Yöntem makalesi

Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme

2.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

5 Ocak 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, temel ve translasyonel araştırmalar için gelişmiş bir model sistemdir. Bu yöntem makalesi, farklı organoid fenotiplerin eşzamanlı kinetik değerlendirmesi için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntülemenin kullanımını detaylandırmaktadır.

Özet

Hasta kaynaklı organoid (PDO) kanser modelleri, kanser hücre dizilerine kıyasla insan hastalıklarını daha iyi özetleyen çok işlevli bir araştırma sistemidir. PDO modelleri, hücre dışı bazal membran ekstraktlarında (BME) hasta tümör hücrelerinin kültürlenmesi ve üç boyutlu kubbeler olarak kaplanmasıyla oluşturulabilir. Bununla birlikte, tek katmanlı kültürlerde fenotipik testler için optimize edilmiş ticari olarak temin edilebilen reaktifler genellikle BME ile uyumlu değildir. Burada, otomatik bir canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak PDO modellerini plakalamak ve ilaç etkilerini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Ek olarak, hücre sağlığını ve apoptozu aynı anda ölçmek için kinetik ölçümlerle uyumlu floresan boyalar uyguluyoruz. Görüntü yakalama, birkaç gün boyunca düzenli zaman aralıklarında gerçekleşecek şekilde özelleştirilebilir. Kullanıcılar, tek tek Z-düzlemi görüntülerinde veya birden fazla odak düzleminden seri görüntülerin Z Projeksiyonunda ilaç etkilerini analiz edebilir. Maskeleme kullanılarak, PDO sayısı, alan ve floresan yoğunluğu gibi ilgilenilen belirli parametreler hesaplanır. Sitotoksik ajanların hücre sağlığı, apoptoz ve canlılık üzerindeki etkisini gösteren kavram kanıtı verileri sağlıyoruz. Bu otomatik kinetik görüntüleme platformu, PDO kanser modellerindeki çeşitli terapötik etkileri anlamak için diğer fenotipik okumalara genişletilebilir.

Giriş

Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar), kanser gelişimini ve terapötik yanıtları incelemek için sağlam bir model sistem olarak hızla ortaya çıkmaktadır. PDO'lar, primer tümörün karmaşık genomik profilini ve mimarisini özetleyenüç boyutlu (3D) hücre kültürü sistemleridir 1,2. Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatlarının geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlerinden farklı olarak, PDO'lar intratümöral heterojenliği yakalar ve korur 3,4, bu da onları hem mekanik hem de translasyonel araştırmalar için değerli bir araç haline getirir. PDO'lar giderek daha popüler bir model sistem haline gelmesine rağmen, PDO kültürleriyle uyumlu hücresel etkiler için ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve analiz yöntemleri sınırlıdır.

Tedavi yanıtındaki ince değişiklikleri analiz etmek için sağlam yöntemlerin olmaması klinik çeviriyi engellemektedir. 3D kültürlerde altın standart hücre sağlığı reaktifi olan CellTiter-Glo 3D, hücre canlılığının belirleyicisi olarak ATP seviyelerini kullanır 5,6. Bu reaktif, uç nokta tahlilleri için yararlı olsa da, en önemlisi, tahlilin tamamlanmasından sonra numunelerin başka amaçlar için kullanılamaması olmak üzere birkaç uyarı vardır.

Canlı hücre görüntüleme, floresan reaktiflerle birleştirildiğinde, apoptoz 7,8,9 ve sitotoksisite10 dahil olmak üzere PDO modellerinde çeşitli hücre sağlığı okumalarını ölçme kapasitesine sahip sofistike bir kinetik mikroskopi şeklidir. Gerçekten de, canlı hücre görüntüleme, 2D platformlarda bileşiklerin yüksek verimli taramasının ayrılmaz bir parçası olmuştur11,12. Incucyte gibi sistemler, teknolojiyi uygun fiyatlı hale getirdi ve böylece çeşitli ortamlarda araştırma grupları için erişilebilir hale getirdi. Bununla birlikte, bu sistemlerin 3D kültürleri analiz etmek için uygulanması henüz emekleme aşamasındadır.

Burada, çoğullanmış canlı hücre görüntüleme kullanarak kanserin PDO modellerinde ilaç yanıtını değerlendirmek için bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 1). Parlak alan görüntülerinin analizi yoluyla, PDO boyutu ve morfolojisindeki değişiklikler kinetik olarak izlenebilir. Ayrıca, hücresel süreçler, apoptoz için Annexin V Kırmızı Boya ve sitotoksisite için Sitotoks Yeşil Boya gibi floresan reaktifler kullanılarak zaman içinde eşzamanlı olarak ölçülebilir. Sunulan yöntemler, Cytation 5 canlı hücre görüntüleme sistemi için optimize edilmiştir, ancak bu protokol farklı canlı hücre görüntüleme platformlarına uyarlanabilir.

Protokol

İnsan tümör örneklerini kullanan çalışmalar, Iowa Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), protokol #201809807 tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışmaya katılan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. Dahil edilme kriterleri, kanser teşhisini ve tümör örneklerinin mevcudiyetini içerir.

1. Sağlam PDO'ların 96 oyuklu bir plakada kaplanması

  1. Reaktifleri hazırlayın.
    1. 96 oyuklu plakaları gece boyunca 37 °C'de önceden ısıtın ve BME'yi gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
    2. İlgilenilen kanser türünü kültürlemek için optimize edilmiş tam organoid kültür ortamı hazırlayın. Burada gösterilen deneyler için kullanılan özel kültür ortamları Ek Tablo 1'de verilmiştir.
      NOT: Medya bileşenlerinin farklı tümör tipleri için değiştirilmesi gerekebilir. Örneğin, organoid kültür ortamı, jinekolojik tümörler için 100 nM estradiol ile desteklenir13. Hazırlanan besiyeri 4 °C'de 1 ay stabildir. Uzun süreli saklama için, ortamı 50 mL'lik tüplere ayırın ve -20 °C'de saklayın.
  2. 4 ° C ve 37 ° C'de iki ayrı organoid kültür ortamı alikotu hazırlayın. Örneğin, 96 oyuklu bir plakada 60 kuyucuk kaplanıyorsa, 6 mL sıcak organoid kültür ortamı ve 150 μL buz gibi soğuk organoid kültür ortamı kullanın.
  3. Organoid yıkama tamponu hazırlayın: 1x PBS'yi 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA ve 10 μM Y-27632 ile destekleyin. 4 °C'de saklayın
  4. 24 oyuklu bir plakada kültürlenmiş PDO'ları hasat edin. Aksi belirtilmedikçe tüm adımları buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirin.
    1. Bir vakum hattı sistemi kullanarak her kuyucuktan ortam aspire edin.
    2. 500 μL buz gibi organoid yıkama tamponu ekleyin ve 1000 μL'lik bir pipetleyici kullanarak 2-3x hafifçe pipetleyin. Plakayı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
    3. Her kuyucuğun içeriğini 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Tüm PDO'ların süspansiyon halinde olduğundan emin olmak için, her bir kuyuyu ek 300 μL organoid yıkama tamponu ile durulayın ve 50 mL konik tüpe aktarın. 4 °C'de 350 x g'de 5 dakika santrifüjleyin
    4. Tüpte ~ 5 mL kalacak şekilde bir vakum hattı sistemi kullanarak BME / organoid peletinden süpernatanı aspire edin. 20 mL organoid yıkama tamponu ekleyin ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak peleti nazikçe yeniden süspanse edin. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
    5. 4 °C'de 350 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir vakum hattı sistemi ile aspire edin, PDO peletini bozmamaya dikkat edin.
  5. PDO'ların 96 oyuklu bir plakada kaplanması: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
    1. Bir PDO süspansiyonu oluşturmak için PDO peletini uygun miktarda buz gibi organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin. PDO süspansiyonunu buz gibi soğuk 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Organoid kültür ortamının miktarını hesaplamak için, PDO'ların organoid kültür ortamı ve BME'nin 1:1 oranında 5 μL'lik bir kubbede kaplandığını dikkate alarak, 96 oyuklu bir plakada kaplanacak kuyucuk sayısını belirleyin. Örneğin, bir 96 oyuklu plakayı kaplarken ve sadece içteki 60 oyuğu kullanırken, gereken toplam PDO süspansiyonu miktarı 300 μL: 150 μL organoid kültür ortamı ve 150 μL BME olacaktır. BME'nin farklı yüzdelerinde optimal büyüme sergileyen modeller için, BME: ortam oranı bu adımda değiştirilebilir, ancak her bir spesifik model için tüm tahlillerde oranı standartlaştırmak önemlidir. Pipetleme hatasını hesaba katmak için her bileşene %10 hacim ekleyin.
    2. PDO'ların sayısını sayın.
      1. 2.5 μL PDO süspansiyonunu buz gibi soğuk 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.5 μL BME ile karıştırın. 5 μL'lik karışımı temiz bir cam mikroskop lamına aktarın. Slaytı örtmeyin. Karışım bir kubbe halinde katılaşacaktır.
      2. 4x'te parlak alan mikroskobu kullanarak görselleştirin. 5 μL karışımındaki PDO sayısını sayın; Amaç, 5 μL kubbe başına kabaca 25-50 PDO'ya sahip olmaktır.
        NOT: Test karışımında istenen yoğunluğa ulaşılamazsa, daha fazla organoid kültür ortamı ekleyerek veya PDO süspansiyonunu santrifüjleyerek ve PDO peletini daha düşük hacimde buz gibi organoid kültür ortamında yeniden süspanse ederek PDO süspansiyonunun nihai hacmini ayarlayın. Bu adımda PDO süspansiyonunun nasıl değiştirildiğine bakılmaksızın, adım 1.5.3'te BME: PDO süspansiyonunun nihai oranı. 1:1 olmalıdır.
    3. Geniş delikli uçlara sahip 200 μL'lik bir pipetleyici kullanarak, organoid kültür ortamının BME'ye 1:1 oranını elde etmek için PDO süspansiyonunu eşit miktarda BME ile dikkatlice karıştırın. Kubbelerin bütünlüğünü bozacak kabarcıklardan kaçının.
    4. 20 μL'lik bir pipetleyici kullanarak, önceden ısıtılmış 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına 5 μL'lik kubbeler ekin ve yalnızca içteki 60 oyuğu tohumlayın. PDO'ların eşit dağılımını sağlamak için, 1,5 mL'lik tüpün içeriğini geniş uçlu 200 μL'lik bir pipetleyici ile periyodik olarak pipetleyin.
    5. Tüm kuyular tohumlandıktan sonra, kapağı tabağa yerleştirin ve yavaşça ters çevirin. Kubbelerin katılaşmasını sağlamak için ters çevrilmiş plakayı doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Plakanın ters çevrilmesi, BME/organoid kültür ortamı kubbesinin, PDO oluşumu için yeterli alan sağlamak üzere 3D yapıyı korumasını sağlar.
    6. Plakayı kapağı yukarı bakacak şekilde çevirin ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.

