre yoğunluğunu 1 x 106 hücre/mL'ye ayarlayın ve 75 cm2 şişeye aktarın. NK hücrelerini 37 °C'de%5 CO 2 inkübatörde kültüre edin.
    8. 2. günde, antikor çözeltilerini (fosfat tamponlu salin) steril V-bottom 96 kuyu plakalarında son konsantrasyonun 10 katına hazırlayın.
    9. Her kuyudan 60 μL orta çıkarın ve PDO'lara 10 μL trastuzumab veya cetuximab çözeltisi (10 μg/mL, 1 μg/mL ve 0,1 μg/mL) ekleyin. Plakaları bir inkübatördeki cihaza geri aktarın ve hücre indeksini 1 saat boyunca kaydedin.
    10. NK hücre süspansiyonu 50 mL tüpe aktarın ve hücre numarasını sayın. Hücreleri 300 x g'da 5 dakika santrifüj edin ve NK hücre yoğunluğunu PDO'lar için ortamla 1 x10 6 hücre/mL ve 2 x10 6 hücre/mL'ye ayarlayın.
    11. 1:1 veya 2:1 hedef (RLUN007) hücre oranındaki efektör (NK) hücrelerine 50 μL NK hücre süspansiyonu ekleyin. Antikorların son konsantrasyonları 1 μg/mL, 0,1 μg/mL ve 0,01 μg/mL'dir. Plakayı yaklaşık 25 °C'de 15 dakika tutun ve plakaları cihaza geri verin.
  2. Veri toplama ve analiz
    1. Analiz yazılımı kullanarak hücre dizinini yüzde sitoliz değerlerinedönüştürme (bkz. Malzeme Tablosu ).
    2. Sitoliz yüzdesi, NK hücreleri tarafından öldürülen hedef hücrelerin yüzdesini, yalnızca hedef hücrelere (PDO' lar) karşı bir denetim olarak ifade eder. Her zaman noktasında örnek kuyuların dizininden yalnızca NK hücreleri içeren kuyuların hücre dizinlerini çıkarın. Antikorların eklenmesinden hemen önce her değeri hücre indeksine normalleştirin. Aşağıdaki denklemi kullanarak normalleştirilmiş hücre indeksini yüzde sitolizine dönüştürün: % sitoliz = (1 - normalleştirilmiş hücre indeksi [örnek kuyular]) / normalleştirilmiş hücre indeksi (hedef tek başına kuyular) x 100.

Sonuçlar

Antikanser ajanlarını değerlendirmek için PDO'lar ve 384 kuyu mikro plakaları kullanılarak son derece doğru bir HTS geliştirilmiştir ve her PDO için bir HTS geliştirilmesi daha önce10 , 11,12,13olarak bildirilmiştir. HTS'nin performansı CV'ler ve Z'faktörü hesaplanarak değerlendirildi. Z'faktörü, test kalitesinin ve performansının doğrulanması için yaygın olarak kabul edilen bir yöntemdir ve bu değer > 0,514ise, test HTS için uygundur. RLUN007 kullanan 384 kuyu plaka testinde kontrol datum noktaları, Şekil 4'tegösterildiği gibi CV değerleri% 5.8 ve hesaplanan Z'-faktörleri 0.83 ile çok az değişkenlik gösterdi. Bu sonuçlar, bu tahlilin HTS için yüksek performansa sahip olduğunu göstermektedir. PDO'ların HTS kullanarak antikanser ajanlarına duyarlılığını araştırmak, büyüme inhibisyonu, özellikle epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) inhibitörleri (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib ve rosiletinib) ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri için standart klinik tedaviler olan paclitaxel ve pozitif kontrol olarak mitomycin C ile tedavi edilen sekiz antikanser ajan ile tedavi edilen RLUN007 kullanılarak değerlendirildi. Her PDO için antikanser ajanlarınınIC 50 ve AUC değerleri Şekil 4'tegösterilmiştir. RLUN007, tüm EGFR inhibitörleri ve diğer antikanser ajanlar için yüksek hassasiyet (IC50 < 2 μM, AUC < 282) gösterdi. Tüm veriler için hesaplanan sigmoid eğrileri, antikanser ajanlarının büyüme inhibitör aktivitesinin doğru bir şekilde ölçülebileceğini gösterdi.

Hücre toplama ve görüntüleme sistemi, veriler yukarıdaki metodoloji kullanılarak önemli ölçüde değiştiğinde kullanılır. Hücre kümelerini zarar vermeden doğru bir şekilde seçen hücre toplama ve görüntüleme sistemi, hücre kalıntılarını tahlil sisteminden dışlamak için hücre kümesi boyutunu hizalayarak doğru HTS tahlillerine olanak tanır. Sistem kullanılmadığında CV değeri &,0, Z'faktör değeri 0,23 (veriler gösterilmedi) idi. Bununla birlikte, CV ve Z'faktör değerleri sistem kullanılarak sırasıyla % 6.4 ve 0.81 oranında geliştirilmiştir.

