Method Article

Ham Biyolojik Numunelerde Topoizomeraz 1 Aktivitesinin Basit ve Hızlı Yuvarlanan Daire Amplifikasyonuna Dayalı Tespiti

DOI:

10.3791/64484

⸱

December 2nd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 2Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 3VPCIR Biosciences ApS, 4Department of Pathology, Aarhus University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yuvarlanma çemberi geliştirilmiş enzim aktivitesi tespit testi kullanılarak topoizomeraz 1 aktivitesinin hassas ve kantitatif tespiti için bir protokol tanımlanmıştır. Yöntem, saflaştırılmış bileşenlerden veya hücre / doku ekstraktlarından topoizomeraz 1 aktivitesinin tespit edilmesini sağlar. Bu protokol, enzimatik aktivitenin tespitini içeren herhangi bir alanda geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yuvarlanma çemberi amplifikasyonu gibi izotermal amplifikasyon tabanlı teknikler, nükleik asitlerin, protein miktarlarının veya diğer ilgili moleküllerin tespiti için başarıyla kullanılmıştır. Bu yöntemlerin klinik ve araştırma uygulamaları için PCR veya ELISA'ya önemli alternatifler olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, protein miktarının tespiti (Western blot veya immünohistokimya ile) kanser teşhisi için bilgi sağlamak için genellikle yetersizdir, oysa enzim aktivitesinin ölçümü değerli bir biyobelirteci temsil eder. Enzim aktivitesinin ölçülmesi ayrıca patojen kaynaklı hastalıkların tanı ve potansiyel tedavisine de olanak sağlar. Tüm ökaryotlarda, topoizomerazlar, önemli hücresel süreçler sırasında DNA topolojik durumunun kontrolünde rol oynayan anahtar DNA bağlayıcı enzimlerdir ve kanser prognozu ve tedavisi için önemli biyobelirteçler arasındadır.

Yıllar geçtikçe, topoizomerazlar, her yıl araştırılan doğal ve sentetik küçük moleküllü bileşiklerin kütüphaneleri ile antiparaziter ve antikanser ilaçların potansiyel bir hedefi olarak büyük ölçüde araştırılmıştır. Burada, topoizomeraz 1 (TOP1) aktivitesinin basit, hızlı ve jelsiz bir şekilde kantitatif ölçümüne izin veren yuvarlanma çemberi geliştirilmiş enzim aktivitesi tespiti (REEAD) testi olarak adlandırılan yuvarlanma çemberi amplifikasyon yöntemi sunulmaktadır. Özel olarak tasarlanmış bir DNA substratını parçalayarak ve bağlayarak, TOP1 bir DNA oligonükleotidi kapalı bir daireye dönüştürür, bu da yuvarlanma çemberi amplifikasyonu için şablon haline gelir ve ~ 103 tandem tekrar yuvarlanan daire ürünleri verir. Amplifikasyon sırasında nükleotid birleşmesine bağlı olarak, floresandan kemilüminesansa ve kolorimetriğe kadar farklı okuma yöntemleri olasılığı vardır. Her TOP1 aracılı bölünme ligasyonu bir kapalı DNA çemberi oluşturduğundan, tahlil oldukça hassas ve doğrudan nicelikseldir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Topoizomerazlar DNA modifiye edici enzimler sınıfına aittir ve bunların çoğunun insan hastalıkları için biyobelirteçler olarak yararlı olduğu kanıtlanmıştır 1,2,3,4,5,6. TOP1, DNA replikasyonu, gen transkripsiyonu, rekombinasyon ve kromozomal ayrışma7 gibi hücresel süreçlerle ilişkili topolojik stresin çözülmesinde rol oynar. TOP1, DNA 8,9'da geçici tek sarmallı bir kırılmanın oluşumunu içeren bir mekanizma ile hem negatif hem de pozitif süperbobinleri çözebilir. DNA'ya bağlandıktan sonra, TOP1, fosfodiester omurgasına nükleofilik bir saldırı gerçekleştirmek için aktif bölge tirozinini (Tyr723) konumlandırır. Daha sonra kırık DNA ipliğinin 3'-ucuna kovalent olarak bağlanmış enzim ile bir TOP1-DNA bölünme kompleksi üretilir. Bu, yarık ipliğin 5' ucunun sağlam ipliğin etrafında dönmesine izin vererek burulma stresini serbest bırakır. Son olarak, 5'-ucun hidroksil grubu, 3'-fosfotirosil bağı üzerinde nükleofilik bir saldırı gerçekleştirir. Sonuç olarak, TOP1 serbest bırakılır ve DNA omurgası8 olarak restore edilir.

TOP1 katalitik döngüsünün adımlarını araştırmak için, gevşeme testi 10, elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) 11,12, DNA intihar bölünme-ligasyon testleri 13,14 ve enzimlerin in vivo kompleksi (ICE) testi 15 dahil olmak üzere çeşitli testler geliştirilmiştir. . Bununla birlikte, bu tahlillerin, DNA hesaplama ajanları gerektiren jel elektroforezine bağımlı oldukları veya son derece uzmanlaşmış eğitim ve ekipman gerektirdikleri için çeşitli sınırlamaları vardır. Dahası, tahliller büyük miktarlarda saflaştırılmış TOP1 enzimi (gevşeme testi için 1 ila 5 ng ve EMSA ve bölünme ligasyonu testi için 50 ila 200 ng arasında değişir) veya en iyi şekilde performans göstermek için en az 106 hücreden ekstraktlar gerektirir. Bu nedenle, ham biyolojik numunelerde ve REEAD testi adı verilen tek katalitik olay seviyesinde TOP1 aktivitesinin spesifik olarak tespit edilmesini sağlayan oldukça hassas bir yöntem geliştirilmiştir16.