2. Çoğullama için tedaviler ve floresan boyaların eklenmesi

  1. BME kubbeleri 96 oyuklu plakalarda katılaşırken, floresan canlı hücre görüntüleme reaktiflerinin dilüsyonlarını hazırlayın. Annexin V Kırmızı Boya ve Sitotoks Yeşil Boya'nın çoğullanması için spesifik parametreler burada verilmiştir.
  2. Floresan reaktif hazırlama (Gün -1): Her bir oyuğun 100 μL boya dozlu ortam ile işleneceğini varsayarak, tedavi edilecek kuyucuk sayısına göre uygun organoid kültür ortamı hacmini hesaplayın. Boyayı önceden ısıtılmış organoid kültür ortamında istenen konsantrasyona seyreltin.
    NOT: İhtiyaç duyulan toplam ortam miktarı denemeye bağlı olarak değişir. Pipetleme hatasını hesaba katmak için son hacme %10 ekleyin. Örneğin, 96 oyuklu bir plakanın iç 60 kuyusunu işlemek için 6.6 mL boya dozlu ortam hazırlayın (Tablo 1).
  3. Her birini 100 μL 2x boya dozlu organoid kültür ortamı ile iyice tedavi edin. Plakanın dış boş kuyucuklarına 200 μL steril 1x PBS ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Çevresel kuyulardaki PBS, ortamın iç kuyulardan buharlaşmasını azaltır.
  4. İlaçların/tedavi ajanlarının eklenmesi (Gün 0): İlaçları önceden ısıtılmış organoid kültür ortamında oyuk başına 100 μL'lik bir hacimde 2x konsantrasyonda hazırlayın.
    NOT: DMSO, yüksek konsantrasyonlarda hücreler için toksik olabilir. Bu çalışmada yapılan deneylerde %0.1 DMSO konsantrasyonu aşılmamıştır. İlaçlara ek olarak, bazı floresan reaktifler bir DMSO çözeltisi olarak dağıtılır. Bu tür reaktiflerle çalışırken toplam DMSO konsantrasyonunu hesaba katmak önemlidir.
  5. Her oyuğa 100 μL 2x boya dozlu ortam ekleyin; Baloncuk oluşturmaktan kaçının.

