Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme

2.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

5 Ocak 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, temel ve translasyonel araştırmalar için gelişmiş bir model sistemdir. Bu yöntem makalesi, farklı organoid fenotiplerin eşzamanlı kinetik değerlendirmesi için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntülemenin kullanımını detaylandırmaktadır.

Özet

Hasta kaynaklı organoid (PDO) kanser modelleri, kanser hücre dizilerine kıyasla insan hastalıklarını daha iyi özetleyen çok işlevli bir araştırma sistemidir. PDO modelleri, hücre dışı bazal membran ekstraktlarında (BME) hasta tümör hücrelerinin kültürlenmesi ve üç boyutlu kubbeler olarak kaplanmasıyla oluşturulabilir. Bununla birlikte, tek katmanlı kültürlerde fenotipik testler için optimize edilmiş ticari olarak temin edilebilen reaktifler genellikle BME ile uyumlu değildir. Burada, otomatik bir canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak PDO modellerini plakalamak ve ilaç etkilerini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Ek olarak, hücre sağlığını ve apoptozu aynı anda ölçmek için kinetik ölçümlerle uyumlu floresan boyalar uyguluyoruz. Görüntü yakalama, birkaç gün boyunca düzenli zaman aralıklarında gerçekleşecek şekilde özelleştirilebilir. Kullanıcılar, tek tek Z-düzlemi görüntülerinde veya birden fazla odak düzleminden seri görüntülerin Z Projeksiyonunda ilaç etkilerini analiz edebilir. Maskeleme kullanılarak, PDO sayısı, alan ve floresan yoğunluğu gibi ilgilenilen belirli parametreler hesaplanır. Sitotoksik ajanların hücre sağlığı, apoptoz ve canlılık üzerindeki etkisini gösteren kavram kanıtı verileri sağlıyoruz. Bu otomatik kinetik görüntüleme platformu, PDO kanser modellerindeki çeşitli terapötik etkileri anlamak için diğer fenotipik okumalara genişletilebilir.

Giriş

Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar), kanser gelişimini ve terapötik yanıtları incelemek için sağlam bir model sistem olarak hızla ortaya çıkmaktadır. PDO'lar, primer tümörün karmaşık genomik profilini ve mimarisini özetleyenüç boyutlu (3D) hücre kültürü sistemleridir 1,2. Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatlarının geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlerinden farklı olarak, PDO'lar intratümöral heterojenliği yakalar ve korur 3,4, bu da onları hem mekanik hem de translasyonel araştırmalar için değerli bir araç haline getirir. PDO'lar giderek daha popüler bir model sistem haline gelmesine rağmen, PDO kültürleriyle uyumlu hücresel etkiler için ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve analiz yöntemleri sınırlıdır.

Tedavi yanıtındaki ince değişiklikleri analiz etmek için sağlam yöntemlerin olmaması klinik çeviriyi engellemektedir. 3D kültürlerde altın standart hücre sağlığı reaktifi olan CellTiter-Glo 3D, hücre canlılığının belirleyicisi olarak ATP seviyelerini kullanır 5,6. Bu reaktif, uç nokta tahlilleri için yararlı olsa da, en önemlisi, tahlilin tamamlanmasından sonra numunelerin başka amaçlar için kullanılamaması olmak üzere birkaç uyarı vardır.

Canlı hücre görüntüleme, floresan reaktiflerle birleştirildiğinde, apoptoz 7,8,9 ve sitotoksisite10 dahil olmak üzere PDO modellerinde çeşitli hücre sağlığı okumalarını ölçme kapasitesine sahip sofistike bir kinetik mikroskopi şeklidir. Gerçekten de, canlı hücre görüntüleme, 2D platformlarda bileşiklerin yüksek verimli taramasının ayrılmaz bir parçası olmuştur11,12. Incucyte gibi sistemler, teknolojiyi uygun fiyatlı hale getirdi ve böylece çeşitli ortamlarda araştırma grupları için erişilebilir hale getirdi. Bununla birlikte, bu sistemlerin 3D kültürleri analiz etmek için uygulanması henüz emekleme aşamasındadır.

Burada, çoğullanmış canlı hücre görüntüleme kullanarak kanserin PDO modellerinde ilaç yanıtını değerlendirmek için bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 1). Parlak alan görüntülerinin analizi yoluyla, PDO boyutu ve morfolojisindeki değişiklikler kinetik olarak izlenebilir. Ayrıca, hücresel süreçler, apoptoz için Annexin V Kırmızı Boya ve sitotoksisite için Sitotoks Yeşil Boya gibi floresan reaktifler kullanılarak zaman içinde eşzamanlı olarak ölçülebilir. Sunulan yöntemler, Cytation 5 canlı hücre görüntüleme sistemi için optimize edilmiştir, ancak bu protokol farklı canlı hücre görüntüleme platformlarına uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan tümör örneklerini kullanan çalışmalar, Iowa Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), protokol #201809807 tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışmaya katılan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. Dahil edilme kriterleri, kanser teşhisini ve tümör örneklerinin mevcudiyetini içerir.

