Yöntem makalesi

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

DOI:

10.3791/62757

⸱

5 Ocak 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntravital mikroskopi (IVM), hücre hareketinin, bölünmesinin ve ölümünün tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilmesini sağlar. Cerrahi olarak yerleştirilmiş görüntüleme pencerelerinden IVM özellikle güçlüdür, çünkü aynı dokunun günler ila haftalar boyunca uzunlamasına gözlemlenmesine izin verir. Tipik görüntüleme pencereleri, farenin derisine dikilmiş biyouyumlu metal bir çerçevede cam bir kapak kaymasından oluşur. Bu pencereler farelerin serbest dolaşımına müdahale edebilir, güçlü bir enflamatuar yanıt ortaya çıkarabilir ve herhangi biri ötenazi gerektirebilecek kırık cam veya yırtık dikişler nedeniyle başarısız olabilir. Bu sorunları ele almak için, uzun süreli abdominal organ ve meme bezi görüntüleme pencereleri, daha önce kranial görüntüleme pencereleri için kullanılan optik olarak berrak bir silikon polimer olan ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) filminden geliştirilmiştir. Bu pencereler doğrudan dokulara yapıştırılabilir ve bu da yerleştirme için gereken süreyi azaltır. PDMS esnektir ve zaman içinde farelerde dayanıklılığına katkıda bulunur - 35 güne kadar test edilmiştir. Uzunlamasına görüntüleme, aynı doku bölgesinin ayrı seanslar sırasında görüntülenmesidir. Aynı bölgeyi lokalize etmek için pencerelerin içine paslanmaz çelik bir ızgara yerleştirildi ve dinamik süreçlerin (meme bezi evrimi gibi) aynı yerlerde, günler arayla görselleştirilmesine izin verildi. Bu silikon pencere aynı zamanda zamanla mikro-metastazlara dönüşen tek yayılmış kanser hücrelerinin izlenmesine de izin verdi. Bu çalışmada kullanılan silikon pencerelerin yerleştirilmesi metal çerçeveli cam pencerelere göre daha basittir ve görüntülenen dokuların sınırlı iltihaplanmasına neden olur. Ayrıca, gömülü ızgaralar, tekrarlanan görüntüleme oturumlarında aynı doku bölgesinin doğrudan izlenmesini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntravital mikroskopi (IVM), anestezi uygulanan hayvanlarda dokuların görüntülenmesi, bozulmamış dokularda hücresel çözünürlükte fizyolojik ve patolojik olayların dinamikleri hakkında fikir verir. Bu tekniğin uygulamaları büyük ölçüde değişmektedir, ancak IVM, kanser hücrelerinin dokuları nasıl istila ettiğini ve metastaz yaptığını, çevredeki mikro çevre ile etkileşime girdiğini ve ilaçlara nasıl yanıt verdiğini aydınlatmaya yardımcı olmak için kanser biyolojisi alanında etkili olmuştur 1,2,3. Ek olarak, IVM, ex vivo profilleme yaklaşımlarına (örneğin, akış sitometrisi) tamamlayıcı içgörüler sağlayarak bağışıklık tepkilerini yöneten karmaşık mekanizmaların anlaşılmasını ilerletmenin anahtarı olmuştur. Örneğin, intravital görüntüleme deneyleri, hücre göçü ve hücre-hücre teması ile ilgili olarak bağışıklık fonksiyonları hakkında ayrıntıları ortaya çıkarmış ve yaralanma veya enfeksiyona yanıt olarak uzaysal zamansal dinamikleri ölçmek için bir platform sunmuştur 4,5,6,7. Bu süreçlerin birçoğu histolojik boyama yoluyla da incelenebilir, ancak yalnızca IVM dinamik değişikliklerin izlenmesine izin verir. Aslında, histolojik bir kesit belirli bir zamanda dokunun anlık görüntüsünü sunarken, intravital görüntüleme zaman içinde aynı doku içindeki hücreler arası ve hücre altı olayları izleyebilir. Özellikle, floresan etiketlemesindeki ilerleme ve moleküler muhabirlerin gelişimi, moleküler olayların proliferasyon, ölüm, hareketlilik ve diğer hücrelerle veya hücre dışı matriks ile etkileşim gibi hücresel davranışlarla ilişkilendirilmesine izin vermiştir. Çoğu IVM tekniği, ışık saçılması nedeniyle daha derin dokuların görüntülenmesini zorlaştıran floresan mikroskopiye dayanmaktadır. Bu nedenle, ilgilenilen dokunun sıklıkla invaziv ve terminal bir prosedürle cerrahi olarak maruz bırakılması gerekir. Böylece, organ bölgesine bağlı olarak, doku birkaç ila 40 saat8 arasında değişen bir süre boyunca sürekli olarak görüntülenebilir. Alternatif olarak, kalıcı bir görüntüleme penceresinin cerrahi olarak yerleştirilmesi, aynı dokunungünler ila haftalar 7,9 arasında sırayla görüntülenmesine izin verir.