3. Görüntüleme parametrelerinin ayarlanması

  1. Plakayı Cytation 5'e yerleştirin. Açık Gen5 yazılımı. Imager Manual Mode (Görüntüleyici Manuel Modu) > New Task (Yeni Görev) seçeneğini tıklatın. Şimdi Yakala'yı seçin ve aşağıdaki ayarları girin: Objektif (istediğiniz büyütmeyi seçin); Filtre (mikroplakayı seçin); Mikroplaka formatı (kuyu sayısını seçin); ve Gemi tipi (plaka tipini seçin). Kapağı Kullan ve Daha yavaş taşıyıcı hızı kullan'a tıklayın. Tamam'a tıklayın.
    NOT: Kap Tipi: Yazılım, plastiğin her plaka tipi ve kalınlığı için objektiften plakanın dibine kadar olan belirli mesafeye kalibre edildiğinden, plaka hakkında bilgi seçerken mümkün olduğunca spesifik olun.
    Daha Yavaş Taşıyıcı Hızı: Plakaları yüklerken/boşaltırken kubbelerin bozulmasını önlemek için bu kutuyu seçin.
  2. Tüm BME kubbesini görüntüleyecek bir Z-Stack oluşturun.
    1. Görüntülemek için ilgilendiğiniz bir kuyuyu seçin (sol panel, histogramın altında).
    2. Parlak Alan kanalını seçin (sol panel, üst). Otomatik Pozlama'yı tıklatın ve Ayarları gerektiği gibi ayarlayın.
    3. Z-Stack'in alt ve üst kısmını ayarlayın: Görüntüleme Modu sekmesini genişletin (sol panel, orta). Z-Stack kutusunu işaretleyin. Kurs ayarlama oklarını (sol panel, orta) kullanarak, tüm PDO'lar odak içine girip çıkana ve bulanık olana kadar aşağı ayara tıklayın. Bunu Z-Stack'in alt kısmı olarak ayarlayın. Z-Stack'in üst kısmını ayarlamak için rota ayarlama oklarını kullanarak ters yönde tekrarlayın.
    4. Z-Stack ayarlarının ilgilenilen diğer kuyucuklar için uygun olduğundan emin olmak için başka bir kuyu seçin (sol panel, histogramın altında) ve Z-Stack'in üstünü ve altını görselleştirin.
    5. Odak konumlarını manuel olarak girmek için, ince ayarın yanındaki üç noktayı tıklayın (sol panel, üst). Bir pencere açılacaktır; en üstteki Z-Stack değerini yazın (sol panelde, ortada, Görüntüleme Modu altında bulunur). En alttaki Z-Stack değeri için bu işlemi tekrarlayın. Adım 3.2.3'ü tekrarlayarak istenen Z aralığını yakalamak için gerektiği gibi ayarlayın. Ayarlamalar gerekliyse, ayarları doğrulamak için başka bir kuyu seçin.
  3. Floresan kanal(lar)ı için pozlama ayarlarını yapın. Ayarlar iki floresan kanalı (GFP ve TRITC) için açıklanmıştır. Floresan kanallarının belirli sayısı, deneye ve canlı hücre görüntüleme sistemine hangi floresan küplerin yerleştirildiğine bağlı olacaktır.
    NOT: Deneyin sonunda sinyal yoğunluğunun önemli ölçüde daha yüksek olması bekleniyorsa, kullanıcılar, deneyin sonunda, daha sonra başlangıç parametrelerini ayarlarken uygulanabilecek optimum pozlama ayarlarını belirlemek için test deneyleri yapmayı düşünmelidir.
    1. Imaging Mode (Görüntüleme Modu) sekmesini genişletin (sol panel, orta) ve Görüntüleme Adımını Düzenle öğesini açın. Bir açılır pencere görünecektir.
    2. Kanallar altında, istediğiniz kanal sayısı için baloncuğa tıklayın. Parlak alan için bir kanal ve her floresan kanal için ek kanallar belirleyin. Bu örnekte, Kanal 1 = Parlak Alan; Kanal 2 = GFP; Kanal 3 = TRITC. Açılır Renk menülerini kullanarak her kanal için uygun ayarı seçin. Tamam'a tıklayarak düzenleme penceresini kapatın.
    3. Her floresan kanalını ayarlayın.
      1. Kanalı GFP'ye (sol panel, üst) geçirin.
      2. Otomatik pozlama'yı (sol panel, üst) tıklayın. Pozlama sekmesini (sol panel, orta) genişletin ve arka plan sinyalini en aza indirmek için pozlama ayarlarını yapın.
      3. 3.3.3.3-3.3.3.6 adımlarını izleyerek pozlama ayarlarını Görüntü Modu sekmesine kopyalayın.
      4. Edit Imaging Step (Görüntüleme Adımını Düzenle) kutusunun yanındaki Copy (Kopyala) simgesine tıklayın. Başka bir pencere açacak olan Görüntüleme Adımını Düzenle'ye tıklayın.
      5. GFP kanalı altında, Aydınlatma, Entegrasyon Süresi ve Kamera Kazancı ayarlarını kanala eklemek için Pozlama satırındaki Pano simgesine tıklayın.
      6. TRITC kanalı için 3.3.3.4-3.3.3.5 Adımlarını tekrarlayın. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
  4. Görüntü önişlemeyi otomatikleştirmek için görüntü önişleme ve Z-projeksiyon adımlarını ayarlayın.
    1. Kamera simgesine tıklayın (sol panel, alt köşe). Yeni bir pencere açılacaktır.
    2. İşleme Adımı Ekle (sol panel, alt) altında, Görüntü Ön İşleme'ye tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır.
    3. Parlak Alan sekmesinde, Görüntü Önişlemeyi Uygula seçeneğinin işaretini kaldırın.
    4. Her Floresan Kanal sekmesi için, Görüntü Önişlemeyi Uygula'nın seçili olduğundan emin olun. Kanal 1 ile aynı seçenekleri kullan seçeneğinin işaretini kaldırın ve Tamam'ı tıklatın. Pencere kapanacaktır.
    5. İşleme Adımı Ekle altında, Z Projection'a tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. İstenirse, dilim aralığını ayarlayın (örneğin, Z aralığını daraltmak için). Tamam'ı seçerek pencereyi kapatın.
  5. Protokol oluşturun.
    1. Araç çubuğunda Görüntü Kümesi'ni tıklatın. Açılır menüde, Bu görsel kümesinden deneme oluştur'u tıklayın. Imaging (Görüntüleme Penceresi) kapanacak ve Procedure (Prosedür) penceresi açılacaktır.
      NOT: Görüntüleyici Manuel Modunda seçilen parametreler otomatik olarak yeni pencereye yüklenecek ve bu sayede deneysel bir protokol oluşturulabilecektir.
    2. Sıcaklığı ve gradyanı ayarlama: İşlemler başlığının (solda) altındaki Sıcaklığı Ayarla'yı tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. İnkübatör Açık'ı seçin ve Sıcaklık altında istenen sıcaklığı manuel olarak girin. Ardından, Gradyan altında, manuel olarak 1 girin. Tamam'ı seçerek pencereyi kapatın.
      NOT: 1 °C'lik bir gradyan oluşturmak, plakanın kapağında yoğuşma oluşmasını önleyecektir.
    3. Görüntüye kuyular belirleyin.
      1. Açıklama altındaki Görüntü Adımı'na çift tıklayın. Tam Plaka'ya tıklayın (sağ köşe, üst). Bu, Plaka Düzeni penceresini açacaktır.
      2. İmleci kullanarak ilgilendiğiniz kuyuları vurgulayın. Tamam'a tıklayın. İsterseniz Otomatik Odaklama Gruplama ve Yakalama Gruplama kutularını işaretleyin. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
        NOT: Gruplama, yukarıdaki adım 3.3.3.2'de açıklandığı gibi pozlama ayarı gerektirecektir. Bu özelliğin kullanılabileceği belirli senaryolar için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
    4. Kinetik görüntüleme için aralıkları ayarlayın.
      1. Diğer başlığının altındaki Seçenekler'e tıklayın (solda). Süreksiz Kinetik Prosedür kutusunu işaretleyin.
      2. Tahmini Toplam Süre altında, denemenin çalışma süresini girin (ör. 5 gün). Tahmini Aralık altında, plakayı görüntülemek için aralığı girin (örneğin, her 6 saatte bir).
      3. Plakanın inkübatöre aktarılması için zaman tanımak için her çalıştırmadan sonra Duraklat'a tıklayın. Tamam'ı seçerek pencereyi kapatın.
    5. Veri azaltma adımlarını güncelleştirin.
      1. Yordam Penceresi'ni kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Veri azaltma adımlarını güncellemek için bir sekme açılacaktır. Evet'i seçin. Görüntü Ön İşleme'ye çift tıklayın. Ayarları doğrulamak için farklı kanallara tıklayın ve Tamam'a tıklayın.
      2. Z Projection'a çift tıklayın. Ayarları doğrulamak için farklı kanallara tıklayın. Tamam'a tıklayın. Ardından, Veri Azaltma Penceresini kapatmak için tekrar Tamam'a tıklayın.
    6. Plaka düzenini biçimlendirin.
      1. Plaka Yerleşim Sihirbazı'nı açın ve 3.6.2-3.6.3 adımlarını izleyerek kuyu tiplerini belirleyin.
      2. Plaka Düzeni Sihirbazı'nı açmak için araç çubuğundaki (sol köşe, üst) Plaka Düzeni simgesine tıklayın.
      3. Denemede kullanılan kuyu tiplerinin yanındaki kutuları işaretleyin. Tahlil Kontrolleri altında, okları kullanarak farklı kontrol türlerinin sayısını girin. Tahlil Kontrolü #1 penceresini açmak için İleri'ye tıklayın.
      4. 3.6.5-3.6.8 adımlarını izleyerek tahlil kontrol kuyusu koşullarını ayarlayın.
      5. Tahlil Kontrolü #1 penceresinde, Plaka Düzeni Kimliği kutusuna kontrol etiketini girin. İstenirse, yandaki kutuya tam adı girin. Okları kullanarak ilgili kontrol koşulu için çoğaltma sayısını seçin.
      6. Kontrol içinde birden fazla konsantrasyon veya bir seyreltme serisi kullanıyorsanız, Seyreltmeleri/konsantrasyonları tanımla'ya tıklayın ve Türü seçmek için açılır menüyü kullanın. Tablodaki her konsantrasyon/seyreltme için değerleri girin.
        NOT: Otomatik işlevi, konsantrasyonlar tutarlı bir artışla değişirse kullanılabilir.
      7. Araç çubuğundaki Renk sekmesini seçin. Açılır menüden kontrol için istediğiniz metin rengini ve arka plan rengini seçin. Sonrakine tıkla.
      8. Ek kontrollerle gerektiği kadar tekrarlayın.
      9. 3.6.10-3.6.12'ye göre numune kuyusu koşullarını ayarlayın.
      10. Örnek Kurulum sayfasında, örnek kimliği önekini (ör. SPL) girin. Okları kullanarak çoğaltma sayısını seçin. Farklı işlem konsantrasyonlarına sahip numuneler kullanıyorsanız, Tür açılır menüsünde Konsantrasyonlar veya Seyreltmeler'i seçin. Tabloya seyreltmeleri/konsantrasyonları girin ve Birim kutusuna birimleri girin.
      11. Araç çubuğunda Kimlik Alanları'nı seçin. Tabloya istediğiniz Kategori Ad(lar )ını (örn. numune kimliği, ilaç) girin.
      12. Araç çubuğunda Renk sekmesini seçin. Her tedavi grubu/numune için farklı bir renk seçin. Son'a tıklayın. Bu, Plaka Düzeni sayfasını açacaktır.
        NOT: Sol taraftaki sayılar, farklı numune numaralarıyla ilişkilidir.
      13. 3.6.14-3.6.16 adımlarını izleyerek Örnek Kimlikler atayın.
      14. Seçmek Sol panelden SPL1. Kuyuları seçmek için imleci kullanın.
        NOT: Otomatik seçme araçları seri atama kutusunda ayarlanabilir. Kopya sayısı ve mizanpajın yönü önceden belirlenebilir.
      15. Plaka düzenini tamamlamak için diğer örneklerle tekrarlayın. Memnun kaldığınızda, Tamam'ı tıklayın .
      16. Dosya araç çubuğunda Örnek Kimlikler'i seçin. Numune Kimliği sütunlarını her numune için uygun bilgilerle doldurun (ör. ilaç türü). Tamam'a basın.
    7. Protokolü kaydedin.
      1. Araç çubuğunda, Dosya > Protokolü Farklı Kaydet'i tıklatın. Dosyanın kaydedileceği konumu seçin. Bir dosya adı girin. Pencereyi kapatmak için Kaydet'e tıklayın.
      2. Araç çubuğunda Dosya > Çıkış'ı tıklayın. Değişiklikleri Görüntüleyici Manuel Moduna kaydetmek için bir sekme açılacaktır. Hayır'ı seçin.
      3. Deney 1'deki değişiklikleri kaydetmek için bir sekme açılır. Hayır'ı seçin. Protokol tanımını güncellemek için bir sekme açılacaktır. Güncelle'yi seçin. Yazılımı kapatın.
  6. Protokolü BioSpa OnDemand'a aktarın ve Deney kurulumunu tamamlayın.
    1. BioSpa OnDemand (çizelgeleme yazılımı) yazılımını açın.
    2. Yazılımda uygun bir yuva seçin.
    3. Plakayı canlı hücre görüntüleme sisteminden çıkarın. Zamanlama yazılımındaki uygun yuvaya erişmek ve plakayı yerleştirmek için Çekmeceyi Aç'a tıklayın. Çekmeceyi Kapat'ı tıklatın.
      NOT: Bu adım, yukarıdaki adım 3.5.7'de protokol oluşturulduktan sonra herhangi bir noktada gerçekleştirilebilir. Ancak, aşağıdaki Adım 3.6.4.3'te bir zamanlama çalıştırması gerçekleştirmek için plakanın Cytation 5'te olması gerekir.
    4. Protokolü içe aktarın.
      1. Yordam Bilgisi sekmesi altında, açılır menüden Kullanıcı'yı seçin. Protocol (Protokol) yuvasının yanındaki Select (Seç) > Add a new entry (Yeni giriş ekle) seçeneğini tıklayın.
      2. Protokol yuvasının yanında, Seç'e tıklayın. Bu, dosya mimarisinde istenen Protokole gitmek için yeni bir pencere açacaktır. Protokolü zamanlama yazılımına aktarmak için Aç'a tıklayın.
      3. Plakayı görüntülemek için gereken süreyi girin. Gen5 Protokol Listesi penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın.
        NOT: Bu adım, aynı anda birkaç deneme çalıştırırken özellikle önemlidir. Görüntü oluşturmak için gereken süreyi belirlemek için, Şimdi bir zamanlama çalıştırması gerçekleştir'i tıklatın. Tamam'a tıklayın.
    5. Görüntüleme aralıklarını ayarlayın ve deneyi planlayın.
      1. Aralık altında, adım 3.5.4'te belirtilen görüntüleme aralığını girin.
      2. Başlangıç Saati Seçenekleri'nin altında, Kullanılabilir Olduğunda'yı seçin. Süre'nin altında Sabit veya Sürekli'yi seçin.
        NOT: Protokolü bir sonraki uygun zamanda çalıştırmak yerine belirli bir başlangıç zamanı belirlenebilir. Sabit Süre'nin seçilmesi, deneme için belirli bir uç nokta ayarlar ve kullanıcının deneysel bir zaman çerçevesi belirlemesini gerektirir. Sürekli Süre , denemenin uç nokta olmadan çalışmasına olanak tanır ve yalnızca bir kullanıcı denemeyi durdurduğunda sonlandırılabilir.
      3. Schedule Plate/Vessel'e tıklayın. Bu, Plaka Doğrulama Sırasını açacaktır. Önerilen ilk okuma zamanını içeren bir sekme açılacaktır. Bu zamanlamayı kabul etmek için Evet'i tıklatın.