1. Sağlam PDO'ların 96 oyuklu bir plakada kaplanması

  1. Reaktifleri hazırlayın.
    1. 96 oyuklu plakaları gece boyunca 37 °C'de önceden ısıtın ve BME'yi gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
    2. İlgilenilen kanser türünü kültürlemek için optimize edilmiş tam organoid kültür ortamı hazırlayın. Burada gösterilen deneyler için kullanılan özel kültür ortamları Ek Tablo 1'de verilmiştir.
      NOT: Medya bileşenlerinin farklı tümör tipleri için değiştirilmesi gerekebilir. Örneğin, organoid kültür ortamı, jinekolojik tümörler için 100 nM estradiol ile desteklenir13. Hazırlanan besiyeri 4 °C'de 1 ay stabildir. Uzun süreli saklama için, ortamı 50 mL'lik tüplere ayırın ve -20 °C'de saklayın.
  2. 4 ° C ve 37 ° C'de iki ayrı organoid kültür ortamı alikotu hazırlayın. Örneğin, 96 oyuklu bir plakada 60 kuyucuk kaplanıyorsa, 6 mL sıcak organoid kültür ortamı ve 150 μL buz gibi soğuk organoid kültür ortamı kullanın.
  3. Organoid yıkama tamponu hazırlayın: 1x PBS'yi 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA ve 10 μM Y-27632 ile destekleyin. 4 °C'de saklayın
  4. 24 oyuklu bir plakada kültürlenmiş PDO'ları hasat edin. Aksi belirtilmedikçe tüm adımları buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirin.
    1. Bir vakum hattı sistemi kullanarak her kuyucuktan ortam aspire edin.
    2. 500 μL buz gibi organoid yıkama tamponu ekleyin ve 1000 μL'lik bir pipetleyici kullanarak 2-3x hafifçe pipetleyin. Plakayı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
    3. Her kuyucuğun içeriğini 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Tüm PDO'ların süspansiyon halinde olduğundan emin olmak için, her bir kuyuyu ek 300 μL organoid yıkama tamponu ile durulayın ve 50 mL konik tüpe aktarın. 4 °C'de 350 x g'de 5 dakika santrifüjleyin
    4. Tüpte ~ 5 mL kalacak şekilde bir vakum hattı sistemi kullanarak BME / organoid peletinden süpernatanı aspire edin. 20 mL organoid yıkama tamponu ekleyin ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak peleti nazikçe yeniden süspanse edin. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
    5. 4 °C'de 350 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir vakum hattı sistemi ile aspire edin, PDO peletini bozmamaya dikkat edin.
  5. PDO'ların 96 oyuklu bir plakada kaplanması: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
    1. Bir PDO süspansiyonu oluşturmak için PDO peletini uygun miktarda buz gibi organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin. PDO süspansiyonunu buz gibi soğuk 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Organoid kültür ortamının miktarını hesaplamak için, PDO'ların organoid kültür ortamı ve BME'nin 1:1 oranında 5 μL'lik bir kubbede kaplandığını dikkate alarak, 96 oyuklu bir plakada kaplanacak kuyucuk sayısını belirleyin. Örneğin, bir 96 oyuklu plakayı kaplarken ve sadece içteki 60 oyuğu kullanırken, gereken toplam PDO süspansiyonu miktarı 300 μL: 150 μL organoid kültür ortamı ve 150 μL BME olacaktır. BME'nin farklı yüzdelerinde optimal büyüme sergileyen modeller için, BME: ortam oranı bu adımda değiştirilebilir, ancak her bir spesifik model için tüm tahlillerde oranı standartlaştırmak önemlidir. Pipetleme hatasını hesaba katmak için her bileşene %10 hacim ekleyin.
    2. PDO'ların sayısını sayın.
      1. 2.5 μL PDO süspansiyonunu buz gibi soğuk 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.5 μL BME ile karıştırın. 5 μL'lik karışımı temiz bir cam mikroskop lamına aktarın. Slaytı örtmeyin. Karışım bir kubbe halinde katılaşacaktır.
      2. 4x'te parlak alan mikroskobu kullanarak görselleştirin. 5 μL karışımındaki PDO sayısını sayın; Amaç, 5 μL kubbe başına kabaca 25-50 PDO'ya sahip olmaktır.
        NOT: Test karışımında istenen yoğunluğa ulaşılamazsa, daha fazla organoid kültür ortamı ekleyerek veya PDO süspansiyonunu santrifüjleyerek ve PDO peletini daha düşük hacimde buz gibi organoid kültür ortamında yeniden süspanse ederek PDO süspansiyonunun nihai hacmini ayarlayın. Bu adımda PDO süspansiyonunun nasıl değiştirildiğine bakılmaksızın, adım 1.5.3'te BME: PDO süspansiyonunun nihai oranı. 1:1 olmalıdır.
    3. Geniş delikli uçlara sahip 200 μL'lik bir pipetleyici kullanarak, organoid kültür ortamının BME'ye 1:1 oranını elde etmek için PDO süspansiyonunu eşit miktarda BME ile dikkatlice karıştırın. Kubbelerin bütünlüğünü bozacak kabarcıklardan kaçının.
    4. 20 μL'lik bir pipetleyici kullanarak, önceden ısıtılmış 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına 5 μL'lik kubbeler ekin ve yalnızca içteki 60 oyuğu tohumlayın. PDO'ların eşit dağılımını sağlamak için, 1,5 mL'lik tüpün içeriğini geniş uçlu 200 μL'lik bir pipetleyici ile periyodik olarak pipetleyin.
    5. Tüm kuyular tohumlandıktan sonra, kapağı tabağa yerleştirin ve yavaşça ters çevirin. Kubbelerin katılaşmasını sağlamak için ters çevrilmiş plakayı doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Plakanın ters çevrilmesi, BME/organoid kültür ortamı kubbesinin, PDO oluşumu için yeterli alan sağlamak üzere 3D yapıyı korumasını sağlar.
    6. Plakayı kapağı yukarı bakacak şekilde çevirin ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.