Burada, REEAD testi16 kullanılarak TOP1 aktivitesinin tespiti için bir protokol sunulmaktadır. Tahlilin şematik bir temsili Şekil 1'de gösterilmiştir. Özel olarak tasarlanmış bir silikon ızgara, aşağıda kuyu oluşturucu olarak adlandırılan cam slaytlı çok kuyulu bir kurulum oluşturmak için işlevselleştirilmiş bir slaydın tutturulmuştur (Şekil 1A). Bunu, 5'-amino modifiye edilmiş bir astarın slaytın kuyularındaki fonksiyonel NHS gruplarına bağlanması izler (Şekil 1B). TOP1 aracılı bölünme ve ligasyon reaksiyonu, spesifik bir DNA substratını kapalı bir daireye dönüştürür. TOP1'e özgü substrat (Şekil 1C) kendiliğinden çift sarmallı bir gövde ve iki tek sarmallı halka içeren bir dambıl şekline katlanır. Döngülerden biri, yüzeye tutturulmuş astarı tamamlayıcı niteliktedir. Kök bölgesi, 3' ucundan yukarı doğru üç baz ve 5'-hidroksil çıkıntısı için tercih edilen bir TOP1 bölünme bölgesi içerir. Substratın daireselleştirilmesi, hücre / doku ekstraktı (Şekil 1C) veya rekombinant, saflaştırılmış TOP1 (Şekil 1D) kullanılarak elde edilebilir.

Substrat TOP1 tarafından bölündüğünde, enzim geçici olarak 3'-uca bağlanır ve üç bazlı fragman yayılır, bu da 5'-çıkıntının substrata tavlanmasına izin verir ve TOP1 aracılı ligasyonu kolaylaştırır. Ligasyon, substratın daireselleşmesine ve daha sonra TOP1'in ayrışmasına neden olur. Kapalı daire, yüzeye tutturulmuş astara (Şekil 1E) hibridize edilir ve iplik yer değiştirmeli RCA'yı gerçekleştirebilen ve 103 tandem tekrar ürünü veren phi29 polimeraz aracılık eden izotermal yuvarlanma çemberi amplifikasyonu (RCA) için bir şablon olarak kullanılır. RCA adımı sırasında, floresan olarak etiketlenmiş (Şekil 1F) veya biyotin-kuplajlı (Şekil 1G) nükleotidlerdahil edilebilir 17. Floresan etiketli nükleotidlerin dahil edilmesi, RCP'lerin bir floresan mikroskobu veya bir floresan tarayıcı kullanılarak tespit edilmesini sağlar. Alternatif olarak, yaban turpu peroksidaz (HRP) ile eşleşmiş bir anti-biyotin antikoru (Şekil 1H), biyotinile nükleotitleri bağlayabilir, böylece gelişmiş kemilüminesans (ECL) kullanılarak veya 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinin (TMB) saptanabilir bir renge dönüştürülmesiyle haddelenmiş daire ürünlerinin (RCP'ler) tespit edilmesine izin verir. RCA, doğrusal bir reaksiyon kinetik izler ve REEAD testini doğrudan nicel hale getirir, çünkü bir RCP tek bir TOP1 aracılı bölünme ligasyon reaksiyonunu temsil eder. Burada, bu tahlilin TOP1 aktivitesini saflaştırılmış bir rekombinant enzim olarak tespit etmek veya ham numunelerden ekstrakte etmek ve bir anti-TOP1 ilaç tarama aracı olarak kullanılabileceği gösterilmiştir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Gerekli tampon bileşimlerinin, ekipmanların ve diğer malzemelerin bir listesini Malzeme Tablosunda bulabilirsiniz.

1. Hücre kültürü

  1. Tercih edilen hücreleri uygun ortamda kültürleyin ve talimatlara göre büyütün. Örnek olarak, %20 fetal sığır serumu (FBS), %1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100 ünite/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile desteklenmiş Minimal Esansiyel Ortam'da (MEM) kolorektal adenokarsinom kaynaklı hücreler olan Caco2'yi büyütün. Hücre kültürlerini nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun (37 ° C'de% 5 CO2/95% hava atmosferi). Hücreleri doku kültürü şişelerine yerleştirin ve hücreleri% 70 akıcılıkta tutmak için her 3 günde bir bölün.
  2. Tripsin tedavisi (% 0.25 tripsin,% 0.02 EDTA çözeltisi) ile% 70 konfluent şişeden hücreleri toplayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  3. Hücre konsantrasyonunu 0.5 × 106 hücre / tüpe ayarlamak için PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca 200 × g'da döndürün ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    NOT: REEAD için kullanılan hücreler taze kullanılmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır. Caco2 hücreleri ile elde edilen sonuçlar yakın zamanda yayınlanmıştır17. Tahlil, kolon, meme, akciğer ve rahim ağzı kanseri kaynaklı hücreler18,19,20,21,22,23 dahil olmak üzere çeşitli hücre hatları ile test edilmiştir, ancak dokular, kan ve tükürük gibi TOP1 içeren tüm ham biyolojik örneklerle kullanılabilir.