Yeni görüntüleme pencerelerinin geliştirilmesi, intravital görüntüleme yaklaşımlarını daha da geliştirmek için teknolojik bir ihtiyaç olarak vurgulanmıştır10. Prototipik intravital görüntüleme penceresi, dikişlerle cilde sabitlenmiş cam bir örtü içeren metal bir halkadır11. Serbest dolaşıma müdahale, eksüda birikimi ve cam kapak kaymasının zarar görmesi, bu tür pencerelerin kullanılmasında görülen yaygın sorunlardır. Dahası, prototipik pencere özel üretim gerektirir ve cerrahi prosedür kapsamlı bir eğitim gerektirebilir. Bu sorunları ele almak için, daha önce beyin12'de uzun süreli görüntüleme için kraniyal pencerelerde kullanılan bir silikon polimer olan polidimetilsiloksan (PDMS), abdominal organ ve meme bezi görüntülemesinde kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Burada, PDMS tabanlı silikon pencereler oluşturmak için, aynı doku bölgelerinin tekrarlanan görüntülenmesi için işaretler sağlamak üzere pencerenin paslanmaz çelik bir ızgaranın etrafına nasıl döküleceği de dahil olmak üzere ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır. Ayrıca, pencerenin karın organlarının veya meme bezinin üzerine yerleştirilmesi için basit, dikişsiz bir cerrahi prosedür tanımlanmıştır. Bu yeni yaklaşım, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir ve uzunlamasına intravital görüntülemenin erişilebilirliğini artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan tüm prosedürler Cold Spring Harbor Laboratuvarı Cerrahi Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Cold Spring Harbor Laboratuvarı'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Silikon pencerenin dökümü

  1. Baz elastomeri ve kürleme maddesini 10:1 (v/v) oranında karıştırarak silikon polimeri (PDMS) hazırlayın.
  2. Steril, pürüzsüz bir yüzeye az miktarda PDMS koyarak bir pencere açın ve hacim-alan oranını istenen kalınlığa ayarlayın.
    NOT: 24 kuyu plakalı kapağın kapağındaki 22 mm çaplı bir daire için 200 mg polimer çözeltisinin kullanılması, pencere sağlamlığı ile optik netlik arasında iyi bir uzlaşma sağlar.
  3. İsteğe bağlı: Aynı doku bölgelerinin tekrar tekrar görüntülenmesi için işaretler sağlamak amacıyla, PDMS istenen döküm yüzeyine geldikten sonra paslanmaz çelik bir ızgarayı silikonun içine hafifçe bastırın.
  4. Hava kabarcıklarını gidermek için, kaplanmış yüzeyi polimerin gazını gidermek üzere 45 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
  5. Silikon pencereleri 80 °C'de bir fırında 45 dakika kürleyin.
  6. Polimeri kalıbın kenarlarında puanlayın ve kürlenmiş pencereleri forseps ile döküm için kullanılan yüzeyden yavaşça soyun.
  7. Ameliyattan önce, pencereleri otoklavlama ile sterilize edin.