2. Çoğullama için tedaviler ve floresan boyaların eklenmesi

  1. BME kubbeleri 96 oyuklu plakalarda katılaşırken, floresan canlı hücre görüntüleme reaktiflerinin dilüsyonlarını hazırlayın. Annexin V Kırmızı Boya ve Sitotoks Yeşil Boya'nın çoğullanması için spesifik parametreler burada verilmiştir.
  2. Floresan reaktif hazırlama (Gün -1): Her bir oyuğun 100 μL boya dozlu ortam ile işleneceğini varsayarak, tedavi edilecek kuyucuk sayısına göre uygun organoid kültür ortamı hacmini hesaplayın. Boyayı önceden ısıtılmış organoid kültür ortamında istenen konsantrasyona seyreltin.
    NOT: İhtiyaç duyulan toplam ortam miktarı denemeye bağlı olarak değişir. Pipetleme hatasını hesaba katmak için son hacme %10 ekleyin. Örneğin, 96 oyuklu bir plakanın iç 60 kuyusunu işlemek için 6.6 mL boya dozlu ortam hazırlayın (Tablo 1).
  3. Her birini 100 μL 2x boya dozlu organoid kültür ortamı ile iyice tedavi edin. Plakanın dış boş kuyucuklarına 200 μL steril 1x PBS ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Çevresel kuyulardaki PBS, ortamın iç kuyulardan buharlaşmasını azaltır.
  4. İlaçların/tedavi ajanlarının eklenmesi (Gün 0): İlaçları önceden ısıtılmış organoid kültür ortamında oyuk başına 100 μL'lik bir hacimde 2x konsantrasyonda hazırlayın.
    NOT: DMSO, yüksek konsantrasyonlarda hücreler için toksik olabilir. Bu çalışmada yapılan deneylerde %0.1 DMSO konsantrasyonu aşılmamıştır. İlaçlara ek olarak, bazı floresan reaktifler bir DMSO çözeltisi olarak dağıtılır. Bu tür reaktiflerle çalışırken toplam DMSO konsantrasyonunu hesaba katmak önemlidir.
  5. Her oyuğa 100 μL 2x boya dozlu ortam ekleyin; Baloncuk oluşturmaktan kaçının.