2. İşlevselleştirilmiş slaytların hazırlanması

  1. Özel olarak tasarlanmış silikon izolatör ızgarasını işlevselleştirilmiş slayda takın, böylece kuyu yapıcıyı yapın. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için silikona bastırın (bkz. Şekil 1A).
  2. 1x baskı tamponunda 5 μM 5'-amino astar karışımı hazırlayın. Her bir oyuğa karışımın 4 μL'sini ekleyin ve wellamker'ı ışıktan korunan 15 °C ile 25 °C arasındaki sıcaklıklarda doymuş NaCl ile bir hibridizasyon odasına koyun.
    NOT: Bir hibridizasyon odası, doymuş NaCl ile doldurulmuş bir pipet ucu kutusu kullanılarak kolayca yapılabilir. Hibridizasyon minimum 16 saat ve maksimum 72 saat sürer. Şekil 1B'deki 5'-amino primer dizisine bakınız. Slaytlar, amino modifiye oligonükleotidlerin bağlanmasına izin vermek için NHS grupları ile işlevselleştirilmiştir.

3. Kapalı dairesel yüzeylerin oluşturulması

  1. Rekombinant TOP1 veya hücre ekstresi ile kapalı dairesel substratların hazırlanması.
    1. 1.000 hücre / μL'lik bir hücre yoğunluğuna ulaşmak için 500 μL Lizis Tamponunda 0.5 × 106 hücreli bir hücre peletini lize edin.
    2. 2 μL 5 μM TOP1-spesifik substratın (substratın sırası aşağıdaki gibidir: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT TTT AAT AAA TCT TCT TTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') ve 16 μL'de 2 μL rekombinant TOP1 enzimi veya 2 μL hücre ekstraktının (bkz. adım 3.1.1) daire karışımını hazırlayın. 1x TOP1 Reaksiyon Arabelleği.
      NOT: Kullanılan rekombinant TOP1 konsantrasyonu, seçilen okuma yöntemine bağlıdır (bkz. Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5). Şekil 1C'deki TOP1'e özgü substratın sırasına bakın.
    3. 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin (bkz. Şekil 1C,D).
    4. 2 μL% 1 SDS ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  2. İlaçların varlığında kapalı dairesel substratların hazırlanması
    1. 14 μL 1x TOP1 Reaksiyon Tamponunda 2 μL 5 μM TOP1 spesifik substrat ve 1 μL %100 DMSO veya 1 μL 1.6 mM kamptotesin (CPT) içeren bir daire karışımı hazırlayın. 2 μL 5 ng/μL rekombinant TOP1 enzimi ekleyin.
      NOT: Diğer küçük moleküllü bileşikler veya ilaçlar kullanılabilir. Bu durumda, bileşiğin titrasyonunun yapılması gerekir. Bileşik DMSO dışında bir çözücü içinde çözülürse, bu DMSO yerine bir kontrol olarak kullanılmalıdır.
    2. 37 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. 2 μL% 1 SDS ekleyerek reaksiyonu durdurun.

NOT: Adım 3, adım 2'ye paralel olarak başlatılabilir ve daireler gece boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Alternatif olarak, DNA daireleri adım 4 ile aynı anda hazırlanabilir ve hemen kullanılabilir. Şekil 1C'deki TOP1'e özgü substratın sırasına bakın. Substrat, tercih edilen bir TOP1 bölünme bölgesi ve iki tek sarmallı döngü içeren çift gövdeli bir bölgeye sahip bir dambıl şekline katlanır. Açık dambıl substratı, TOP1 aracılı bölünme ve ligasyon ile kapalı dairesel bir substrata dönüştürülür ve bundan böyle daire olarak anılacaktır. 5'-amino primerin fazlalığı olduğu için, açık ve kapalı TOP1'e özgü substratlar arasında rekabet olmayacaktır.

4. Kuyucunun engellenmesi

  1. Kuyu yapıcıyı, 50 °C'ye kadar önceden ısıtılmış Tampon 1 ile doldurulmuş 5 cm x 5 cm'lik bir tepsiye daldırın. Bir pipet kullanarak, hava kabarcığı olmadığından emin olmak için sıvıyı kuyucukların içine itin. 50 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Arabellek 1'i çıkarın ve dH 2 O ile2x 1 dakika yıkayın.
  3. 50 °C'ye önceden ısıtılmış Buffer 2'yi ekleyin. Kuyularda hava kabarcığı olmadığından emin olun. 50 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. 2 x 1 dakika dH2O ile yıkayın. Elle kuvvetlice çalkalayın.
  5. 1 dakika boyunca% 70 EtOH ile yıkayın. Elle kuvvetlice sallayın.
  6. Kuyu yapımcısının hava kurumasına izin verin.
    NOT: Kuyuları kurutmak için basınçlı hava kullanın. Alternatif olarak, bir Pasteur pipeti kullanarak hava üflemek mümkündür. Devam etmeden önce kuyuların kuru olduğundan emin olun.

5. Dairelerin kuyu yapıcıya hibridizasyonu

  1. Karşılık gelen her kuyucuğa dairelerin 4 μL'sini (3. adımda yapılmış) ekleyin.
  2. Kuyucuğu 37 °C'de dH2O ile 1 saat boyunca bir nem odasına yerleştirin.
    NOT: dH2O ile doldurulmuş pipet uçları için bir kutu kullanılarak bir nem odası yapılabilir. alternatif olarak, hibridizasyon nem odasında gece boyunca 25 °C'de yapılabilir.

6. Yıkama

  1. Kuyu yapıcıyı Buffer 3 ile yıkayın.
  2. Arabellek 3'ü çıkarın ve Arabellek 4 ile değiştirin.
  3. Tampon 4'ü çıkarın ve% 70 EtOH ile yıkayın.
  4. EtOH'yi çıkarın ve kuyucunun kurumasını bekleyin.
    NOT: Tüm yıkama adımları, kızağın tamamen suya batırılması suretiyle 5 cm x 5 cm'lik bir tepside 1 dakika boyunca gerçekleştirilir. Her zaman kuyuların içinde hava kabarcığı olmadığından emin olun.