4. Gen5 yazılımında görüntü analizi (Şekil 2)

  1. Görüntü Analizi modülünü açın.
    1. Gen5'i açın. Görev Yöneticisi'nde Denemeler > Aç'ı seçin. Dosyayı açmak için denemeyi seçin. Araç çubuğunda Plaka > Görünüm'e tıklayın.
    2. Veri açılır menüsünü Z Projeksiyonu olarak değiştirin. İlgilendiğiniz bir kuyuya çift tıklayın. Yeni bir Görüntü Analizi veri azaltma adımı ayarlamak istediğim > Çözümle'yi seçin. Tamam'a tıklayın.
  2. Hücresel analiz
    1. Birincil maske
      1. Analiz Ayarları'nın altında Tür: Hücresel Analiz ve Algılama Kanalı: ZProj[Tsf[Parlak Alan]] (sol panel, orta) öğesini seçin.
      2. Seçenekler'e tıklayın. Bu, Birincil Maske ve Sayım sayfasını açacaktır. Threshold (Eşik) kutusunda, Auto (Otomatik) seçeneğini işaretleyin ve Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. Nesneleri belirlenen eşik içinde göstermek için Nesneleri Vurgula kutusunu (sağ panel, alt) tıklatın. İlgilenilen nesneleri dahil etmek için gerektiği gibi ayarlayın.
        NOT: Eşik ayarları piksel yoğunluğuna bağlıdır. Örneğin, eşik 5000 olarak ayarlanırsa, yoğunluğu 5000'den büyük olan pikseller analize dahil edilir.
      3. Nesne Seçimi altında, minimum ve maksimum nesne boyutunu (μm) belirleyin. Hücresel kalıntıları/tek hücreleri hariç tutmak için gerektiği gibi ayarlayın.
        NOT: PDO boyutu, farklı modeller ve türler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Her model için minimum ve maksimum PDO boyutu eşiklerini belirlemek için Gen5 yazılımındaki ölçüm aracını kullanın. Kullanıcılar, ilaç tedavisinden sonra daha sonraki zaman noktalarında PDO fragmanlarının hariç tutulmasını önlemek için ölçüm aracı tarafından sağlanan değere göre daha küçük bir minimum PDO boyutu eşiği seçebilir.
      4. Analizi kuyunun belirli bir bölgesiyle sınırlamak için, Tüm görüntüyü analiz et seçeneğinin işaretini kaldırın ve Tak'a tıklayın. Image Plug (Görüntü Fişi ) penceresinde, Plug shape ( Fiş şekli) öğesini seçmek için açılır menüyü kullanın. Boyut ve konum parametrelerini ilgilenilen bölgeye uyacak şekilde gerektiği gibi ayarlayın.
        NOT: Arka planı en aza indirmek için PDO içermeyen alanları hariç tutarken fiş içindeki PDO sayısını en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Çoğaltmalar arasında ilgilenilen nesnelerin çoğunu tutarlı bir şekilde yakalayacak bir fiş boyutu belirleyin. Kubbenin kenarlarını da dışlayan bir tapa oluşturmak, kubbenin kenarlardaki aşırı eğriliğinden ışığın kırılması nedeniyle çarpık görünebilecek nesneleri dışladığı için önemlidir. Fiş içindeki yalnızca tüm PDO'ları yakalamak için Birincil kenar nesnelerini dahil et seçimi de kaldırılabilir.
    2. Alt popülasyon analizi. Alt popülasyon tanımlamasına bir örnek Şekil 3'te verilmiştir.
      1. Hücresel Analiz araç çubuğunda Hesaplanan Metrikler'e tıklayın. İlgilendiğiniz nesne düzeyinde metrikleri seçin veya oluşturun (sağ köşe, alt) seçeneğine tıklayın. Kullanılabilir Nesne metrikleri altında, ilgilendiğiniz metrikleri (ör. döngüsellik) seçin ve Ekle düğmesine tıklayın. Tamam'a tıklayın.
        NOT: Her PDO modelinin morfolojisi ve yoğunluğu, alt popülasyonu ayırt etmek için ilgilenilen en iyi metrikleri belirleyecektir.
      2. Hücresel Analiz araç çubuğunda Alt Popülasyon Analizi'ne tıklayın. Yeni bir alt popülasyon oluşturmak için Ekle'yi tıklayın. Bir açılır pencere açılacaktır.
      3. İsterseniz, alt popülasyon için bir ad girin. Nesne Metrikleri altında, ilgilendiğiniz bir metrik seçin ve Koşul Ekle'ye basın. Edit Condition (Koşulu Düzenle ) penceresinde, seçilen Object Metric için parametreleri girin. Gerektiğinde ek ölçümlerle tekrarlayın.
        NOT: Parametreler manuel olarak ayarlanabilir veya bulucu aracı kullanılarak ayarlanabilir. Örneğin, enkazı hariç tutmak için kullanıcılar Alanı Nesne Metriği olarak ekleyebilir ve 800'den küçük nesneleri seçebilir. Nesne Metriği olarak dairesellik rutin olarak kullanılır ve modele bağlı olarak döngüselliği 0,2-0,5'ten büyük olan tüm nesneler dahil edilir.
      4. Pencerenin altındaki tabloda, görüntülemek istediğiniz sonuçları kontrol edin. Tamam'ı tıklatın > Uygula'yı tıklatın.
      5. Alt popülasyon içindeki nesneleri görüntülemek için, Nesne Ayrıntıları açılır menüsünü (sağ panel, orta) kullanarak alt popülasyonu seçin. Parametrelerin içine giren nesneler görüntüde vurgulanacaktır.
        NOT: Birincil maskenin ve alt popülasyonun vurgu renklerini değiştirmek için, Ayarlar'ı tıklatın (sağ panel, alt).
      6. Alt popülasyon parametrelerini ayarlamak için, Hücresel Analiz araç çubuğundan Alt Popülasyon Analizi penceresini yeniden açın. Alt popülasyonu seçin ve Düzenle'yi tıklayın. Adım Ekle'ye tıklayın.
        NOT: Bu, tüm zaman noktalarında deney içindeki tüm kuyucuklara aynı analizi uygulayacaktır. Matris sayfasındaki açılır menüde, bireysel görüntüleme için farklı metrikler seçilebilir.