3. Görüntüleme parametrelerinin ayarlanması

  1. Plakayı Cytation 5'e yerleştirin. Açık Gen5 yazılımı. Imager Manual Mode (Görüntüleyici Manuel Modu) > New Task (Yeni Görev) seçeneğini tıklatın. Şimdi Yakala'yı seçin ve aşağıdaki ayarları girin: Objektif (istediğiniz büyütmeyi seçin); Filtre (mikroplakayı seçin); Mikroplaka formatı (kuyu sayısını seçin); ve Gemi tipi (plaka tipini seçin). Kapağı Kullan ve Daha yavaş taşıyıcı hızı kullan'a tıklayın. Tamam'a tıklayın.
    NOT: Kap Tipi: Yazılım, plastiğin her plaka tipi ve kalınlığı için objektiften plakanın dibine kadar olan belirli mesafeye kalibre edildiğinden, plaka hakkında bilgi seçerken mümkün olduğunca spesifik olun.
    Daha Yavaş Taşıyıcı Hızı: Plakaları yüklerken/boşaltırken kubbelerin bozulmasını önlemek için bu kutuyu seçin.
  2. Tüm BME kubbesini görüntüleyecek bir Z-Stack oluşturun.
    1. Görüntülemek için ilgilendiğiniz bir kuyuyu seçin (sol panel, histogramın altında).
    2. Parlak Alan kanalını seçin (sol panel, üst). Otomatik Pozlama'yı tıklatın ve Ayarları gerektiği gibi ayarlayın.
    3. Z-Stack'in alt ve üst kısmını ayarlayın: Görüntüleme Modu sekmesini genişletin (sol panel, orta). Z-Stack kutusunu işaretleyin. Kurs ayarlama oklarını (sol panel, orta) kullanarak, tüm PDO'lar odak içine girip çıkana ve bulanık olana kadar aşağı ayara tıklayın. Bunu Z-Stack'in alt kısmı olarak ayarlayın. Z-Stack'in üst kısmını ayarlamak için rota ayarlama oklarını kullanarak ters yönde tekrarlayın.
    4. Z-Stack ayarlarının ilgilenilen diğer kuyucuklar için uygun olduğundan emin olmak için başka bir kuyu seçin (sol panel, histogramın altında) ve Z-Stack'in üstünü ve altını görselleştirin.
    5. Odak konumlarını manuel olarak girmek için, ince ayarın yanındaki üç noktayı tıklayın (sol panel, üst). Bir pencere açılacaktır; en üstteki Z-Stack değerini yazın (sol panelde, ortada, Görüntüleme Modu altında bulunur). En alttaki Z-Stack değeri için bu işlemi tekrarlayın. Adım 3.2.3'ü tekrarlayarak istenen Z aralığını yakalamak için gerektiği gibi ayarlayın. Ayarlamalar gerekliyse, ayarları doğrulamak için başka bir kuyu seçin.
  3. Floresan kanal(lar)ı için pozlama ayarlarını yapın. Ayarlar iki floresan kanalı (GFP ve TRITC) için açıklanmıştır. Floresan kanallarının belirli sayısı, deneye ve canlı hücre görüntüleme sistemine hangi floresan küplerin yerleştirildiğine bağlı olacaktır.
    NOT: Deneyin sonunda sinyal yoğunluğunun önemli ölçüde daha yüksek olması bekleniyorsa, kullanıcılar, deneyin sonunda, daha sonra başlangıç parametrelerini ayarlarken uygulanabilecek optimum pozlama ayarlarını belirlemek için test deneyleri yapmayı düşünmelidir.
    1. Imaging Mode (Görüntüleme Modu) sekmesini genişletin (sol panel, orta) ve Görüntüleme Adımını Düzenle öğesini açın. Bir açılır pencere görünecektir.
    2. Kanallar altında, istediğiniz kanal sayısı için baloncuğa tıklayın. Parlak alan için bir kanal ve her floresan kanal için ek kanallar belirleyin. Bu örnekte, Kanal 1 = Parlak Alan; Kanal 2 = GFP; Kanal 3 = TRITC. Açılır Renk menülerini kullanarak her kanal için uygun ayarı seçin. Tamam'a tıklayarak düzenleme penceresini kapatın.
    3. Her floresan kanalını ayarlayın.
      1. Kanalı GFP'ye (sol panel, üst) geçirin.
      2. Otomatik pozlama'yı (sol panel, üst) tıklayın. Pozlama sekmesini (sol panel, orta) genişletin ve arka plan sinyalini en aza indirmek için pozlama ayarlarını yapın.
      3. 3.3.3.3-3.3.3.6 adımlarını izleyerek pozlama ayarlarını Görüntü Modu sekmesine kopyalayın.
      4. Edit Imaging Step (Görüntüleme Adımını Düzenle) kutusunun yanındaki Copy (Kopyala) simgesine tıklayın. Başka bir pencere açacak olan Görüntüleme Adımını Düzenle'ye tıklayın.
      5. GFP kanalı altında, Aydınlatma, Entegrasyon Süresi ve Kamera Kazancı ayarlarını kanala eklemek için Pozlama satırındaki Pano simgesine tıklayın.
      6. TRITC kanalı için 3.3.3.4-3.3.3.5 Adımlarını tekrarlayın. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
  4. Görüntü önişlemeyi otomatikleştirmek için görüntü önişleme ve Z-projeksiyon adımlarını ayarlayın.
    1. Kamera simgesine tıklayın (sol panel, alt köşe). Yeni bir pencere açılacaktır.
    2. İşleme Adımı Ekle (sol panel, alt) altında, Görüntü Ön İşleme'ye tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır.
    3. Parlak Alan sekmesinde, Görüntü Önişlemeyi Uygula seçeneğinin işaretini kaldırın.
    4. Her Floresan Kanal sekmesi için, Görüntü Önişlemeyi Uygula'nın seçili olduğundan emin olun. Kanal 1 ile aynı seçenekleri kullan seçeneğinin işaretini kaldırın ve Tamam'ı tıklatın. Pencere kapanacaktır.
    5. İşleme Adımı Ekle altında, Z Projection'a tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. İstenirse, dilim aralığını ayarlayın (örneğin, Z aralığını daraltmak için). Tamam'ı seçerek pencereyi kapatın.
  5. Protokol oluşturun.
    1. Araç çubuğunda Görüntü Kümesi'ni tıklatın. Açılır menüde, Bu görsel kümesinden deneme oluştur'u tıklayın. Imaging (Görüntüleme Penceresi) kapanacak ve Procedure (Prosedür) penceresi açılacaktır.
      NOT: Görüntüleyici Manuel Modunda seçilen parametreler otomatik olarak yeni pencereye yüklenecek ve bu sayede deneysel bir protokol oluşturulabilecektir.
    2. Sıcaklığı ve gradyanı ayarlama: İşlemler başlığının (solda) altındaki Sıcaklığı Ayarla'yı tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. İnkübatör Açık'ı seçin ve Sıcaklık altında istenen sıcaklığı manuel olarak girin. Ardından, Gradyan altında, manuel olarak 1 girin. Tamam'ı seçerek pencereyi kapatın.
      NOT: 1 °C'lik bir gradyan oluşturmak, plakanın kapağında yoğuşma oluşmasını önleyecektir.
    3. Görüntüye kuyular belirleyin.
      1. Açıklama altındaki Görüntü Adımı'na çift tıklayın. Tam Plaka'ya tıklayın (sağ köşe, üst). Bu, Plaka Düzeni penceresini açacaktır.
      2. İmleci kullanarak ilgilendiğiniz kuyuları vurgulayın. Tamam'a tıklayın. İsterseniz Otomatik Odaklama Gruplama ve Yakalama Gruplama kutularını işaretleyin. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
        NOT: Gruplama, yukarıdaki adım 3.3.3.2'de açıklandığı gibi pozlama ayarı gerektirecektir. Bu özelliğin kullanılabileceği belirli senaryolar için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
    4. Kinetik görüntüleme için aralıkları ayarlayın.