2. Fareyi silikon pencerenin yerleştirilmesi için hazırlama

  1. Fareyi bir indüksiyon odasında %4 (v/v) izofluran kullanarak anestezi altına alın. Fareyi ameliyat masasındaki bir ısıtma pedine getirin, fareyi anestezi burun maskesine yerleştirin ve ameliyat boyunca bakım için izofluran konsantrasyonunu% 2'ye düşürün.
  2. Arka bacakların ayak parmaklarını sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. Fare devre dışı kalana ve ayak parmağını sıkıştırma refleksi tepkisi göstermeyene kadar devam etmeyin.
  3. Kurumasını önlemek ve travmayı önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
  4. Preemptif analjezi (buprenorfin 0.05 mg/kg) deri altından uygulanır.
  5. Ameliyat bölgesini tıraş edin ve bir epilasyon kremi ile tüyleri tamamen çıkarın.
  6. Cerrahi bölge enfeksiyonunu önlemek için povidon-iyot çözeltisi (% 10 v / v) ve etanol (% 70 v / v) art arda 3x uygulayın.

3. Karaciğerde görüntüleme için bir ventral pencere yerleştirmek; diğer karın organları için uyarlanabilir (Şekil 1)

  1. Fareyi sırtüstü konuma getirin.
  2. Steril makas ve forseps kullanarak ksifoid işlemden 3 mm aşağıya doğru 10 mm'lik bir kesi yapın.
  3. Orta hat boyunca cildin 1–1,5cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
  4. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
  5. İsteğe bağlı: Karaciğerin daha büyük bir bölümünü görselleştirmek için, karaciğeri diyaframa bağlayan falsiform ligamenti ortaya çıkaran karaciğeri diyaframdan aşağı itmek için steril salin ile nemlendirilmiş steril pamuklu çubuklar kullanın. İnferior vena kavayı kesmemeye özen göstererek bağı kesin.
  6. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki karaciğer yüzeyine az miktarda uygulayın. Bu yapıştırıcı, görüntüleme için orta alanı sağlam bırakan dairesel bir sızdırmazlık oluşturur.
    DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez. Yapıştırıcıyı uygulamadan önce dokuyu kurutmak gerekli değildir.
    NOT: Bu prosedür için herhangi bir siyanoakrilat bazlı yapıştırıcı başarıyla kullanılabilir. Cerrahi yapıştırıcı sterilite sağlar. Terminal prosedürleri için, çok amaçlı süper yapıştırıcılar iyi sonuçlar verir.
  7. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) karaciğere sıkıca tutun.
  8. Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
  9. Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
  10. Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
    NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, karaciğer dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
  11. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
    DİKKAT: İşlem steril cerrahi teknikler kullanılarak gerçekleştirilirse ve pencere yerleştirilmeden önce sterilize edilirse, yaranın cerrahi yapıştırıcı ile kapatılması enfeksiyonları önlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, cerrahi yerleştirme sırasında uygun aseptik tekniklerin izlenmemesi veya kusurlu kapanma, açık veya subklinik enfeksiyona ve dokudan kurumaya neden olabilir.

4. Karaciğerde görüntüleme için yanal bir pencere yerleştirilmesi; portal vendeki kanser hücrelerinin eşzamanlı enjeksiyonu ile uyumlu (Şekil 2)