7. Yuvarlanan daire amplifikasyonu

  1. Floresan okuması için 0,2 μg/μL BSA, 1 birim Phi29 polimeraz ve 0,25 mM dNTP ve 0,0125 mM ATTO-488-dUTP veya kolorimetrik/kemilüminesans okuması için 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP ve 0,01 mM Biotin-dCTP ile desteklenmiş bir RCA karışımı hazırlayın. Her bir oyuğa 4 μL ekleyin. Bkz. Şekil 1E.
    NOT: RCA karışımının hazırlanması buz üzerinde yapılmalıdır. RCA'ya floresan nükleotidler eklerken, floroforları korumak için bu adımdan doğrudan ışıktan kaçının.
  2. Nem odasında 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Kullanılan floresan nükleotidler durumunda, nem odasını karanlıkta ayarlayın. Bkz. Şekil 1F,G.

8. Yıkama

  1. Kemilüminesans veya kolorimetrik okuma protokolleri için, kuyu yapıcıyı adım 6'daki gibi yıkayın ve ardından adım 11'e geçin.
  2. Floresan okuma protokolü için, aşağıdaki adımlarda olduğu gibi yıkamadan önce cımbız kullanarak silikon ızgarayı çıkarın.
    1. Slaytı Arabellek 3'te 10 dakika boyunca yıkayın.
    2. Arabellek 3'ü çıkarın ve Arabellek 4 ile değiştirin. 5 dakika yıkayın.
    3. Tampon 4'ü çıkarın ve% 70 EtOH'de 1 dakika yıkayın.
    4. EtOH'yi çıkarın ve kuyucunun kurumasını bekleyin.

9. Floresan yuvarlanan daire ürünlerinin floresan tarayıcı kullanılarak görselleştirilmesi

  1. Kullanılan florofora karşılık gelen filtreleri kullanarak bir floresan tarayıcıdaki slaytı tarayın. Doygunluk vermeyen mümkün olan maksimum fotoçarpanı kullanın.
    NOT: Bu protokolde görüntü elde etmek için kullanılan floresan tarayıcı, 473 nm lazer ve FAM filtre uyarma 490 nm, emisyon 520 nm ile donatılmıştır.
  2. Resmi ImageJ'ye içe aktarın ve görüntü türünü 8 bit olarak değiştirin (Resim | Türü | 8 bit). Bantları ayrı ayrı ölçmek için, araç çubuğundaki dikdörtgen çizim aracını kullanarak ölçülen alanı sınırlayın. İstediğiniz alanı çizin ve yoğunluğu ölçün (Analiz | Ölçün). Ardından, orijinal olarak çizilen alanı bir sonraki banda taşıyın ve ölçün.
  3. Verileri istediğiniz yazılımda çizin. ImageJ'den çıkarılan nicelik de dahil olmak üzere temsili görüntüler Şekil 2'de gösterilmiştir.

10. Floresan yuvarlanma çemberi ürünlerinin floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilmesi

  1. EtOH dirençli bir kalemle, silikon ızgarayı çıkarmadan önce kuyucukların konumunu çizin ve slaytı adım 8.2'deki gibi yıkayın. Yıkama adımlarından sonra, sürgüyü 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) olmadan 1 μL montaj ortamı ile monte edin ve bir kapak camı ekleyin. Kamerada görselleştirmeye izin vermek için, slaytı 76 mm x 26 mm mikroskop slaydına yapıştırın.
  2. 60x yağ daldırma hedefi ve kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak analiz edin. Her numunenin / kuyucuğun 12-15 görüntüsünü alın.
  3. Resimleri ImageJ'ye içe aktarın ve görüntüleri yığınlayın (Görüntü | Yığınlar | Yığınlanacak görüntü). Görüntü türünü 8 bit olarak değiştirme (Resim | Türü | 8 bit).
  4. Eşiği ayarlama (Resim | Ayarlama | Eşik).
    1. Eşiği aşağıdaki gibi ayarlayın: Alt çubuğu ayarlayın ve üst çubuğu yalnızca doğru sinyaller kırmızı, arka plan siyah olacak şekilde ayarlayın. Gerçek sinyaller kaybolmaya başlamadan önce eşiğin mümkün olduğunca düşük olduğundan emin olun.
    2. Tek tek görüntüleri süpürün ve eşiği ayarlamadan önce görüntülere karşılık geldiklerinden emin olun. Eşiğin denemeden denemeye değişebileceğini unutmayın.
  5. Sinyalleri sayın (Analiz | Parçacıkları analiz edin). ImageJ ayarlarındaki özetlenmiş alanın işaretli olduğundan emin olun.
    1. Daha fazla veri işleme için sonuçları bir elektronik tabloya veya başka bir yazılıma aktarın. ImageJ'den çıkarılan nicelik de dahil olmak üzere temsili görüntüler Şekil 3'te gösterilmiştir.

11. HRP konjuge antibiyotin antikorunun biyotin etiketli yuvarlanma çemberi ürünlerine bağlanması

  1. Her bir oyuğa %5 yağsız yağsız süt ve %5 BSA ile desteklenmiş Tampon 5'te 1:300 seyreltilmiş 4 μL HRP konjuge antibiyotin antikor ekleyin.
  2. Nem odasında 15-25 °C'de 50 dakika boyunca inkübe edin (bkz. Şekil 1H).
  3. Tampon 5 ile 3 x 3 dakika yıkayın.
  4. Kuyucuyu kurutun.