      1. Diğer başlığının altındaki Seçenekler'e tıklayın (solda). Süreksiz Kinetik Prosedür kutusunu işaretleyin.
      2. Tahmini Toplam Süre altında, denemenin çalışma süresini girin (ör. 5 gün). Tahmini Aralık altında, plakayı görüntülemek için aralığı girin (örneğin, her 6 saatte bir).
      3. Plakanın inkübatöre aktarılması için zaman tanımak için her çalıştırmadan sonra Duraklat'a tıklayın. Tamam'ı seçerek pencereyi kapatın.
    5. Veri azaltma adımlarını güncelleştirin.
      1. Yordam Penceresi'ni kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Veri azaltma adımlarını güncellemek için bir sekme açılacaktır. Evet'i seçin. Görüntü Ön İşleme'ye çift tıklayın. Ayarları doğrulamak için farklı kanallara tıklayın ve Tamam'a tıklayın.
      2. Z Projection'a çift tıklayın. Ayarları doğrulamak için farklı kanallara tıklayın. Tamam'a tıklayın. Ardından, Veri Azaltma Penceresini kapatmak için tekrar Tamam'a tıklayın.
    6. Plaka düzenini biçimlendirin.
      1. Plaka Yerleşim Sihirbazı'nı açın ve 3.6.2-3.6.3 adımlarını izleyerek kuyu tiplerini belirleyin.
      2. Plaka Düzeni Sihirbazı'nı açmak için araç çubuğundaki (sol köşe, üst) Plaka Düzeni simgesine tıklayın.
      3. Denemede kullanılan kuyu tiplerinin yanındaki kutuları işaretleyin. Tahlil Kontrolleri altında, okları kullanarak farklı kontrol türlerinin sayısını girin. Tahlil Kontrolü #1 penceresini açmak için İleri'ye tıklayın.
      4. 3.6.5-3.6.8 adımlarını izleyerek tahlil kontrol kuyusu koşullarını ayarlayın.
      5. Tahlil Kontrolü #1 penceresinde, Plaka Düzeni Kimliği kutusuna kontrol etiketini girin. İstenirse, yandaki kutuya tam adı girin. Okları kullanarak ilgili kontrol koşulu için çoğaltma sayısını seçin.
      6. Kontrol içinde birden fazla konsantrasyon veya bir seyreltme serisi kullanıyorsanız, Seyreltmeleri/konsantrasyonları tanımla'ya tıklayın ve Türü seçmek için açılır menüyü kullanın. Tablodaki her konsantrasyon/seyreltme için değerleri girin.
        NOT: Otomatik işlevi, konsantrasyonlar tutarlı bir artışla değişirse kullanılabilir.
      7. Araç çubuğundaki Renk sekmesini seçin. Açılır menüden kontrol için istediğiniz metin rengini ve arka plan rengini seçin. Sonrakine tıkla.
      8. Ek kontrollerle gerektiği kadar tekrarlayın.
      9. 3.6.10-3.6.12'ye göre numune kuyusu koşullarını ayarlayın.
      10. Örnek Kurulum sayfasında, örnek kimliği önekini (ör. SPL) girin. Okları kullanarak çoğaltma sayısını seçin. Farklı işlem konsantrasyonlarına sahip numuneler kullanıyorsanız, Tür açılır menüsünde Konsantrasyonlar veya Seyreltmeler'i seçin. Tabloya seyreltmeleri/konsantrasyonları girin ve Birim kutusuna birimleri girin.
      11. Araç çubuğunda Kimlik Alanları'nı seçin. Tabloya istediğiniz Kategori Ad(lar )ını (örn. numune kimliği, ilaç) girin.
      12. Araç çubuğunda Renk sekmesini seçin. Her tedavi grubu/numune için farklı bir renk seçin. Son'a tıklayın. Bu, Plaka Düzeni sayfasını açacaktır.
        NOT: Sol taraftaki sayılar, farklı numune numaralarıyla ilişkilidir.
      13. 3.6.14-3.6.16 adımlarını izleyerek Örnek Kimlikler atayın.
      14. Seçmek Sol panelden SPL1. Kuyuları seçmek için imleci kullanın.
        NOT: Otomatik seçme araçları seri atama kutusunda ayarlanabilir. Kopya sayısı ve mizanpajın yönü önceden belirlenebilir.
      15. Plaka düzenini tamamlamak için diğer örneklerle tekrarlayın. Memnun kaldığınızda, Tamam'ı tıklayın .
      16. Dosya araç çubuğunda Örnek Kimlikler'i seçin. Numune Kimliği sütunlarını her numune için uygun bilgilerle doldurun (ör. ilaç türü). Tamam'a basın.
    7. Protokolü kaydedin.
      1. Araç çubuğunda, Dosya > Protokolü Farklı Kaydet'i tıklatın. Dosyanın kaydedileceği konumu seçin. Bir dosya adı girin. Pencereyi kapatmak için Kaydet'e tıklayın.
      2. Araç çubuğunda Dosya > Çıkış'ı tıklayın. Değişiklikleri Görüntüleyici Manuel Moduna kaydetmek için bir sekme açılacaktır. Hayır'ı seçin.
      3. Deney 1'deki değişiklikleri kaydetmek için bir sekme açılır. Hayır'ı seçin. Protokol tanımını güncellemek için bir sekme açılacaktır. Güncelle'yi seçin. Yazılımı kapatın.
  6. Protokolü BioSpa OnDemand'a aktarın ve Deney kurulumunu tamamlayın.
    1. BioSpa OnDemand (çizelgeleme yazılımı) yazılımını açın.
    2. Yazılımda uygun bir yuva seçin.
    3. Plakayı canlı hücre görüntüleme sisteminden çıkarın. Zamanlama yazılımındaki uygun yuvaya erişmek ve plakayı yerleştirmek için Çekmeceyi Aç'a tıklayın. Çekmeceyi Kapat'ı tıklatın.
      NOT: Bu adım, yukarıdaki adım 3.5.7'de protokol oluşturulduktan sonra herhangi bir noktada gerçekleştirilebilir. Ancak, aşağıdaki Adım 3.6.4.3'te bir zamanlama çalıştırması gerçekleştirmek için plakanın Cytation 5'te olması gerekir.
    4. Protokolü içe aktarın.
      1. Yordam Bilgisi sekmesi altında, açılır menüden Kullanıcı'yı seçin. Protocol (Protokol) yuvasının yanındaki Select (Seç) > Add a new entry (Yeni giriş ekle) seçeneğini tıklayın.
      2. Protokol yuvasının yanında, Seç'e tıklayın. Bu, dosya mimarisinde istenen Protokole gitmek için yeni bir pencere açacaktır. Protokolü zamanlama yazılımına aktarmak için Aç'a tıklayın.
      3. Plakayı görüntülemek için gereken süreyi girin. Gen5 Protokol Listesi penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın.
        NOT: Bu adım, aynı anda birkaç deneme çalıştırırken özellikle önemlidir. Görüntü oluşturmak için gereken süreyi belirlemek için, Şimdi bir zamanlama çalıştırması gerçekleştir'i tıklatın. Tamam'a tıklayın.
    5. Görüntüleme aralıklarını ayarlayın ve deneyi planlayın.
      1. Aralık altında, adım 3.5.4'te belirtilen görüntüleme aralığını girin.
      2. Başlangıç Saati Seçenekleri'nin altında, Kullanılabilir Olduğunda'yı seçin. Süre'nin altında Sabit veya Sürekli'yi seçin.
        NOT: Protokolü bir sonraki uygun zamanda çalıştırmak yerine belirli bir başlangıç zamanı belirlenebilir. Sabit Süre'nin seçilmesi, deneme için belirli bir uç nokta ayarlar ve kullanıcının deneysel bir zaman çerçevesi belirlemesini gerektirir. Sürekli Süre , denemenin uç nokta olmadan çalışmasına olanak tanır ve yalnızca bir kullanıcı denemeyi durdurduğunda sonlandırılabilir.
      3. Schedule Plate/Vessel'e tıklayın. Bu, Plaka Doğrulama Sırasını açacaktır. Önerilen ilk okuma zamanını içeren bir sekme açılacaktır. Bu zamanlamayı kabul etmek için Evet'i tıklatın.