5. Gen5'ten Excel'e veri aktarma

  1. Bir veri dosyasını dışarı aktarmak üzere özelleştirmek için, araç çubuğundaki Rapor/Dışa Aktarma Oluşturucuları simgesini seçin. Açılan pencerede, Excel'e yeni dışa aktarma'yı tıklatın.
  2. Açılır pencerenin Özellikler sayfasında, Kapsam > Plaka ve İçerik > Özel'i seçin. Araç çubuğundaki İçerik seçeneğine tıklayın. Excel programını açacak olan Şablonu Düzenle'ye tıklayın.
  3. E-tabloda, Tablo > Kuyu Verileri > Eklentiler'i seçin. Dışa aktarma seçeneklerini görmek için çeşitli seçimlerin üzerine gelin. İlgilendiğiniz metriği seçin (örneğin, Nesne Ortalaması[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    NOT: Plaka düzeni, Protokol Özeti > Düzen > Eklentiler seçilerek elektronik tablo analizi şablonuna eklenebilir.
  4. Bir Düzenle penceresi açılacaktır. Kuyular kutusunda, dışa aktarılacak kuyucukları Well-ID veya Kuyu # ile belirleyin. Tamam'ı seçin. E-tablo dosyasına bir şablon yüklenecektir. E-tabloyu kapatın. Şablon otomatik olarak kaydedilir.
  5. Yeni Excel'e aktar penceresinde Tamam'a tıklayın ve Rapor/Dışa Aktarma Oluşturucuları penceresini kapatın.
  6. Gen5 araç çubuğundaki Dışa Aktar simgesine tıklayın. İstediğiniz dışa aktarma dosyasının yanındaki kutuyu işaretleyin. Tamam'a tıklayın. 5. Nesil, elektronik tablo şablonunu otomatik olarak doldurur ve dosyayı Excel'de açar.

6. Dış veri analizi

  1. Dışa aktarma dosyasını (.xlsx) Excel'de açın.
  2. Her kuyucuk için, her bir değeri o kuyu için 0:00 zaman noktası değerine bölün. Bu, 0 zaman noktasını 1'e eşit olarak ayarlayacak ve bunun ötesindeki her değer ilk okumaya göre olacaktır.
  3. Veri analizi yazılımında yeni bir dosya açın. XY düzen seçeneğini seçin.
    NOT: Bu protokolde GraphPad Prism (sürüm 9.5.1) kullanılmıştır.
  4. Her veri grubu için giriş etiketleri. Her tedavi grubu için zaman noktalarını ve karşılık gelen normalleştirilmiş değerleri kopyalayıp Prizma tablosuna yapıştırın. Veriler için bir grafik otomatik olarak oluşturulur ve Grafikler altında bulunabilir.

Sonuçlar

Amacımız, PDO terapötik yanıtını değerlendirmek için çoğullanmış canlı hücre görüntüleme kullanmanın fizibilitesini göstermekti. Kavram kanıtı deneyleri, endometriyal kanserin iki ayrı PDO modelinde gerçekleştirildi: ONC-10817 ve ONC-10811 (ONC-10811 verileri için Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'ye bakınız). Apoptoz (annexin V boyama) ve sitotoksisite (Cytotox Green tutulumu), apoptozu indükleyen ajan staurosporine yanıt olarak kinetik olarak izlendi. Spesifik olarak, PDO'lar 96 oyuklu plakalara kaplandı, Annexin V Red ve Cytotox Green boyaları ile muamele edildi ve Şekil 1'de gösterildiği gibi gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirildi. İki bağımsız PDO modelinde Annexin V ve Cytotox Green boyaları ile tedavinin toksik olmadığını doğruladık (Ek Şekil 2). Ertesi gün, PDO'lar artan staurosporin konsantrasyonları (0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM) ile tedavi edildi. Daha sonra, Gen5 yazılımında protokoller oluşturuldu ve deneyler her 6 saatte bir görüntüleme olmak üzere 5 günlük bir süre boyunca çalışacak şekilde ayarlandı. Veriler, protokolün 4. bölümünde açıklandığı gibi Gen5 yazılımındaki Hücresel Analiz işlevi kullanılarak analiz edildi. Birincil Maske, "Dokunan nesneleri böl" seçeneği işaretli değilken ve minimum: 30 μm ve maksimum: 1000 μm boyut parametreleriyle Otomatik eşik işlevi kullanılarak ayarlanmıştır. PDO alt popülasyonu döngüsellik > 0.25 ile tanımlandı. Belirlenen PDO alt popülasyonu içindeki TRITC (annexin V, apoptoz) ve GFP kanallarındaki (Sitotoks Yeşili, sitotoksisite) Nesne Ortalama Yoğunlukları, daha fazla analiz için bir .xlsx dosyası olarak dışa aktarıldı. Hem GFP hem de TRITC kanallarındaki her bir zaman noktasındaki her kuyu için Nesne Ortalama Yoğunluğu 0 zamanına normalleştirildi. Normalleştirilmiş floresan verileri daha sonra bir Prizma dosyasına aktarıldı ve bir çizgi grafiği olarak görselleştirildi.

Staurosporin ile tedavi, hem TRITC (annexin V) hem de GFP (Sitotoks) kanallarında Nesne Ortalama Yoğunluğundaki artışla kanıtlandığı gibi, apoptozda önemli, doza bağlı bir artışa ve araç kontrolüne kıyasla zaman içinde hücre sağlığında bir azalmaya neden oldu (Şekil 4, Şekil 5, Ek Video 1, Ek Video 2, Ek Video 3, Tamamlayıcı Video 4, Tamamlayıcı Video 5, Tamamlayıcı Video 6 ve Tamamlayıcı Video 7). 500 nM, 100 nM ve 10 nM staurosporin dozlarının her biri, zaman içinde hem apoptoz hem de sitotoksisitede istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden oldu (Şekil 5A-C) ve ayrıca deneyin sonunda (Şekil 5E, F). Ayrıca, staurosporin, toplam PDO alanındaki genel bir azalma ile gösterildiği gibi, bu konsantrasyonlarda PDO büyümesini ve oluşumunu etkili bir şekilde inhibe ederken, kontrol kuyuları toplam PDO alanında bir artış sergilemiştir (Şekil 4 ve Şekil 5D).

Canlı hücre görüntülemenin önemli bir avantajı, kaplamadaki değişkenliği düzeltme yeteneği olduğundan, hücre canlılığının bir son nokta ölçüsü olarak değerlendirildiği bir deney gerçekleştirdik. Kavram kanıtı son nokta test verileri, prostat kanserinin hasta kaynaklı bir ksenogreftinden üretilen bir PDO modeli kullanılarak toplandı. Tedavi periyodunun başlangıcında (0. gün) parlak alan görüntüleri toplandı, ardından hem canlılığı (akridin turuncusu, AO) hem de hücre ölümünü (propidyum iyodür, PI) ölçen bir çift boya reaktifi eklendi. AO bileşeni, hücre canlılığının bir göstergesi olan çift sarmallı DNA'ya bağlandıktan sonra yeşil bir floresan sinyali yayar. PI bileşeni ölü çekirdekli hücreleri boyar ve tedaviye yanıt olarak hücre ölümünü ölçmek için kullanılabilir. PDO kaplamadaki değişkenliği hesaba katmak için, parlak alan görüntülerini Dijital Faz Kontrast görüntülerine dönüştürerek 0 zamanında kuyu başına PDO sayısını belirlemek için bir yöntem geliştirdik (Ek Şekil 3 ve Ek Dosya 1).

Prostat kanseri PDO'ları 7 gün boyunca hücre ölümüne neden olan bir kemoterapi ajanı olan daunorubisin ile tedavi edildi. Deneyin tamamlanmasının ardından, numuneler Ek Dosya 1'de açıklandığı gibi AOPI ile boyandı, ardından Gen5'teki floresan görüntülerin analizi yapıldı. Şekil 6A , 7. günde AOPI uç nokta testinden alınan görüntülerin bir panelini göstermektedir. Araçla tedavi edilen PDO'ları (birinci sıra) 10 μM daunorubisin (ikinci sıra) ile tedavi edilen PDO'larla karşılaştırırken, yeşil floresanda (canlılık ölçüsü, ikinci sütun) ve kırmızı floresanda (hücre ölümünün ölçüsü, üçüncü sütun) belirgin bir azalma oldu. Bu sonuçlar daha sonra, AOPI uç nokta boyama tekniği kullanılarak elde edilebilecek okuma dizisini gösterdiğimiz Şekil 6B'de nicelleştirildi. Sol üstteki grafik, 0. günde her bir kuyucuğun Dijital Faz Kontrast görüntü analizi ile belirlenen PDO sayısına normalize edilmiş AO boyasından üretilen canlılık ölçümünü göstermektedir. Bu veriler, Şekil 6A'daki görsel sonuçla ilişkilidir, bu sayede daunorubisin konsantrasyonu arttıkça, canlılık büyük ölçüde azalmıştır. Bu, PI boyası ile elde edilen kırmızı floresanda bir artışla gösterilen hücre ölümünde bir artışı gösteren sağ üst grafikte daha da özetlenmiştir.