12. Biotin etiketli haddeleme çemberi ürünlerinin görselleştirilmesi

  1. ECL ile görselleştirme
    1. Kullanımdan hemen önce 40 μL ECL Luminol ve 40 μL H2O2karıştırın. Her bir oyuğa 2 μL ekleyin.
    2. Slaytı bir CCD kamera kullanarak veya X-ışını filmlerinde görselleştirin.
  2. TMB ile görselleştirme
    1. Adım 11.4'ten sonra, silikon ızgarayı çıkarın. Ardından, tüm slaytın üzerine 400 μL TMB ekleyin ve slaytı bir nem odasına koyun. Renk gelişimi için ~ 5-10 dakika bekleyin. Renk gelişiminden sonra, slaytı% 70 EtOH ile yıkayın.
    2. Renk gelişimini çıplak gözle görselleştirin. Fotoğraf makinesi veya cep telefonu ile slaytın fotoğrafını çekin.
  3. Resmi ImageJ'ye içe aktarın ve görüntü türünü 8 bit olarak değiştirin (Resim | Türü | 8 bit). Bantları ayrı ayrı ölçmek için, araç çubuğundaki dikdörtgen çizim aracını kullanarak ölçülen alanı sınırlayın. İstediğiniz alanı çizin ve yoğunluğu ölçün (Analiz | Ölçün). Ardından, orijinal olarak çizilen alanı bir sonraki banda taşıyın ve ölçün.
  4. Verileri istediğiniz yazılımda çizin. ImageJ'den çıkarılan niceleme de dahil olmak üzere temsili görüntüler Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6'da gösterilmiştir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, REEAD tahlili kullanılarak TOP1 aktivitesinin tespiti için bir protokol sunulmuştur16. Protokol, dört farklı okuma yöntemi kullanarak rekombinant TOP1 aktivitesini tespit etmek için kullanıldı: floresan tarayıcı, floresan mikroskop, kemilüminesans ve kolorimetrik. Protokol ayrıca, kaba ekstraktın bir örneği olarak, kemilüminesans veya TMB okuması ile Caco2 hücrelerinden ekstrakte edilen TOP1'in aktivitesini tespit etmek için de kullanılmıştır. Ayrıca, protokol, kemilüminesans okuma yöntemi kullanılarak, TOP1'e özgü bir inhibitörün bir örneği olarak, CPT tarafından rekombinant TOP1 aktivitesinin inhibisyonunu tespit etmek için bir ilaç tarama aracı olarak kullanılmıştır.

Floresan okumayı kullanarak TOP1 aktivitesini analiz ederken elde edilen sonuçlar Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmiştir. Floresan slaytın temsili bir taraması ve elde edilen niceleme Şekil 2'de gösterilmiştir. Nicelemeden de anlaşılacağı gibi, bu okumanın 12.5 ng TOP1'lik bir algılama sınırı vardır. Floresan mikroskop okuması kullanılırken elde edilen temsili görüntüler ve elde edilen nicelleştirme Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu okuma yöntemini kullanarak, algılama sınırı TOP1'in 0,1 ng kadar azdır. Kemilüminesans okumasını kullanarak TOP1 aktivitesini analiz ederken elde edilen sonuçlar Şekil 4'te, kolorimetrik okumadan elde edilen sonuçlar ise Şekil 5'te gösterilmiştir. Bu okuma yöntemlerinin tespit sınırı, 6 ng TOP1'de veya 312 Caco2 hücresinden ekstrakte edilen TOP1'dir. Şekil 6, ilaç tarama uygulamasına bir örnek olarak 80 μM CPT veya DMSO varlığında TOP1 aktivitesinin ölçümlerini göstermektedir. Temsili görüntü ve üç bağımsız deneyin ortaya çıkan nicelleştirilmesi, CPT'nin substratın TOP1 aracılı daireselleşmesini beklendiği gibi inhibe ettiğini göstermektedir24,25.