4. Gen5 yazılımında görüntü analizi (Şekil 2)

  1. Görüntü Analizi modülünü açın.
    1. Gen5'i açın. Görev Yöneticisi'nde Denemeler > Aç'ı seçin. Dosyayı açmak için denemeyi seçin. Araç çubuğunda Plaka > Görünüm'e tıklayın.
    2. Veri açılır menüsünü Z Projeksiyonu olarak değiştirin. İlgilendiğiniz bir kuyuya çift tıklayın. Yeni bir Görüntü Analizi veri azaltma adımı ayarlamak istediğim > Çözümle'yi seçin. Tamam'a tıklayın.
  2. Hücresel analiz
    1. Birincil maske
      1. Analiz Ayarları'nın altında Tür: Hücresel Analiz ve Algılama Kanalı: ZProj[Tsf[Parlak Alan]] (sol panel, orta) öğesini seçin.
      2. Seçenekler'e tıklayın. Bu, Birincil Maske ve Sayım sayfasını açacaktır. Threshold (Eşik) kutusunda, Auto (Otomatik) seçeneğini işaretleyin ve Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. Nesneleri belirlenen eşik içinde göstermek için Nesneleri Vurgula kutusunu (sağ panel, alt) tıklatın. İlgilenilen nesneleri dahil etmek için gerektiği gibi ayarlayın.
        NOT: Eşik ayarları piksel yoğunluğuna bağlıdır. Örneğin, eşik 5000 olarak ayarlanırsa, yoğunluğu 5000'den büyük olan pikseller analize dahil edilir.
      3. Nesne Seçimi altında, minimum ve maksimum nesne boyutunu (μm) belirleyin. Hücresel kalıntıları/tek hücreleri hariç tutmak için gerektiği gibi ayarlayın.
        NOT: PDO boyutu, farklı modeller ve türler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Her model için minimum ve maksimum PDO boyutu eşiklerini belirlemek için Gen5 yazılımındaki ölçüm aracını kullanın. Kullanıcılar, ilaç tedavisinden sonra daha sonraki zaman noktalarında PDO fragmanlarının hariç tutulmasını önlemek için ölçüm aracı tarafından sağlanan değere göre daha küçük bir minimum PDO boyutu eşiği seçebilir.
      4. Analizi kuyunun belirli bir bölgesiyle sınırlamak için, Tüm görüntüyü analiz et seçeneğinin işaretini kaldırın ve Tak'a tıklayın. Image Plug (Görüntü Fişi ) penceresinde, Plug shape ( Fiş şekli) öğesini seçmek için açılır menüyü kullanın. Boyut ve konum parametrelerini ilgilenilen bölgeye uyacak şekilde gerektiği gibi ayarlayın.
        NOT: Arka planı en aza indirmek için PDO içermeyen alanları hariç tutarken fiş içindeki PDO sayısını en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Çoğaltmalar arasında ilgilenilen nesnelerin çoğunu tutarlı bir şekilde yakalayacak bir fiş boyutu belirleyin. Kubbenin kenarlarını da dışlayan bir tapa oluşturmak, kubbenin kenarlardaki aşırı eğriliğinden ışığın kırılması nedeniyle çarpık görünebilecek nesneleri dışladığı için önemlidir. Fiş içindeki yalnızca tüm PDO'ları yakalamak için Birincil kenar nesnelerini dahil et seçimi de kaldırılabilir.
    2. Alt popülasyon analizi. Alt popülasyon tanımlamasına bir örnek Şekil 3'te verilmiştir.
      1. Hücresel Analiz araç çubuğunda Hesaplanan Metrikler'e tıklayın. İlgilendiğiniz nesne düzeyinde metrikleri seçin veya oluşturun (sağ köşe, alt) seçeneğine tıklayın. Kullanılabilir Nesne metrikleri altında, ilgilendiğiniz metrikleri (ör. döngüsellik) seçin ve Ekle düğmesine tıklayın. Tamam'a tıklayın.
        NOT: Her PDO modelinin morfolojisi ve yoğunluğu, alt popülasyonu ayırt etmek için ilgilenilen en iyi metrikleri belirleyecektir.
      2. Hücresel Analiz araç çubuğunda Alt Popülasyon Analizi'ne tıklayın. Yeni bir alt popülasyon oluşturmak için Ekle'yi tıklayın. Bir açılır pencere açılacaktır.
      3. İsterseniz, alt popülasyon için bir ad girin. Nesne Metrikleri altında, ilgilendiğiniz bir metrik seçin ve Koşul Ekle'ye basın. Edit Condition (Koşulu Düzenle ) penceresinde, seçilen Object Metric için parametreleri girin. Gerektiğinde ek ölçümlerle tekrarlayın.
        NOT: Parametreler manuel olarak ayarlanabilir veya bulucu aracı kullanılarak ayarlanabilir. Örneğin, enkazı hariç tutmak için kullanıcılar Alanı Nesne Metriği olarak ekleyebilir ve 800'den küçük nesneleri seçebilir. Nesne Metriği olarak dairesellik rutin olarak kullanılır ve modele bağlı olarak döngüselliği 0,2-0,5'ten büyük olan tüm nesneler dahil edilir.
      4. Pencerenin altındaki tabloda, görüntülemek istediğiniz sonuçları kontrol edin. Tamam'ı tıklatın > Uygula'yı tıklatın.
      5. Alt popülasyon içindeki nesneleri görüntülemek için, Nesne Ayrıntıları açılır menüsünü (sağ panel, orta) kullanarak alt popülasyonu seçin. Parametrelerin içine giren nesneler görüntüde vurgulanacaktır.
        NOT: Birincil maskenin ve alt popülasyonun vurgu renklerini değiştirmek için, Ayarlar'ı tıklatın (sağ panel, alt).
      6. Alt popülasyon parametrelerini ayarlamak için, Hücresel Analiz araç çubuğundan Alt Popülasyon Analizi penceresini yeniden açın. Alt popülasyonu seçin ve Düzenle'yi tıklayın. Adım Ekle'ye tıklayın.
        NOT: Bu, tüm zaman noktalarında deney içindeki tüm kuyucuklara aynı analizi uygulayacaktır. Matris sayfasındaki açılır menüde, bireysel görüntüleme için farklı metrikler seçilebilir.