  1. Fareyi sol lateral decubitus pozisyonuna yerleştirin
  2. Steril makas ve forseps kullanarak kostal kemerin 3 mm altında sağ kanatta 10 mm'lik bir kesi yapın.
  3. Cildin 1cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
  4. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
  5. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki karaciğer yüzeyine az miktarda uygulayın.
    DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez.
    NOT: Bu prosedür için herhangi bir siyanoakrilat bazlı yapıştırıcı başarıyla kullanılabilir. Cerrahi yapıştırıcı sterilite sağlar. Terminal prosedürleri için, çok amaçlı süper yapıştırıcılar iyi sonuçlar verir.
  6. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) karaciğere sıkıca tutun.
  7. Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
  8. Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
  9. Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
    NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, karaciğer dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
  10. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
  11. Portal ven enjeksiyonu gerekiyorsa:
    1. Fareyi sırtüstü konuma getirin.
    2. Derideki ksifoid süreçten başlayarak 10 mm'lik bir kesi yapın.
    3. İkinci bir çift steril makas ve forseps kullanarak, peritonda 10 mm'lik bir kesi yapın.
    4. İki pamuklu çubuğu steril salin içine batırın.
    5. Bağırsağı steril salin ile nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerine nazikçe çekmek için pamuklu çubukları kullanın, oryantasyonu bükmemeye veya başka bir şekilde üzmemeye dikkat edin.
    6. Portal ven karnın sağ tarafında görünene kadar bağırsağı karın boşluğundan çıkarmaya devam edin.
    7. Portal venin karaciğere giriş noktasına 31–33 G iğne 5–7 mm'lik bir kaudal yerleştirin, kan damarı içinde ilerlediğinizden emin olun, içinden geçmediğinizden emin olun.
    8. Kanser hücrelerini yavaşça enjekte edin (100 μL steril PBS'de yeniden askıya alınır).
      NOT: Bu deney için amurin pankreas kanseri hücre hattı (örneğin, KPC-BL / 6-1199) tam DMEM ortamında kültürlenebilir ve 100 μL steril PBS'ye enjekte edilen 1 x 105 hücre.
    9. Kanamayı önlemek için, iğneyi çektikten hemen sonra, enjeksiyon bölgesine 1-2 dakika boyunca küçük bir cerrahi sünger parçası ile hafif bir baskı uygulayın.
    10. Basınç serbest bırakıldıktan sonra, hemostazı sağlamak için bölgeyi 1-2 dakika izleyin.
    11. Nemlendirilmiş pamuklu çubuklar kullanarak, organın fizyolojik yönelimini takiben bağırsağı karın boşluğuna geri döndürün.
    12. Steril forseps kullanarak, pencereyi periton altına, farenin karın boşluğunun sol tarafına yerleştirin.
    13. 4-0 ipek dikişle sütür ve 7 mm paslanmaz çelik sargı klipsleri ile orta hat kesisini zımbalayın.
    14. Fareyi sol lateral decubitus konumuna getirin
    15. Steril makas ve forseps kullanarak kostal kemerin 3 mm altında sağ kanatta deriden 10 mm'lik bir kesi yapın.
    16. Kesinin etrafındaki cildin 1cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
    17. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
    18. 4.8-4.10 adımlarında açıklandığı gibi, pencereyi yerine yapıştırmadan önce karaciğerin üzerine çekin.

5. Pankreasta görüntüleme için pencerenin yerleştirilmesi (Şekil 3)

  1. Fareyi sağ lateral decubitus pozisyonuna getirin.
  2. Sol kanatta kostal kemerin 3 mm altında steril makas ve forseps kullanarak 10 mm'lik bir kesi yapın.
  3. Kesinin etrafındaki cildin 1cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
  4. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
  5. Steril salin ile ıslatılmış steril pamuklu çubuklar kullanarak, pankreası görselleştirmek için dalağı yavaşça çekin. Kesi boyunca daha fazla yüzey alanı görünür hale getirmek için pankreası nemlendirilmiş pamuklu çubuklarla yeniden konumlandırmaya devam edin.
    NOT: Bu noktada, pankreas kanseri hücreleri, deneysel tasarımın bir parçasıysa, pankreasa ortopik olarak enjekte edilebilir.
  6. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki pankreasın yüzeyine az miktarda uygulayın.
    DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez.
  7. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) pankreasa sıkıca tutun.
  8. Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
  9. Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
  10. Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
    NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, pankreas dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
  11. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.