figure-results-1
Şekil 1: REEAD protokolünün şematik gösterimi. (A,B) İşlevselleştirilmiş slaytların hazırlanması. Silikon ızgara işlevselleştirilmiş slayda tutturulmuştur. Daha sonra, 5'-amino astar slayta bağlanır, böylece TOP1'e özgü substratın amplifikasyonu sağlanır. (C,D) Kapalı dairesel substratların oluşturulması. TOP1'e özgü substrat, çift sarmallı gövdede tercih edilen bir TOP1 bölünme bölgesi ve iki tek sarmallı döngüden birinde bir astar bağlama dizisi ile bir dambıl şekline katlanır. (C) TOP1, hücrelerin lizisi üzerine salınır. TOP1 aracılı bölünme ve ligasyon üzerine, substrat kapalı bir daireye dönüştürülür; (D) saflaştırılmış, rekombinant TOP1 kullanılır. (E) Yuvarlanan daire amplifikasyonu. Kapalı dairesel substratlar, yüzeye tutturulmuş astara hibridize edilir ve Phi29 polimeraz kullanılarak RCA ile güçlendirilir. RCA, F'deki gibi floresan nükleotidlerin veya G'deki gibi biyotinile nükleotidlerin dahil edilmesiyle elde edilebilir. Floresan yuvarlanma çemberi ürünleri, bir floresan mikroskobu veya bir floresan tarayıcı kullanılarak görselleştirilir. (H) HRP konjuge antibiyotin antikorunun bağlanması. Biyotinile yuvarlanma çemberi ürünleri, HRP konjuge antibiyotin antikoru ile inkübe edilir. Sinyal gelişimine HRP enzimi aracılık eder ve sinyaller ECL tarafından görselleştirilir ve bir CCD kamera kullanılarak veya kolorimetrik bir görselleştirme üreten TMB kullanılarak tespit edilir. Kısaltmalar: REEAD = yuvarlanma çemberi gelişmiş enzim aktivitesi tespiti; RCA = yuvarlanan daire amplifikasyonu; TOP1 = topoizomeraz 1; HRP = yaban turpu peroksidaz; ECL = gelişmiş kemilüminesans; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Floresan tarayıcı kullanılarak TOP1 aktivitesinin ölçümleri. Sol panel, floresan tarayıcı okuma protokolünü kullanarak 3-50 ng TOP1'in aktivitesini analiz ederken slaytın temsili bir görüntüsünü gösterir. Sağ panel, elde edilen niceliği gösterir. Welch'in düzeltmesi ile t-testi, p = 0.0064, n = 4. Kısaltma: TOP1 = topoizomeraz 1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Floresan mikroskobu kullanılarak TOP1 aktivitesinin ölçümleri. Sol panel, floresan mikroskobu okuma protokolünü kullanarak 0.1-12.5 ng TOP1'in aktivitesini analiz ederken slaytın temsili görüntülerini gösterir. Görüntülerin, noktaları düzgün bir şekilde göstermek için kırpılmış sürümler olduğunu unutmayın. Bu nedenle, sağ panelde gösterilen nicelemedeki sinyallerin sayısına benzemezler. Welch'in düzeltmesi ile t-testi, p = 0.0136, n = 3. Kısaltma: TOP1 = topoizomeraz 1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kemilüminesans okumasını kullanarak TOP1 aktivitesinin ölçümleri. (A) Sol panel, kemilüminesans okuma protokolünü kullanarak 3-50 ng TOP1'in aktivitesini analiz ederken slaytın temsili bir görüntüsünü gösterir. Sağ panel, elde edilen niceliği gösterir. Welch'in düzeltmesi ile t-testi, p < 0.0001, n = 4. (B) Sol panel, kemilüminesans okuma protokolünü kullanarak 156-40.000 Caco2 hücresinden ekstrakte edilen TOP1'in aktivitesini analiz ederken slaytın temsili bir görüntüsünü gösterir. Sağ panel, elde edilen niceliği gösterir. Welch'in düzeltmesi ile t-testi, p = 0.0224, n = 3. Kısaltmalar: TOP1 = topoizomeraz 1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Kolorimetrik okumayı kullanarak TOP1 aktivitesinin ölçümleri. (A) Sol panel, kolorimetrik okuma protokolünü kullanarak 3-50 ng TOP1'i analiz ederken slaytın temsili bir görüntüsünü gösterir. Sağ panel, elde edilen niceliği gösterir. Welch'in düzeltmesi ile t-testi, p = 0.0012, n = 4. (B) Sol panel, kolorimetrik okuma protokolünü kullanarak 156-40.000 Caco2 hücresinden çıkarılan TOP1'in aktivitesini analiz ederken slaytın temsili bir görüntüsünü gösterir. Sağ panel, elde edilen niceliği gösterir. Welch'in düzeltmesi ile t-testi, p = 0.0117, n = 3. Kısaltmalar: TOP1 = topoizomeraz 1; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Kemilüminesans okuma protokolleri kullanılarak ilaç tedavisinden sonra TOP1 aktivitesinin ölçülmesi. Sol panel, 1 dakika boyunca% 5 DMSO veya 80 μM CPT varlığında 10 ng TOP1'i analiz ederken slaytın temsili bir görüntüsünü gösterir. Sağ panel, elde edilen niceliği gösterir. Welch'in düzeltmesi ile t-testi, p = 0.0017, n = 3. Kısaltmalar: TOP1 = topoizomeraz 1; CPT = kamptothecin; DMSO = dimetilsülfoksit; Neg = negatif kontrol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Topoizomerazlar, antikanser tedavisinde veya bulaşıcı hastalıkların mücadelesinde potansiyel etkisi olan küçük moleküllü bileşiklerin hedefi olan, yüksek araştırma ve klinik ilgi çeken DNA modifiye edici enzimlerin bir sınıfını temsil eder. Ayrıca, insan TOP1'in aktivitesinin, kanser prognozu ve tedavisinin etkili bir biyobelirteci olduğu kanıtlanmıştır18,19,23. Bir kemoterapötik inhibitör26'nın etkinliğini etkileyen TOP1 aktivitesi olmasına rağmen, klinik ortamlarda değerlendirilen sıklıkla DNA-RNA miktarı veya TOP1 miktarıdır. Bunun nedeni, her laboratuvar ortamında topoizomeraz aktivitesinin doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayabilen hızlı, kolay ve jel bazlı ücretsiz araçların bulunmamasıdır.

Burada, TOP1 aktivitesinin jelsiz bir şekilde ölçülmesine izin veren REEAD testi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokolde, hücrelerden saflaştırılmış TOP1 veya ham ekstrakt, TOP1'in aracılık ettiği bölünme / ligasyon üzerine kapalı, dairesel bir moleküle dönüştürülen özel olarak tasarlanmış DNA dambıl şeklindeki bir substrat ile inkübe edilir. Daireler daha sonra bir cam yüzeye hibridize edilir ve RCA tarafından büyütülür. Slaytta meydana gelen reaksiyonların gerçekleştirilmesinde kullanım kolaylığı sağlamak için, cama silikon bir ızgara takılır ve reaksiyonların gerçekleştiği bireysel kuyucuklar yapılır. Bu şekilde, protokol çok kuyulu bir sistemden yararlanır - kuyu yapıcısı adı verilen silikon ızgara.