Hücrelerin sayısını, morfolojisini ve bağlanmasını uzun süre izleyen elektriksel empedans ölçüm cihazını kullanarak ADCC aktivitesine sahip PDO'ların sitolizini araştırmak için, 96 kuyulu bir plakada efektör hücreler olarak antikorlar (trastuzumab ve cetuximab) ve NK hücreleri ile tedavi edilen RLUN007 kullanılarak empedans sinyallerindeki değişiklikler değerlendirildi. Sadece hedef hücrelerden oluşan kontrol ile karşılaştırıldığında, sitoliz yüzdesi zamanla artmıştır. Antikorlar olmadan 1:1 ( Şekil 5A,C) veya 2:1 (Şekil 5B,D ) E:T oranında 6 saat sonra% 45 veya%75'eulaştı. Trastuzumab kullanan NK hücre aracılı sitoliz, sırasıyla 6 saat 1:1(Şekil 5A, 1 μg/mL) ve 2:1(Şekil 5B

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

PDO'ların benzersiz özelliği, kültür veya tahlil sırasında tek hücrelere enzmatik olarak ayrılmamaları ve kültürdeki hücre kümelerini korumalarıdır. Bu nedenle, hücre sayısı mikroskop altında doğru bir şekilde sayılamaz. Bu sorunu çözmek için, hücre sayısı, hücreleri içeren bir santrifüj tüpünün 50-200 μL seviyeleri ile işaretlenmiş tüplerle astarlanarak görsel olarak belirlenir (Şekil 1B). Ayrıca, 25cm 2 matarada kültürlenen hücre kümelerinin pelet hacmini görsel olarak ölçmek zor olduğundan, geçiş zamanı kırmızıdan sarıya orta renk değişimi ve gösterge olarak geçme süresi ile karşılanan tek hücre veya döküntüdeki gözle görülür artış kullanılarak belirlenmiştir (Şekil 1A,C). PDO'lar için geçiş noktası budur. PDO peletlerinin miktarı, her orta değişimde santrifüjlemeden sonra görsel olarak ölçülür. Pelet hacmi artmaktan durduğunda ve orta değiştirmeden sonraki gün orta sarıya döndüğünde, ortamın yoğunluğa doymuş olduğu kabul edilir ve geçiş yapılır. Pelet hacmi her PDO için tanımlanır. PDO'lar çoğalmazsa, orta değişim sırasında ortam miktarı% 80'den% 50'ye değiştirilir ve PDO'ların yoğunluğu kültürde artar.

PDO'lara uygun bir HTS geliştirildi. Verimi, bir adet 75 cm2 şişe PDO kullanılarak gerçekleştirilen en az on ila yirmi 384 kuyu plakasıdır ve günde işlenen plaka sayısı en az 50'dir. Ayrıca, çeşitli antikanser ilaçların PDO'lar kullanılarak HTS tarafından değerlendirilmesinin sonuçları zaten bildirilmiştir.

HTS yapılırken, hücre parçalanma ve dispersiyon ekipmanı kullanılarak F-PDO'ların kıyılması sonucu oluşan mesh filtresinin tıkanması, başlangıçta filtrenin ağ boyutunun 100 μm olarak değiştirilmesiyle giderilir. Bir sonraki adım, cam kap için uygulanan PDO süspansiyonunun hacmini azaltmaktır. HTS için test maddesi çözeltileri hazırlanırken, düşük moleküler ağırlıklı bileşikler genellikle dimetil sülfit içinde çözülür ve antikorlar fosfat tamponlu salinde çözülür. Test maddesi olarak uygun çözücü kullanılır ve kontrol verileri kullanılan çözücüden elde edilir.