PI verileri daha sonra bir Uygulanabilir / Ölü Oranı hesaplamak için canlılık okuması (AO) ile birleştirildi (Şekil 6B, sol alt grafik). Bu oran, bir ilacın sitostatik mi yoksa sitotoksik mi olduğunu belirlemek için yararlı bir yaklaşımdır. Spesifik olarak, sitotoksik bir ilaç, sitostatik bir ilacın büyümeyi inhibe edeceği ancak hücre ölümünü indükleyemeyeceği gerçeğinden dolayı sitostatik bir ilaçtan 0'a çok daha yakın olacaktır. Son olarak, PDO'ların alanı, PDO'lar hücre ölümü ve kanama geçiriyor olsa bile, AO boyasının yeşil floresansı kullanılarak doğru bir şekilde hesaplanabilir. Sağ alttaki grafik, alt popülasyon analizinde gösterilen alanın toplamının PDO sayısına bölünmesiyle hesaplanan ortalama PDO alanını göstermektedir. Alanın analizi, bir tedavinin sadece PDO büyümesini inhibe edip etmediği veya aslında PDO gerilemesine neden olup olmadığı konusunda daha fazla gösterge verebilir. Ortalama PDO alanının analizinin, toplam PDO alanını hesaplamak için parlak alan görüntülerini kullanan Şekil 5D'nin aksine, GFP kanalı ve Hücresel Analiz işlevi kullanılarak gerçekleştirildiğini unutmayın. Bu veriler, veri kullanılabilirliğine ve kullanıcı ilgisine bağlı olarak analiz hattının esnekliğini vurgular.

Son olarak, canlılık okumaları için altın standart olan CellTiter-Glo 3D'yi AOPI kullanarak canlılık floresan okumasıyla karşılaştırdık (Şekil 6C). Bu normalleştirme tipik olarak CellTiter-Glo 3D kitini kullanan laboratuvarlar tarafından gerçekleştirilmediğinden, bu paneldeki verilerin zaman 0 PDO sayısına normalleştirilmediğini unutmayın. Her iki tahlilde de ilaç etkisi için aynı eğilimi gözlemledik, bu sayede daunorubisin konsantrasyonu arttıkça PDO canlılığı azaldı. Bu okumalar arasındaki tek görsel fark, CellTiter-Glo 3D analizinin AOPI analizinden önce bir IC50'ye ulaşması ve neredeyse tamamen 0'a ulaşmasıydı. Bu sonuç, daunorubisinin etki mekanizması ile açıklanabilir. Daunorubisin, çift sarmallı DNA kırılmalarına neden olan, hücre döngüsü durmasına ve sonunda apoptoza yol açan bir topoizomeraz-II inhibitörüdür14. Hücre döngüsü durması sırasında, ATP tükenmesi meydana gelebilir15. CellTiter-Glo 3D testinin bir lüminesans sinyali üretmek için bir ATP-lusiferaz reaksiyonuna dayandığı göz önüne alındığında, daha yüksek daunorubisin konsantrasyonlarında hücre canlılığındaki daha güçlü azalmanın, tam hücre ölümünden ziyade ATP tükenmesinden kaynaklandığını varsayıyoruz. Bu fikri destekleyen Şekil 6A'daki görüntüler, yeşil floresan ile gösterildiği gibi, kültürde PDO'larda yaşayan bir popülasyonu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Kaplama, görüntüleme ve analiz protokolüne genel bakış. PDO'lar 96 oyuklu bir plakaya kaplanır ve floresan boyalar ve ilaçlarla işlenir. Deney için görüntüleme parametreleri (örneğin, Pozlama, Z-yığını) Gen5 yazılımında oluşturulur. Görüntüler Cytation 5 tarafından alınır ve Gen5'te işlenir ve veriler daha fazla analiz için dışa aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hücresel Analiz özelliğine genel bakış. 1: Fişi Belirle: İlgi alanlarını içerecek şekilde bir fiş belirlenmiştir. 2: Birincil Maskeyi Ayarla: Birincil Maske, tercih edilen bir kanaldaki boyut ve piksel yoğunluğuna göre ilgilenilen nesneleri tanımlar. Bu temsili görüntüde, birincil maskeye dahil edilen nesneler mor renkle özetlenmiştir. 3: Alt Popülasyonu Tanımlayın: Analiz için istenen popülasyonu daha da hassaslaştırmak için ek bir alt popülasyon tanımlanabilir. Örnek görüntüdeki alt popülasyon (sarı renkle özetlenmiştir) daireselliğe (>0,25) ve alana (>800) göre tanımlanır. Görüntüler 4x objektif ile elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Hücresel Analiz özelliğini kullanan alt popülasyon maskeleme örnekleri. Alt popülasyonlar parlak alan kanalında tanımlanır. Örnek görüntülerdeki alt popülasyon (sarı renkle özetlenmiştir) daireselliğe (>0,25) ve alana (>800) göre tanımlanır. Görüntüler 4X objektifle elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Staurosporin tedavisi, apoptoz ve sitotoksisitede doza bağlı bir artışa neden olur. GFP ve TRITC floresan kaplamalı parlak alan görüntüleri (4x objektif), 3 zaman noktasında 500 nM, 10 nM ve 0.1 nM staurosporin dozları için gösterilir: 0 saat, 54 saat, 114 saat. Kırmızı floresan sinyali apoptozu (annexin V) gösterir ve yeşil floresan sinyali sitotoksisiteyi (Sitotoks) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: PDO yanıtını değerlendirmek için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntüleme. PDO modeli ONC-10817, 96 oyuklu plakalarda kaplandı ve gece boyunca 37 °C'de Annexin V Red (1:400) ve Cytotox Green (200 nM) boyaları ile inkübe edildi. Ertesi gün, PDO'lar artan staurosporin konsantrasyonları ile tedavi edildi ve ~ 5 gün boyunca her 6 saatte bir görüntülendi. (A,B) Staurasporine yanıt olarak (A) sitotoksisite veya (B) apoptozda zamana ve doza bağlı artış. Veriler, GFP veya TRITC kanalında Nesne Ortalama Yoğunluğu olarak çizildi. (C) 100 nM veya 500 nM staurosporine yanıt olarak apoptoz ve sitotoksisitenin zaman seyrinin karşılaştırılması. Veriler, GFP ve TRITC kanallarında Nesne Ortalama Yoğunluk değerleri olarak çizildi. (D) Staurosporin, PDO'ların büyümesini engeller. Veriler ortalama toplam PDO alanı olarak çizildi. A-D'deki veriler, her bir oyukta 0 saat zamanında PDO sayısına normalleştirildi ve ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatası olarak çizildi. Tedavi başına N = 5 teknik kopya. p < 0,0001 ile 2 yönlü ANOVA ile araç kontrolüne karşı. (E) Deneyin sonunda (114 saat) 500 nM staurosporin ile tedavi edilmiş PDO'ların araca karşı temsili parlak alan, GFP ve TRITC görüntüleri. Görüntüler 4x objektif ile elde edildi. (F) 114 saatlik zaman noktasında sitotoksisite, apoptoz ve canlılığın ölçülmesi. GFP Nesne Ortalama Yoğunluğu (solda) ve TRITC Nesne Ortalama Yoğunluğu (ortada), AC panellerinden elde edilen sonuçlar kullanılarak 114 saatlik zaman noktasında hesaplandı. Canlılık (sağda), üreticinin protokolüne göre CellTiter-Glo 3D reaktifi kullanılarak değerlendirildi. Ham lüminesans (RLU) değerleri, 0 saat zamanında toplam PDO alanına normalleştirildi ve 1.0 olarak ayarlanan araç kontrolüne göre kat canlılığı olarak çizildi. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 ile Dunnett'in post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA aracılığıyla araç kontrolü karşılaştırması. N = tedavi başına 5 teknik kopya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Uç nokta tahlil verilerinin normalleştirilmesine yardımcı olmak için canlı hücre görüntülemenin kullanımı. PDO'lar, 7 gün boyunca artan topoizomeraz-II inhibitörü daunorubisin konsantrasyonları ile tedavi edildi. PDO'lar AOPI Boyama Çözümüne maruz bırakıldı ve Ek Dosya 1'de açıklandığı gibi görüntülendi. AO = akridin portakalı, bir canlılık ölçüsü (GFP kanalı); PI = propidyum iyodür, hücre ölümünün bir ölçüsü (Texas Red kanalı). (A) 10 μM daunorubisin veya araç kontrolü (% 0.1 DMSO) ile 7 günlük tedaviden sonra AOPI boyama kullanılarak elde edilen temsili görüntüler. (B) Son nokta canlılığı/hücre ölümü yöntemi olarak AOPI floresansını kullanan farklı okumalar. Analiz yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklaması için Ek Dosya 1'e bakın. Sol üstte, AO boyama ile belirlenen 7 gün sonra PDO canlılığının analizi. Sağ üstte, PI boyama ile hücre ölümünün analizi. AO ve PI boyama verileri, 0 saat zamanında PDO sayısına ve daha sonra 1.0 olarak ayarlanan araç kontrolüne normalleştirildi ve ortalama ve standart sapma olarak çizildi. Sol altta, AO ve PI boyaları için ortalama nesne integralleri kullanılarak canlı-ölü oranının hesaplanması. Sağ altta, AO boyama ile belirlenen PDO alanı. GFP kanalında hücresel analiz yapıldı. (C) PDO canlılığını test etmek için iki yöntemin karşılaştırılması. Görüntülemeden sonra, üreticinin protokolüne göre CellTiter-Glo 3D reaktifi kullanılarak canlılık değerlendirildi. Araç kontrolüne göre kıvrım sağkalımı, artan daunorubisin konsantrasyonlarında çizildi. Veriler, tedavi başına N = 6 teknik kopya için ortalama ve standart sapmayı temsil eder; veriler panel C'de 0 saat olarak normalleştirilmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Muamele# kuyuMedya HacmiEkin100 μM Sitotoks
SeyreltmeHacimSeyreltmeHacim
Multiplex606.6 mL1:40016,5 μL200 nM13,2 μL

Tablo 1: Örnek çoğullama deneyi. Annexin V Red, apoptotik hücre zarlarının dış broşüründe açığa çıkan fosfatidil serini bağlar. Cytotox Green, zar bütünlüğü bozulmuş hücrelere entegre olur ve DNA'yı bağlar.