6. Meme bezinde görüntüleme için pencerenin yerleştirilmesi (Şekil 4)

  1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
  2. Steril makas ve forseps kullanarak kasık meme uçlarından birine medial 10 mm'lik bir kesi yapın.
  3. Meme bezinin üzerindeki cildin 0,5cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
  4. Yapışmayı bozmak için makası iki yüzey arasına yayarak meme bezini ciltten dikkatlice ayırmak için ikinci bir çift steril makas kullanın.
    NOT: Kasık meme bezi alanının görüntülenmesini kolaylaştırmak için, memeli bezin üzerindeki cildin bir kısmını diseke etmeye dikkat edin, ancak arka bacaktan daha üstündür, böylece pencere farenin hareketliliğini sınırlamaz.
  5. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki meme bezinin yüzeyine az miktarda uygulayın.
    DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez.
  6. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) meme bezine sıkıca tutun.
    NOT: Doğru yapıldığında meme bezi dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
  7. Pencerenin kenarlarını cildin altına katlayın.
  8. Bir şırınga ile, şimdi cildin altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Cildi pencereye sabitlemek için forseps ile cildi aşağı doğru itin.
  9. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.

7. Ameliyat sonrası iyileşme

  1. Fareyi, geniş yuvalama malzemesine sahip temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin ve kafesin bir kısmının bir ısıtma yastığı üzerinde durduğundan emin olun.
  2. Fareyi bilinçli ve hareketli olana kadar sürekli izleyin.
  3. Gerekirse, önleyici dozdan 12 saat sonra ek bir analjezik dozu sağlayın.
    NOT: Ek analjezi genellikle gereksizdir, ancak fare sıkıntı belirtileri gösteriyorsa (kambur sırt, dağınık kürk veya yiyeceğe olan ilginin kaybolması gibi) bir veterinere danışın. Fareyi ameliyattan sonraki ilk 3 gün boyunca enfeksiyon belirtileri veya diğer olumsuz etkiler açısından günlük olarak izleyin. Farelerin% 2'sinden azı, tipik olarak pencerenin kısmen ayrılması nedeniyle veteriner dikkati veya ötenazi gerektirir. Ventral karaciğer görüntüleme pencerelerine sahip erkek fareler için, fareler arasındaki kavganın pencerelerin ayrılmasıyla sonuçlanabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu, fareleri ayrı ayrı barındırarak önlenir.