5. Gen5'ten Excel'e veri aktarma

  1. Bir veri dosyasını dışarı aktarmak üzere özelleştirmek için, araç çubuğundaki Rapor/Dışa Aktarma Oluşturucuları simgesini seçin. Açılan pencerede, Excel'e yeni dışa aktarma'yı tıklatın.
  2. Açılır pencerenin Özellikler sayfasında, Kapsam > Plaka ve İçerik > Özel'i seçin. Araç çubuğundaki İçerik seçeneğine tıklayın. Excel programını açacak olan Şablonu Düzenle'ye tıklayın.
  3. E-tabloda, Tablo > Kuyu Verileri > Eklentiler'i seçin. Dışa aktarma seçeneklerini görmek için çeşitli seçimlerin üzerine gelin. İlgilendiğiniz metriği seçin (örneğin, Nesne Ortalaması[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    NOT: Plaka düzeni, Protokol Özeti > Düzen > Eklentiler seçilerek elektronik tablo analizi şablonuna eklenebilir.
  4. Bir Düzenle penceresi açılacaktır. Kuyular kutusunda, dışa aktarılacak kuyucukları Well-ID veya Kuyu # ile belirleyin. Tamam'ı seçin. E-tablo dosyasına bir şablon yüklenecektir. E-tabloyu kapatın. Şablon otomatik olarak kaydedilir.
  5. Yeni Excel'e aktar penceresinde Tamam'a tıklayın ve Rapor/Dışa Aktarma Oluşturucuları penceresini kapatın.
  6. Gen5 araç çubuğundaki Dışa Aktar simgesine tıklayın. İstediğiniz dışa aktarma dosyasının yanındaki kutuyu işaretleyin. Tamam'a tıklayın. 5. Nesil, elektronik tablo şablonunu otomatik olarak doldurur ve dosyayı Excel'de açar.

6. Dış veri analizi

  1. Dışa aktarma dosyasını (.xlsx) Excel'de açın.
  2. Her kuyucuk için, her bir değeri o kuyu için 0:00 zaman noktası değerine bölün. Bu, 0 zaman noktasını 1'e eşit olarak ayarlayacak ve bunun ötesindeki her değer ilk okumaya göre olacaktır.
  3. Veri analizi yazılımında yeni bir dosya açın. XY düzen seçeneğini seçin.
    NOT: Bu protokolde GraphPad Prism (sürüm 9.5.1) kullanılmıştır.
  4. Her veri grubu için giriş etiketleri. Her tedavi grubu için zaman noktalarını ve karşılık gelen normalleştirilmiş değerleri kopyalayıp Prizma tablosuna yapıştırın. Veriler için bir grafik otomatik olarak oluşturulur ve Grafikler altında bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Amacımız, PDO terapötik yanıtını değerlendirmek için çoğullanmış canlı hücre görüntüleme kullanmanın fizibilitesini göstermekti. Kavram kanıtı deneyleri, endometriyal kanserin iki ayrı PDO modelinde gerçekleştirildi: ONC-10817 ve ONC-10811 (ONC-10811 verileri için Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'ye bakınız). Apoptoz (annexin V boyama) ve sitotoksisite (Cytotox Green tutulumu), apoptozu indükleyen ajan staurosporine yanıt olarak kinetik olarak izlendi. Spesifik olarak, PDO'lar 96 oyuklu plakalar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PDO kültürleri, hücresel tepkileri ve davranışları yansıtma yetenekleri nedeniyle giderek daha popüler bir in vitro model sistemi haline gelmektedir2. PDO üretimi, kültürü ve genişletme tekniklerinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, ancak terapötik yanıtları analiz etme yöntemleri gecikmiştir. Ticari olarak temin edilebilen 3D canlılık kitleri, potansiyel olarak değerli kinetik yanıt verilerini kaçıran ve sonraki analizleri diğer yöntemlerle sınırlayanlitik uç nokta testl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