Aşağıda, tahlil verilerindeki değişkenlikle nasıl başa çıkılacağına ilişkin bir açıklama yer uzamıştır. Testte 384 kuyu plakası kullanılarak yapılan verilerde büyük bir değişiklik varsa, test plakası 96 kuyu plakası formatına değiştirilmelidir. PDO seyreltme faktörü (tohumlu hücre kümelerinin sayısı) da plakanın tohumlanması sonrasında incelenir. Son olarak, hücre toplama ve görüntüleme sistemi, test için PDO'ların boyutunu seçmek için kullanılabilir. PDO'ları odaya eklemeden önce, PDO'ları doğru tanıyabilmek için tek hücreler ve küçük hücre kümeleri düşük hızlı santrifüjleme ile çıkarılmalıdır. Odaya PDO'lar ekledikten sonra tek hücreler veya küçük hücre kümeleri görünüyorsa, tek hücreleri kaldırmak için birden çok dağılım gerçekleştirilebilir. Daha sonra, hücre toplama ve görüntüleme sistemi plakanın sıcak tutulmasını sağlayan bir işleve sahip olsa da, sistem uzun süre çalışırken kültür ortamının buharlaşması nedeniyle bu işlev kullanılmaz. Son olarak, düzlemsel bir görüntü tarafından tanındığı için hücre kümelerinin hacmi bilinmemektedir. Ayrıca, iki veya daha fazla PDO çakışırsa, tek bir PDO doğru şekilde tanınamaz. Ancak, taşımadan sonra taranan görüntüde kontrol ederek kaldırma işlevini kullanarak istenmeyen PDO'ları kaldırmak mümkündür.

Elektrik empedansı ölçüm cihazı genellikle hücre çoğalması sırasında empedanstaki değişiklikleri izlemek için yapışan hedef kanser hücreleri için kullanılır. Bu nedenle, yapışmayan PDO'ların hücre dizininde bir değişiklik algılanmıyor. Bu sorunu çözmek için PDO tipine bağlı olarak PDO yoğunluğu ve enzimmatik tedavi (hücre ayrışma enzimi ve tedavi süresi) gibi tohumlama koşullarının araştırılması gerekmektedir. Plakadaki kuyular da PDO'ların tohumlama için uygun bir hücre dışı matrisle kaplanmalıdır. PDO'ların türüne bağlı olarak PDO'lar enzimamatik tedavi olmadan tohumlanır. RLUN007, PDO'ları enzimmatik tedavi ile dağıttıktan sonra 96 kuyu plakasına tohumlayarak empedansı ölçmek için kullanıldı. RLUN007, hücreleri dağıtmak ve 96 kuyu plakasının kuyularına bağlamak için 37 ° C'de 20 dakika boyunca hücre kültürü ayrıştırma reaktifi ile tedavi edildi. Ayrışmış RLUN007 hücrelerinin hemen agrega oluşturduğu göz önüne alındığında, bir süzgeç kullanılarak filtrasyondan hemen sonra plakalara tohumlanması arzu edilir. Hücre süspansiyonu tüpten bir rezervuara transfer edildikten sonra, rezervuar iki ila üç kez sağdan sola doğru hafifçe hareket ettirildi ve plakaya tohum atmadan önce beş kez yukarı ve aşağı borulandı. Süspansiyon da kuyuya her ilave ile karıştırıldı. Plaka daha sonra hücrelerin kuyuda eşit olarak dağılmasını sağlamak için 30 dakika (PDO'lar için) veya 15 dakika (NK hücreleri için) biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirildi. İkinci önemli nokta, antikorlar ve NK hücreleri ile tedavinin hücre indeksi platoya ulaşmadan önce gerçekleşmesi için zamanlanmış olması ve değerin 0,5'ten az olmamasıdır. RLUN007 durumunda, teste başlamak için en uygun süre kaplamadan sonra 20-22 saattir ve tohumlama için hücre sayısı 5 x 104 hücre / kuyudur.

Genel olarak, tümör organoidleri için kültür ve tahliller, tümör dokusu iskeleleri oluşturmak için Matrigel gibi hücre dışı matrisler veya organoidleri bozmak için tripsin ve kollajenaz gibi enzimler kullanır 3,4,5,6,7. Bu yöntemin avantajı, kültür ve tahlil sırasında hücre dışı matris veya enzimamatik tedaviye gerek olmamasıdır (elektrik empedansı ölçüm cihazını kullanan tahliller hariç), bu da işçilik gereksinimlerini ve maliyetlerini önemli ölçüde azaltır. Ayrıca, bu yöntemin HTS tahlil sistemlerine ve çeşitli ölçüm sistemlerine uyarlanabilir olması nispeten kolaydır. Bununla birlikte, hücre dışı matris kullanımı bazı araştırma amaçları için arzu edilir, çünkü hücreler için bir iskele görevi görür ve dokularda morfogenez, farklılaşma ve homeostazı etkileyebilir.