8. Pencereden görüntüleme

  1. Fareyi bir indüksiyon odasında %4 (v/v) izofluran kullanarak anestezi altına alın.
  2. Kurumasını önlemek ve travmayı önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
  3. Fareyi indüksiyon odasından mikroskop aşamasına getirin. Fareyi anestezi burun maskesine yerleştirin ve görüntüleme prosedürü boyunca idame anestezisi için izofluran konsantrasyonunu yaklaşık% 1-1.5'e düşürün.
  4. Nefes alma hızını izlemek için farenin altına bir basınç yastığı sensörü yerleştirin ve yumuşak cerrahi bant kullanarak fareyi sahneye sabitleyin.
  5. Görüntüleme oturumu boyunca vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre takın.
  6. Isıtılmış pedi açın, vücut sıcaklığının 37 ° C'yi geçmemesini sağlamak için fareyi yakından izleyin.
  7. Farenin nefes hızını izlemek için yazılımı kullanın. En uygun hız ~ 1 nefes / saniyedir. Anesteziyi gerektiği gibi ayarlayın.
  8. Her görüntüleme seansından önce, pencereyi herhangi bir artık lens daldırma ortamından ve kalıntılarından, %70 etanol (v/v) içine batırılmış bir pamuklu çubukla nazikçe silerek temizleyin.
  9. Bir suya daldırma lensi kullanırken, kabarcıklardan kaçınarak pencereye ultrason jeli uygulayın.
    NOT: Damıtılmış su da kullanılabilir, ancak görüntüleme sırasında yeniden uygulanması gerekebilir.
  10. Görüntüleme için en uygun derinliği bulmak için, önce ızgarayı bulun ve odağa yerleştirin.
  11. Izgaranın alt kısmını 0 olarak ayarlayarak yaklaşık doku görüntüleme derinliğini belirleyin. Bu bilgi, sonraki görüntüleme oturumlarında karşılık gelen z düzlemini bulmak için gereklidir.
  12. Birden fazla görüntüleme oturumunda aynı konumu tanımlamak için, ızgaradaki kareleri referans noktası olarak kullanın. Görüntüleme sırasında, görüntülenen her görüş alanının ızgarası içindeki ızgaranın yönünü ve konumunu not edin (örneğin, üstten 2. sıra, soldan 4. kare).
  13. Ardışık görüntüleme oturumları sırasında, belirli ızgara alanlarına ve dolayısıyla görüntüleme alanlarına geri dönmek için ızgarayı kullanın.
  14. Her görüntüleme seansını takiben, pencereyi %70 etanol (v/v) içine batırılmış pamuklu çubukla nazikçe silerek artık lens daldırma ortamını ve kalıntılarını temizleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görüntüleme pencereleri aracılığıyla intravital görüntüleme, saatler ila haftalar boyunca tek hücre çözünürlüğünde çok çeşitli hücresel ve moleküler olayları gözlemlemek, izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Bir görüntüleme penceresi için ideal özellikler şunlardır: a) farenin refahı ve dokunun fizyolojisi üzerinde sınırlı etki; b) dayanıklılık; c) yerleştirme kolaylığı; ve d) aynı bölgenin tekrar tekrar görüntülenmesi için açık yer işaretleri. Sonuç, kolayca üretilebilen ve yerleştirilebilen ve birkaç görüntüleme sean...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntravital görüntüleme pencereleri, fizyolojik ve patolojik süreçleri zaman içinde ortaya çıktıklarında hücresel çözünürlükte doğrudan görselleştirmek için önemli araçlardır. Farelerde esnek, silikon görüntüleme pencerelerinin dökümü ve yerleştirilmesi için açıklanan yeni prosedür, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle (eksüda, kırılma ve normal hareketliliğe müdahale) ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir, fare için ek güvenlik sağlar ve bu tekniğin erişilebilirliğini artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E., Insmed, Inc. için brensocatib'in araştırma danışma kurulu üyesidir; Vividion Therapeutics, Inc.'in bilimsel danışma kurulu üyesi; Protalix, Inc. için bir danışman; D.A.T., Mestag Therapeutics'in kurucu ortağıdır ve bilimsel danışma kurulunda yer almaktadır ve Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology ve Cygnal Therapeutics'te hisselere sahiptir. Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rob Eifert'e lazer kesimli paslanmaz çelik ızgaraların tasarlanması ve optimize edilmesindeki yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, CSHL Kanser Merkezi (P30-CA045508) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) M.E. için fonlar (1R01CA2374135 ve 5P01CA013106-49) tarafından desteklenmiştir; CSHL ve Northwell Health; Thompson Aile Vakfı; Amerika'da Yüzmek; ve Simons Vakfı'ndan CSHL'ye bir hibe. Yüksek Lisans, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Tıp Bilimcisi Eğitim Programı Eğitim Ödülü (T32-GM008444) ve NIH Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından 1F30CA253993-01 ödül numarası altında desteklenmiştir. L.M., James S. McDonnell Vakfı Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmektedir. J.M.A., Kanser Araştırma Enstitüsü / Irvington Doktora Sonrası Bursu (CRI Ödülü #3435) sahibidir. D.A.T., Lustgarten Vakfı Pankreas Kanseri Araştırmaları Özel Laboratuvarı ve Thompson Aile Vakfı tarafından desteklenmektedir. Karikatürler Biorender.com ile yaratıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3M Medipore Yumuşak Kumaş Cerrahi Bant3M70200770819