Protokol, örnek olarak kullanılan kolorektal adenokarsinom hücreleri Caco2'den ekstrakte edilen rekombinant TOP1 ve TOP1'in aktivitesini tespit etmek için kullanıldı. Ayrıca, bir ilaç tarama aracı olarak kullanılacak REEAD'ın bir örneği olarak, protokol, iyi bilinen TOP1 inhibitörü CPT24,25 tarafından TOP1 aktivite inhibisyonunu tespit etmek için kullanılmıştır. Tahlil, farklı okuma yöntemleriyle birleştirildi - yüksek hassasiyet sağlayan floresan mikroskobu ve daha az özel ekipman ve eğitim gerektiren bir floresan tarayıcı, kemilüminesans veya kolorimetrik. Son derece hassas floresan mikroskobu okuması, kaliteli bir floresan mikroskobu ayarına, yetenekli personele ve zaman alıcı görüntü toplama ve analizine duyulan ihtiyacın sınırlamalarına sahiptir.

Bu nedenlerden dolayı, hassasiyet pahasına bile olsa daha hızlı elde ve analiz sağlayan floresan tarayıcı okuması sunulmaktadır. Bir floresan tarayıcının olmaması durumunda, iki mükemmel alternatif, kemilüminesans ve kolorimetrik okuma yöntemleri düşünülebilir. Her iki yöntem de hızlı ve basittir, pahalı ekipman veya özel eğitim gerektirmez. Tüm okuma formatlarında, REEAD, daha zaman alıcı, jel bazlı (ara hesaplama ajanlarının gereklilikleri ile) ve daha az doğrudan nicel olan son teknoloji tahlillere kıyasla birçok avantaja sahiptir. Ancak, sunulan protokolde birkaç kritik adım vardır. İlaç taramasını ele alırken, zaman noktaları, ilaç konsantrasyonu ve TOP1 miktarı / DNA substratının oranı, CPT için optimize edilmiş tarif edilen ayarlara kıyasla optimize edilmelidir. İlaç, DNA substratı ile bir ön inkübasyon veya TOP1 enzimi ile bir preinkübasyon gerçekleştirilerek araştırılabilir. Bu, molekülün TOP1'i inhibe etme kabiliyeti hakkında değerli bilgiler verebilir ve ilacın etki mekanizması hakkında fikir verebilir.

Ayrıca, düşük veya eksik sinyaller yaşıyorsanız, bu büyük olasılıkla ham numunenin verimsiz bir şekilde lizisinden veya proteaz inhibitörlerinin yanlış kullanımı nedeniyle ekstrakttaki TOP1'in bozulmasından kaynaklanmaktadır. Ek olarak, bu aynı zamanda rekombinant TOP1, phi29 polimeraz, nükleotitler, substrat ve astar gibi önemli tahlil bileşenlerinin yetersiz depolanmasından da kaynaklanabilir. Son olarak, oligonükleotidlerin tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır, çünkü bu tahlil performansını önemli ölçüde etkiler. Ham ekstrakt kullanıldığında, spesifik biyolojik numunenin ekstraksiyon verimliliğinin optimize edilmesi gerekir ve TOP1'in miktarı ve aktivitesi burada bildirilen örnekten farklı olabilir. Bu nedenle, test edilecek her ham ekstrakt, söz konusu numuneyi kullanırken tahlil tespit sınırının ve hassasiyet aralığının belirlenmesi için bir titrasyon gerektirecektir. Protokol, insan TOP1'in tespiti için optimize edilmiştir. Diğer ökaryotik TOP1'lerin aktivitesi ölçülebilir, ancak NaCl konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin enzim saflaştırma yöntemine ve optimal enzim aktivitesine göre optimize edilmesi gerekebilir. Daha fazla daireselleştirilmiş substrat uzun süreli inkübasyondan kaynaklanırken, daha az dairesel substrat kısaltılmış inkübasyondan kaynaklanacaktır.