Ek Şekil 1: ONC-10811'in çoğullanmış canlı hücre görüntülemesi. PDO'lar 96 oyuklu plakalara kaplandı ve 37 ° C'de gece boyunca Annexin V Red (1:400) ve Cytotox Green (200 nM) boyalarında inkübe edildi. Ertesi gün, PDO'lar artan staurosporin konsantrasyonları ile tedavi edildi ve 5 gün boyunca her 6 saatte bir görüntülendi. (A) Staurosporine yanıt olarak sitotoksisitede zamana ve doza bağlı artış. Veriler, GFP kanalında Nesne Ortalama Yoğunluğu olarak çizildi. (B) 114 saatte staurosporinin doz yanıtı. Veriler, 114 saatlik zaman noktasında GFP kanalında Nesne Ortalama Yoğunluk değerleri olarak çizildi. (C) Staurosporine yanıt olarak apoptozda zamana ve doza bağlı artış. Veriler, TRITC kanalında Nesne Ortalama Yoğunluğu olarak çizildi. (D) 114 saatte staurosporinin doz yanıtı. Veriler, 114 saatlik zaman noktasında TRITC kanalında Nesne Ortalama Yoğunluk değerleri olarak çizildi. A ve C'deki veriler, kuyu seviyesinde 0 saat zamanında PDO sayısına normalleştirildi. N = Her modelde tedavi başına 5 teknik kopya. p < 0,0001 ile 2 yönlü ANOVA ile araç kontrolüne karşı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Annexin V ve Cytotox ile tedavi, PDO canlılığını bozmaz. PDO'lar 96 oyuklu plakalarda kaplandı ve 37 ° C'de gece boyunca Annexin V Red (1:400) ve Cytotox Green (200 nM) boyaları ile inkübe edildi. 24 saatlik inkübasyonun ardından, üreticinin protokolüne göre CellTiter-Glo 3D testi kullanılarak canlılık değerlendirildi. (A) Boya ile işlem görmüş ve işlenmemiş PDO'larda 24 saatlik zaman noktasında canlılık. Hem bağıl ışık birimi (RLU) değerleri hem de PDO toplam alanına normalleştirilmiş değerler sunulur. Spesifik olarak, her bir kuyucuk için CellTiter-Glo3D RLU, kaplama sırasında (yani boya ilavesinden hemen sonra) o kuyu için PDO alanının toplamına normalleştirildi. Toplam PDO alanı, Hücresel Analizde "Nesne Toplam Alanı" hesaplaması kullanılarak belirlendi. N = 10 olur. (B) 114 saatlik zaman noktasında boya ile işlenmiş ve işlenmemiş PDO'larda canlılık. Hem ham lüminesans değerleri hem de toplam PDO alanına normalleştirilmiş değerler sunulur. Her bir kuyucuk için CellTiter-Glo3D RLU, kinetik görüntüleme deneylerinde 0 saatlik zamana karşılık gelen, kaplama sonrası 24 saatte PDO alanının toplamına normalize edildi. N = 5 olur. A ve B'deki anlamlılık, eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak değerlendirildi; p değerleri grafiklerde listelenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Dijital faz kontrastı kullanılarak PDO'ların etiketsiz analizi. Bu şekil, Ek Dosya 1'de açıklandığı gibi etiketsiz analizi gösteren temsili görüntüler (2,5x objektif) içerir: Gen5 yazılımında tek bir odak görüş düzlemi analizi (Parlak Alan/Dijital Faz Kontrast Görüntüleri) ve Dijital Faz Kontrast Görüntü analizi için görüntüleme parametrelerinin ayarlanması. (A) Tek bir odak düzleminde prostat kanseri PDXO modelinin örnek parlak alan görüntüsü. (B) A'daki parlak alan görüntüsü, Dijital Faz Kontrast görüntüsüne dönüştürüldü. Parlak alan görüntüsündeki karanlık nesneler Dijital Faz Kontrastı görüntüsünde parlak görünür ve bunun tersi de geçerlidir. (C) Dijital Faz kontrast görüntüsünü kullanarak PDO maskeleme örneği. İlgilenilen nesnelerin kenarlarının, parlak alan görüntülerine kıyasla çok daha belirgin hale geldiğine dikkat edin. Bu temsili görüntüde, birincil maskedeki nesneler sarı renkle çerçevelenmiştir. (C)'deki alt popülasyon (pembe renkle özetlenmiştir) döngüsellik (>0.3), alan (>1000), Mean[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 ve Peak[Dig.Ph.Con] > 12500'e göre tanımlanır. Bu temsili şekilde kullanılan parametreler, 0. gündeki hücre sayısını normalleştirmek için Şekil 6'daki verilere uygulandı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: PDO modelleri, morfolojileri ve kaplama tutarlılıkları bakımından farklılık gösterebilir. Üst Panel: BME kubbelerinde PDO'ların diferansiyel dağılım örnekleri. Alt Panel: Diskohezif ve dairesel PDO'ların temsili görüntüleri. Tüm görüntüler EVOS mikroskobu ile elde edildi. Büyütmeler not edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Floresanı ölçmek için Hücresel Analiz ve Görüntü İstatistikleri kullanan örnek görüntüler. Kullanıcılar, Hücresel Analiz'i kullanarak bir görüntüdeki belirli popülasyonları tanımlayabilir ve bu bölgelerdeki floresansı ölçebilir. Görüntü İstatistikleri, arka plan sinyallerini hariç tutmak için bir eşik tanımlayarak bir görüntüdeki floresansı ölçmek için de kullanılabilir. Görüntü İstatistikleri'ni kullanmayla ilgili sınırlamalar için Tartışma'ya bakın. Görüntüler 4x büyütme oranındadır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Organoid kültür ortamı bileşenleri. Reaktiflerin jinekolojik kanser PDO'larını kültürlemek için optimize edildiğini unutmayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Her 6 saatte bir elde edilen görüntülerle 500 nM staurosporin tedavisinin hızlandırılmış videosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2: Her 6 saatte bir elde edilen görüntülerle 100 nM staurosporin tedavisinin hızlandırılmış videosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 3: Her 6 saatte bir elde edilen görüntülerle 10 nM staurosporin tedavisinin hızlandırılmış videosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 4: Her 6 saatte bir elde edilen görüntülerle 1 nM staurosporin tedavisinin hızlandırılmış videosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 5: Her 6 saatte bir elde edilen görüntülerle 0.1 nM staurosporin tedavisinin hızlandırılmış videosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 6: Her 6 saatte bir elde edilen görüntülerle 0.01 nM staurosporin tedavisinin hızlandırılmış videosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 7: Her 6 saatte bir alınan görüntülerle aracın hızlandırılmış videosu (%0,06 DMSO). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Ek protokoller. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

PDO kültürleri, hücresel tepkileri ve davranışları yansıtma yetenekleri nedeniyle giderek daha popüler bir in vitro model sistemi haline gelmektedir2. PDO üretimi, kültürü ve genişletme tekniklerinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, ancak terapötik yanıtları analiz etme yöntemleri gecikmiştir. Ticari olarak temin edilebilen 3D canlılık kitleri, potansiyel olarak değerli kinetik yanıt verilerini kaçıran ve sonraki analizleri diğer yöntemlerle sınırlayanlitik uç nokta testleridir 8. Gelişmekte olan çalışmalar, PDO modellerinde ilaç yanıtlarını değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme uygulamaktadır. Burada, çoğullanmış floresan canlı hücre görüntüleme kullanarak zaman içinde PDO terapötik yanıtlarını değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Floresan boyaların çoğullanması, farklı hücresel tepkilerin aynı anda ölçülmesine izin verir. Apoptoz ve sitotoksisiteye ek olarak, PDO'larda diğer fenotipik etkileri incelemek için bu yaklaşımın gelecekteki çalışmalarda genişletilebileceğini öngörüyoruz.