İpek sütür 4-0 PERMA EL SİYAH 1 x 18" RB-2Etikon N267H
ACTB-ECFP farelerJackson Laboratuvarı22974
AEC Substrat Kiti, Peroksidaz (HRP), (3-amino-9-etilkarbazol)Vektör Laboratuvarları SK-4200
Alkollü bezlerBD 
Anestezi sistemiMoleküler Görüntüleme Ürünleri A.Ş.
Acqknowledge yazılım ve sensörler BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spreyi LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) farelerJackson Laboratuvarı18549
C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı664
CD45 Monoklonal Antikor (30-F11)İnvitrojen14-0451-82
CD68 AntikorAbcamab125212
Curity gazlı bez süngerler Covidien
Eşek Anti-Keçi IgG H & L (HRP) Abcamab6885
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (HRP) Abcamab97064
Eşek Anti-Sıçan IgG H & L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Silikon Kapsülleyici Şeffaf ElektronMikroskobu Bilimleri24236-10İki parçalı, 10:1 karışım oranı
Yuvarlak Kapaklı Cam, 8mm Çap, # 1.5 Kalınlık Elektron Mikroskobu Bilimleri72296-08
Ender-3 Pro 3D yazıcıShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Uzak Kızılötesi Isıtmalı battaniyeKent ScientificRT-0520
Fc Reseptör EngelleyiciInnovex BiosciencesNB309
Fiji görüntüleme işleme paketihttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres karboksilat, 0.04 ve mikro; m, sarı-yeşil (505/515)InvitrogenF8795
Geçit sistemi:BIOPAC Systems Inc.Bileşenler birlikte, görüntüleme sırasında fare hayati değerlerinin izlenmesine ve fare solunumunda geçit görüntüsü elde edilmesine olanak tanır. Hepsi BIOPAC sistemlerinden satın alındı.
Acqknowledge software ACK100W, ACK100M
Diferansiyel Amp. Modülü, C Serisi DA100C
Dual Gating Sys küçük hayvanDTU200 
Windows için MP160 - Analiz sistemiMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
Basınç Pedi TSD110 
Jel köpükPfizer9031508Emilebilir jelatin sünger
Sertleştirilmiş ince makasGüzel Bilim Araçları14090-11İki çift; paslanmaz çelik, keskin-keskin
uçlar, düz uç, 26 mm
kesici kenar, 11 cm uzunluk
İnsan/Fare Miyeloperoksidaz/MPO AntikorR& D SystemsAF3667
Sıcak boncuk sterilizatörüGüzel Bilim Araçları18000-45Kullanmadan yaklaşık 30 dakika < / > açın; aletleri >200
& derecede sterilize edin; 30 s için C
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Daldırma ortamı Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
BD Ultra-İnce İğneli İnsülin Şırıngaları 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
İzofluran (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Domates) Lektin (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFP farelerwww.mmrrc.org012039-MU
Mikro diseksiyon forsepsRobozRS-5135Tırtıklı, hafif eğri, 0,8 mm uç genişliği; 4" uzunluk
Mikro diseksiyon forsepsRobozRS-51531 x 2 diş, hafif eğri, 0,8 mm uç
genişlik, 4" uzunluk
MTS MiniBionix II 808MTS SistemleriServohidrolik malzeme test cihazı
Nötrofil Elastase 680 HIZLI probPerkinElmerNEV11169
AzotGenel Kaynak Tedarik A.Ş.
OksijenGenel Kaynak Tedarik A.Ş.
Polilaktik asit filamentHatchbox1.75 mm çap
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube oftalmik merhemDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 yara klipsiRoboz SurgicalRS-9255
Paslanmaz çelik ızgaraFotofabBir ızgara 0.200 inç çapındadır ve 52 x 0.016 inç olan toplam 0.016 ayrı ızgara karesi vardır. Her kare arasında 0.003 inç boşluk vardır.  
Yüzey İşlem Görmüş Steril Doku Kültürü PlakalarıFisher ScientificFB012929Kapak, görüntüleme pencereleri için kürleme yüzeyi olarak kullanılır
, TriM Scope Multifoton Mikroskobu LaVision BioTecGörüntüleme, iki Ti:Sapphire lazer (Mai Tai ve InSight, Spectra-Physics) ve bir optik parametrik osilatör ile donatılmış dik bir 2 foton mikroskobu (Trimscope, LaVision BioTec) üzerinde yapıldı. Sinyali dört fotoçoklayıcı tüpe yönlendirmek için aşağıdaki Uzun Geçiren Dikroik Işın Ayırıcılar (Chroma) kullanıldı:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR mikro kapak camıVWR48404-453
326895

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ntravital MikroskopiSilikon G r nt leme PenceresiBoylamsal G r nt lemePolidimetilsiloksan PencereMeme Bezi G r nt lemeKar n Organ G r nt lememm n H cre TakibiKanser H cresi G r nt lemeCerrahi Pencere Yerle tirmeDoku G rselle tirme

İlgili makaleler