Sunulan uygulamalara ek olarak, REEAD, kanser hastalarından alınan küçük biyopsilerden elde edilen ham ekstraktlarda TOP1 aktivitesinin ölçülmesine18, kanser hücresi hatlarında CPT'nin sitotoksik antikanser etkisinin tahmin edilmesine 20,21,22 ve hatta tek hücrelerde enzim aktivitesinin tespitine izin verir20,21 . Ayrıca, kuyu yapıcıyı kullanarak sunulan REEAD ayarı, sentetik veya doğal bileşiklerin kütüphanelerinin çok kuyulu bazlı ilaç taramasını sağlar. Buna ek olarak, REEAD testinin REEAD C / L adı verilen değiştirilmiş bir versiyonu geliştirilmiştir. Bu kurulum, TOP1 reaksiyonu27'nin bölünme ve ligasyon adımlarının ayrı ayrı araştırılmasını sağlar. REEAD C/L ile küçük moleküllü inhibitörlerin etki mekanizmasını belirlemek ve bunları potansiyel antiparaziter etkileri olan TOP1 katalitik inhibitörleri28 veya antikanser tedavisinde kullanılacak TOP1 zehirleri24,25 olarak karakterize etmek mümkündür. Son olarak, DNA substratlarının diğer TOP1 enzimlerinin farklı gereksinimlerine (DNA bağlanması veya bölünme ligasyonu için) uyacak şekilde yeniden tasarlanmasıyla, REEAD ayrıca bulaşıcı hastalıkların (sıtma29'a neden olan Plasmodium falciparum durumunda olduğu gibi) veya Leishmania donovani ve Monkeypox virüsünün (veriler gösterilmemiştir) tespiti için de kullanılmıştır. Veya, antipatojenik etkileri olan küçük moleküllü bileşikleri tanımlamak için kullanılabilir. Sunulan protokol, TOP1 alanındaki bilim insanlarına enzim aktivitesini çok az optimizasyonla veya hiç optimizasyon yapmadan tespit etmek için kolay bir yöntem ve gelecekte daha geniş uygulamalara uyarlanma imkanı sunmaktadır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar C.T. ve K.M., VPCIR biosciences ApS'nin çalışanlarıdır. C.T., B.R.K. ve M.S. hissedarlar ve/veya hisse senedi sahipleridir. C.T., B.R.K. ve M.S., VVCR BIOSCIENCES ApS adına açılan EP2022/057172 patentinin mucitleri olarak adlandırıldıklarını beyan ederler. Diğer yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Phi29 ve TOP1 enzim saflaştırmaları ile ilgili teknik yardım için Aarhus Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü laboratuvar teknisyeni Noriko Y. Hansen'e teşekkür eder.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ekipman< / güçlü >
Floresan görüntü analizi
kamera CCD kameraKimyasal görüntü analizi için
Floresan mikroskobuOlympus60x yağa daldırma objektifi ve bir GFP filtresi (https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) ile donatılmıştır
Floresan tarayıcıTyphoonFLA 9500473 lazer ve FAM filtresi ile donatılmıştır
dH2O
ile nem odası Doymuş NaCl
ImageJ yazılımıFijiİndirmek için: https://imagej.net/software/fiji/downloads
Materials
Hücre kültürü
Seçilen hücre hattı için uygun hücre büyüme
TripsinSigma#T4174
Kalem strepSigma#P4300
Doku kültürü şişeleriThermoFisher#178983
FBSGibco#10270106
NEEASigma#M7145
PBSThermoFisher# 10010023
İşlevselleştirilmiş slaytlar< / em>
5'-amin anti-TOP1 astarSigma5'-/5AmMC6 / CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3'
Etkinleştirilmiş Codelink HD slaytlarSurModics#DHD1-0023
Silikon ızgaraGrace-biolabsÖzel yapım
Pertex yapıştırıcıHistolabs#00801
Mikroskop slaytı 76 x 26 mmHounisen#2510 1201BLAynı boyuttaki diğer mikroskop lamları kullanılabilir
DNA daireleri ve yuvarlanan daire amplifikasyonu
TOP1 spesifik substratSigma5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3'
ATTO-488-dUTPJena Biosciences#95387
Biotin-dCTPJena Biosciences#NU-809-BIO16L
dNTPThermoFisher#R0181
Phi29 polimerazVPCIR Biosciences#10010041
Rekombinant TOP1VPCIR Biosciences#10010001
Yuvarlanan dairenin tespiti Ürünler
BioFX TMBSurModics#ESPM-0100-01
Kapak camı
ECL karışımıCytiva#RPN2236
HRP konjuge anti-biyotin antikoruMerck#A4541
Montaj ortamı (vectachield)Vektörlaboratuvarları#H-1000
Tampon listesi< / güçlü >
1x PE Tampon1 mM EDTA, 8.12 mM Na < alt > 2 < / sub > HPO< sub > 4< / sub> ve orta nokta; 2H < alt > 2 < / alt >O, 1.88 mM NaH < alt > 2 < / alt >PO < alt > 4< / alt > ve orta nokta; H2O
6x Baskı Tamponu300 mM Na3PO4, pH 8.5
Bloke edici çözeltiTampon 5, %5 yağsız süt ve %5 BSA pH 9 ile desteklenmiştir
Lizis Tamponu10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + proteaz inhibitörleri
10x TOP1 Reaksiyon Tamponu50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5
10x Phi29 Reaksiyon Tamponu330 mM Tris-asetat pH 7.5, 100 mM Mg-asetat, 660 mM K-asetat, %1 Tween20, 200 mM DTT
Tamponu 150 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM etanolamin. Not: 50 ° C'de saklanır.
Tampon 24x SSC, %0.1 SDS. Not: 50 ° C'de saklanır.
Tampon 3100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, %0.3 SDS
Tampon 4100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, %0.05 Tween20
Tampon 520 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, %0.05 Tween20
Tamponlar için kimyasallar
TrisSigma#T1506
HClSigma# 1.00317.2011
EDTASigma# 1.08418.1000
PMSFSigma# 05056489001
SDSUygulaması# 436143
Na2< / sub>HPO4< / sub>Sigma# 1.06580.1000
NaH < sub>2 < / sub>PO4< / sub>Sigma# 1.06346.1000
EtanolaminSigma# 411000
SSCInvitrogen# 15557-036
Tris-asetatSigma#T1258
Mg-asetatSigma#M0631
K-asetatSigma# 1.04820.1000
Tween20Sigma# 8.22184.0500
DTTSigma#D0632
CaCl2Sigma#1.02382.1000
MgCl2Sigma#M2670
NaClSigma#1.06404.5000
Yağsız süt tozuSigma#70166
BSASigma#A4503
için ile hibridizasyon odası ortamı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).">Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
  2. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).">Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
  3. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).">Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
  4. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).">Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
  5. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).">Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
  6. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).">Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
  7. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).">Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
  8. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).">Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
  9. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).">Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
  10. Topoisomerase assays. Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3(2012).">Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M. Topoisomerase assays. Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3(2012).
  11. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).">Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
  12. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).">Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
  13. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).">Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
  14. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).">Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
  15. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).">Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
  16. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).">Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
  17. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).">Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
  18. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).">Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
  19. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).">Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
  20. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).">Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
  21. Enzymatic activity in single cells. Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).">Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R. Enzymatic activity in single cells. Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).
  22. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240(2020).">Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240(2020).
  23. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).">Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
  24. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).">Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
  25. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).">Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
  26. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398(2019).">Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398(2019).
  27. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255(2021).">Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255(2021).
  28. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).">García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
  29. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).">Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Rolling Circle AmplificationTopoisomerase 1 ActivityEnzyme Activity DetectionIsothermal AmplificationCrude Biological SamplesFluorescence MicroscopyChemiluminescence DetectionDrug Screening AssayDNA CircularizationImage J Analysis

Related Articles