KWT, Immortagen Inc.'in ortak sahibidir. CJD, Agilent'in bir çalışanıdır. JSdB, Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo ve Vertex Pharmaceuticals'tan danışma kurullarında görev almış ve ücret almıştır; AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer ve Vertex'ten araştırma çalışmaları için fon veya başka destek almış olan ve DNA onarımı kusurlu kanserlerde abirateron, PARP inhibisyonu ile ticari ilgisi olan Kanser Araştırmaları Enstitüsü'nün (ICR) bir çalışanıdır. ve PI3K/AKT yolu inhibitörleri (kişisel gelir yok); Janssen tarafından sunulan ve abirateron asetatın kortikosteroidlerle kullanımını kapsayan 8 822 438 numaralı patent için hiçbir mali çıkarı olmayan bir mucit olarak adlandırıldı; endüstri destekli birçok klinik araştırmanın CI/PI'si olmuştur; ve Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (NIHR) Kıdemli Araştırmacısıdır. Başka hiçbir yazarın ifşa edilecek herhangi bir potansiyel çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Hasta tümör örnekleri sağladıkları için Iowa Üniversitesi'nden Doku Tedarik Çekirdeği ve Dr. Kristen Coleman'a ve PDO modeli oluşturmaya yardımcı olduğu için Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü'nden Dr. Sofia Gabrilovich'e minnettarız. Ayrıca makalenin eleştirel analizi için Dr. Valerie Salvatico'ya (Agilent, ABD) teşekkür ederiz. Aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul ediyoruz: KWT'ye CA220729P1 NIH/NCI CA263783 ve DOD CDMRP; İngiltere Kanser Araştırmaları, Prostat Kanseri İngiltere, Prostat Kanseri Vakfı ve JSdB Tıbbi Araştırma Konseyi. Fon sağlayıcıların deneylerin tasarımında veya analizinde veya yayınlama kararında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüDot Scientific Inc1008113
15 mL konik santrifüj tüpüSarstedt62.554.100
554 NM LED KüpAgilent1225012
96 oyuklu plakaCorning Costar359637 °C'ye önceden ısıtılmış; C
96 oyuklu plakaAgilent204626-10037 °C'ye önceden ısıtılmış; C
A83-01Tocris2939Nihai konsantrasyon 500 nM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Gelişmiş DMEM/F-12Gibco12634-010organoid kültür ortamının bileşeni
B27 TakviyesiGibco17504044Nihai konsantrasyon 1x'tir (organoid kültür ortamının bileşeni)
BioTek BioSpa 8 Otomatik İnkübatörAgilentBIOSPAG-SNMasa üstü kuluçka makinesi; BioSpa OnDemand programlama yazılımı, görüntüleme için BioSpa ve Cytation 5 arasında plakaları aktarmak için Gen5 ile iletişim kurar (bu protokol sürüm 1.01.10'u kullanır)
BioTek Cytation 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuAgilentCYT5PW-SNPlaka okuyucu; Bu cihaz için Gen5 yazılımı kullanılmaktadır (bu protokol 3.12.08 sürümünü kullanır)
Cultrex UltiMatrix Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran ÖzüR& D SistemleriBME001-10
Daunorubisin HClSigma-AldrichS3035
EDTA (0.5 M)Thermo FisherAM9260G
; M (organoid kültür ortamının bileşeni)
GlutamaxGibco35050-061Nihai konsantrasyon 1x'tir (organoid kültür ortamının bileşeni)
HEPESGibco15630-080Nihai konsantrasyon 10 mM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
İnsan EGF, Hayvansız Rekombinant ProteinGibcoAF-100-15-1MGNihai konsantrasyon 0,5 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
İnsan FGF-10 Rekombinant ProteinGibco100-26-1MGNihai konsantrasyon 10 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
İnsan R-Spondin 1 Rekombinant ProteinGibco120-38-5UGNihai konsantrasyon 250 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Hidrokortizon Stok ÇözeltisiKök Hücre Teknolojileri7926Nihai konsantrasyon 500 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Görüntüleme Filtresi Küpü- GFPAgilent1225101
Görüntüleme Filtresi Küpü- TRITCAgilent1225125
Görüntüleme LED'i GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Kırmızı BoyaSartorius4641Organoid kültür ortamında sulandırıldı
İnkosit Sitotoks Yeşil BoyaSartorius4633DMSO çözeltisi
N-Asetil-L-sisteinSigma-AldrichA7250Nihai konsantrasyon 1.25 mM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Boyama ÇözeltisiFisher-Scientific133661691:50 hacim
NikotinamidSigma-AldrichN0636Nihai konsantrasyon 10 mM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
NogginR& D Systems6057-NGNihai konsantrasyon 100 ng/mL (organoid kültür ortamının bileşeni)
Penisilin-StreptomisinGibco15140122Nihai konsantrasyon 10 birim/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Fosfat Tamponlu Salin (1x)Gibco14190-144
PrimosinInvivoGenant-pm-05Nihai konsantrasyon 100 &mikrodur; g/mL (organoid kültür ortamının bileşeni)
Rekombinant İnsan Heregulinβ-1Pepro Tech100-03Nihai konsantrasyon 37.5 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Streptomyces sp.'den staurosporin çözeltisi.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000Nihai konsantrasyon 5 ve mikrodur; M (organoid kültür ortamının bileşeni)
ve beta;-EstradiolSigma-AldrichE2758Nihai konsantrasyon 100 nM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
DMSO Dimetil sülfoksit Sigma-Aldrich D2438 Forskolin Tocris 1099'da Sulandırıldı Nihai konsantrasyon 10 &mikro ekleyin

Kaynaklar

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Hasta Kaynaklı Organoidlerİlaç Yanıt AnaliziMultiplex GörüntülemeOrganoid İlaç TaramaFloresan BoyalarKinetik GörüntülemeZ-Yığını GörüntülemeApoptoz NicemlemesiHücresel Fenotipleme
Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.