Bu çalışmada EGFR inhibitörlerine klinik olarak duyarlı olan EGFR mutasyonu (L858R) ve EGFR geninin yüksek ekspresyosu (veri gösterilmeyen) olan PDO'lar (RLUN007) EGFR inhibitörlerini değerlendirmek için kullanılmıştır. RLUN007'nin EGFR inhibitörlerine duyarlılığının diğer akciğer kanseri türevli F-PDO'lardan daha yüksek olduğu gösterilmiştir13 (Şekil 4). Bu nedenle, tümör dokusunun özelliklerini koruyan PDO'ları kullanan bir HTS, potansiyel antikanser ajanlarının değerlendirilmesi için üstündür ve ilaç değerlendirmesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki gelişmeler için fırsatlar sunar. HTS ajanların ilk taraması için uygun olmasına rağmen, tümör mikroçevrimini yeniden üretmez ve bu nedenle ilaçların vivoetkinliğini değerlendiremez. Bu nedenle, hayvan modellerinin yokluğunda damar endotel hücreleri ve diğer stromal hücreler veya çip üzerindeki organ teknolojisi ile birlikte kültürle insan tümör dokusunu in vivo olarak taklit ranabilen bir in vitro sistem geliştiriliyor.

Açıklamalar

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation, lisans devri ile F-PDO ve F-PDO medyasının ticari sahibi fujifilm Wako Pure Chemicals'ın bir yan kuruluşudur.

Teşekkürler

Bu araştırmada kullanılan klinik örnekleri sağlayan hastalara teşekkür ederiz. Bu araştırma Fukuşima Vilayeti Çeviri Araştırma Programı'ndan alınan hibelerle desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
384 kuyulu Ultra Düşük Bağlantılı KüreselMikroplaka Corning4516Plakaları
; m Hücre SüzgeciCorning352340
AdoptCell-NK kitiNK hücre üretimi içinKohjin Bio16030400
Kanser Hücresi Genişletme Ortamı artıFujifilm Wako Saf Kimyasal032-25745F-PDO için Orta
ALyS505N-175Hücre Bilimi ve Teknoloji enstitüsü10217P10NK hücreleri için ortam
HÜCRE İŞLEYİCİYamahaMotor-Hücretoplama ve görüntüleme sistemi
CellPet FTJTEC-Hücreparçalanması ve dispersiyon ekipmanı
CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılığı TestiPromegaG9683Hücre canlılığı ışıldayan deneyi, hücre içi ATP ölçüm reaktifi
Echo 555Labcyte-Sıvı işleyici
EnSpirePerkinElmer-Plakaokuyucu
E-plaka VIEW 96Agilent300601020Plakaları, xCELLigence RTCA Sistemi ile hücre bazlı testler yapmak için özel olarak tasarlanmıştır
Fibronektin ÇözeltisiFujifilm Wako Pure Chemical063-05591xCELLigence RTCA Sistemi
F-PDOiçin plaka kaplamasıFujifilm Wako Pure Chemical veya Summit PharmaceuticalsInternational-F-PDO, Fujifilm Wako Pure Chemicals veya Summit Pharmaceuticals International'dan satın alınabilir
Morphit yazılımı, sürüm 6.0The Edge Yazılım DanışmanlığıBiyolojik veri analizi yazılımı
Multidrop CombiThermoFisher Scientific5840300Hücre süspansiyon dağıtıcısı
Hassas OdaCELLHANDLER kullanarak hücre kümelerini toplamak içinJLE9M65W230
Hassas UçYamaha MotorJLE9M65W300CELL HANDLER kullanarak hücre kümelerini toplamak için mikro uç
RLUN007Fujifilm Wako Pure Chemical veya Summit Pharmaceuticals InternationalAkciğer tümöründen türetilmiş F-PDO
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604021Hücre kültürü ayrışma reaktifi
Ultra Düşük Bağlantı 25 cm² ŞişeCorning4616PDO Ultra
Düşük Ataşman için Kültür şişesi 75 cm² ŞişeCorning3814PDO
Vi-CELL XR Hücre Canlılık Analiz CihazıBeckman coulter-Cellcanlılık analizörü
xCELLigence immünoterapi yazılımı, sürüm 2.3 xCELLigenceRTCA Sistemi için ACEA Bioscience-Analiz yazılımı
xCELLigence RTCA SistemiACEA Bioscience-Elektrikempedans ölçüm cihazı Sitoliz
HTS 40-&mikro için KitiYamaha Motor Haznesi Sistemi için kültür şişesi

Kaynaklar

  1. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
  2. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  3. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116(2018).
  4. Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327(2019).
  5. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  6. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
  7. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  8. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  9. Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321(2019).
  10. Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690(2020).
  11. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
  12. Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481(2019).
  13. Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406(2021).
  14. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Y ksek Kapasiteli AnalizT m r Organoid K lt rAntikanser la Tarama384 Kuyucuklu PlakaAntikor Ba ml SitotoksisiteH cre i ATP l mH cre K mesi Se meSferoid MikroplakasKi iselle tirilmi Kanser Modeli
Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.