Burada sunulan protokol, 96 oyuklu bir plakada kubbe olarak kaplanmış PDO'ların kinetik parlak alan ve floresan görüntülerini elde etmek için tasarlanmıştır. Anahtar adımlar arasında 1) kaplama, 2) boya ve ilaçla muamele, 3) görüntüleme parametrelerinin tanımlanması, 4) kinetik görüntü elde edilmesinin tamamlanmasında görüntü ön işleme ve analizi ve 5) diğer istatistiksel yazılımlarda analiz için veri aktarımı yer almaktadır (Şekil 1). Bozulmamış PDO'lar, önceden tanımlanmış bir BME ve Organoid Kültür Ortamı oranından (tipik olarak 1: 1) oluşan 5 μL BME kubbeleri olarak 96 oyuklu bir plakada kaplanır. Burada sunulan protokol, minimum partiden partiye değişkenlik ve görüntüleme için üstün optik özellikler nedeniyle BME olarak UltiMatrix'i kullanır. Matrigel gibi diğer BME'lerde kültürlenen PDO'ların toplanması için modifikasyonların yanı sıra topaklanmış ve ayrışması zor modeller için gerekli olabilir (bkz. örnekler Ek Şekil 4). Daha sonra, floresan boyalar, kaplama sırasında (Gün -1) 100 μL'lik bir hacimde 2x konsantrasyonda Organoid Kültür Ortamına eklenir ve temel hücre ölümünü belirlemek için gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün (Gün 0), ilaçlar veya diğer tedaviler 100 μL'lik bir hacimde 2x konsantrasyonda Organoid Kültür Ortamına eklenir ve daha sonra 200 μL'lik bir son hacim için her bir oyuğa eklenir. 200 μL'lik son hacim görüntüleme ile menisküs etkisini azaltır. Kinetik görüntüler, BioSpa masa üstü inkübatörü ile ortaklaşa kullanılan Cytation 5 plaka okuyucu kullanılarak elde edilir. BioSpa inkübatör, deney plakalarının 37 °C sabit sıcaklıkta ve %5CO2 ortamında inkübasyonuna izin verir. BioSpa'da 8 adede kadar plaka saklanabilir ve böylece aynı anda 8 deney yapılabilir. Her plaka için görüntüleme parametreleri, "Görüntüleyici Manuel Modu" kullanılarak Gen5 yazılımında ayarlanır ve bir Protokol olarak kaydedilir. Protokol daha sonra zamanlama yazılımına (BioSpa OnDemand) yüklenir. BioSpa OnDemand yazılımı, plakanın BioSpa inkübatörden Cytation 5'e fiziksel olarak aktarılması ve veri toplama için Gen5'te hangi protokolün çalıştırılacağının belirlenmesi de dahil olmak üzere kinetik görüntü elde etme iş akışını otomatikleştirir. Görüntüler, Gen5 yazılımındaki Hücresel Analiz işlevi kullanılarak analiz edilir (Şekil 2). Floresan ve parlak alan görüntülerinin Z Projeksiyonlarını analiz etmek için özel yöntemler açıklıyoruz. Tek Z düzlemlerini ve/veya yalnızca parlak alan görüntülerini analiz etmek için özel yöntemler Ek Dosya 1'de verilmiştir. Son olarak, kullanıcılar, ilaç etkilerinin daha sonraki istatistiksel analizi için bir Excel elektronik tablosu olarak dışa aktarmak üzere PDO alanı, sayı ve ortalama floresan yoğunluğu gibi belirli veri özelliklerini tanımlayabilir.

PDO modellerinin ilaç etkilerini sorgulamak için nispeten yeni bir model sistem olduğu göz önüne alındığında, kültür koşullarına, özellikle de BME'deki büyümeye uyum sağlayacak yöntemler hala ortaya çıkmaktadır16. İlaç tedavisine PDO yanıtını değerlendiren çalışmaların çoğu, hücre sağlığı için bir vekil olarak ATP tabanlı son nokta testlerine dayanmaktadır (CellTiter-Glo 3D). Bu yöntem, hücre lizizini gerektirir, böylece sonraki aşağı akış analizlerini engeller. Floresan boyama, tek zaman noktası görüntüleme ve morfolojik izleme gibi alternatif son nokta deneyleri, ek amaçlar için numune kullanımına izin verirken ilaç yanıtını karakterize etmek için başka ölçümler sağlamıştır. Örneğin, ilaç etkilerinin yüksek verimli analizi için plaka içi son nokta fiksasyon protokolleri uygulanmıştır17,18. Bu yöntemin bir avantajı, tipik immünohistokimya ve immünofloresan görüntülemede19 gerekli olan kapsamlı işlemeyi atlatması ve PDO modellerinde olduğu gibi numune sınırlı olduğunda özellikle yararlı olmasıdır. Ayrıca konfokal mikroskopi ile yüksek çözünürlüklü görüntülemeye de uygundur. Hücre lizizi gerektirmeyen başka bir son nokta testi, propidyum iyodür veya akridin portakalı gibi reaktiflerle canlı hücre görüntülemedir. Hücre canlılığı ve ölümünün değerlendirilmesi için hücre lizizi gerektirmeyen CellTiter-Glo 3D ve AOPI'nin karşılaştırmalı analizi (Şekil 6C), PDO modellerinde canlı hücre görüntüleme boyalarının kullanılmasının avantajlarını vurgulamaktadır. Bu yöntem, bir deneyin18,19,20 sonunda fenotipik etkileri değerlendirmek için bizimki de dahil olmak üzere birçok grup tarafından uygulanmıştır. Bununla birlikte, kuyu içi fiksasyon veya uç nokta canlı hücre görüntüleme yöntemleri kullanılarak kinetik veri toplama, önemli ölçüde numune gerektirir. PDO'ların zaman içinde etiketsiz morfolojik değerlendirmesi kısmen bu sınırlamanın üstesinden gelir ve çok çeşitli görüntüleme yöntemleri kullanılarak değerlendirilebilir 8,10,17,18, ancak morfolojideki değişiklikler apoptoz ve hücre canlılığındaki değişiklikler gibi potansiyel ilaç etkilerinin spektrumunu temsil etmeyebilir. İlaçlara yanıtta morfolojik değişikliklerde modelden modele önemli değişkenlik gözlemledik. Örneğin, bazı PDO'lar apoptoz geçirdikleri için alanda artacak, diğer modeller küçülebilir. Kinetik morfolojik değerlendirmeler, sınırlı sayıda çalışmadasabit veya canlı hücre floresan sonlanım noktası testleri ile çoğullanmıştır 18,20. Burada sunulan yöntemler, yüksek verimli bir sistemde çoklu hücresel etkileri aynı anda değerlendirmek için farklı floresan boyaları çoğaltan ilk yöntemler arasındadır.

Kinetik canlı hücre görüntülemenin sağladığı en büyük gelişmelerden biri, uç nokta tahlilleriyle ilişkili temel sınırlamaların üstesinden gelmesidir. Örneğin, kuyu başına eşit sayıda PDO kaplamak teknik olarak zordur, çünkü çoğu otomatik hücre sayacı 60 μm'den küçük nesneler için kapılıdır. Canlı hücre görüntüleme, her bir kuyucukta 0 saat zamanında PDO sayısına veya alanına normalizasyona izin verir, bu daha sonra kuyular arasındaki kaplamadaki varyasyonu ayarlamak için kullanılabilir. PDO'lar için altın standart son nokta testi, hücre canlılığı için bir vekil olarak ATP'yi ölçen CellTiter-Glo 3D kitidir. Bu testi jinekolojik ve prostat kanseri PDO'ları 13,21,22,23,24 çalışmalarımızda yaygın olarak kullandık. ATP ölçümleri için hücre lizisi gerektirmenin yanı sıra, ilaçlar ve diğer terapötik modaliteler ATP seviyelerini değiştirebilir ve potansiyel olarak terapötik yanıtın yanlış bir değerlendirmesini sağlayabilir. Canlı hücre görüntüleme boyalarının kullanılması, apoptoz ve sitotoksisite gibi spesifik hücresel yanıtların daha geniş bir kapsamının ölçülmesine izin verir. Daha da önemlisi, bu reaktifler, propidyum iyodürde olduğu gibi hücre canlılığını bozmaz veya DNA hasarına neden olmaz; bu, PDO yanıtının zaman içinde tekrar tekrar değerlendirilmesine izin verir. Kinetik ölçümler için akridin portakalının (AO) kullanımını araştırmamış olsak da, AO'nun etki mekanizması gelecekte bu tür bir uygulamayı engellememelidir.

Tümörler, değişen genomik profillere ve morfolojilere sahip birkaç farklı hücre popülasyonundan oluşur. PDO modellerinin karmaşık heterojenliği nedeniyle, bireysel PDO yanıtları değişebilir ve bu yanıtları izlemek zordur. Protokolümüz, birden fazla PDO yanıt metriğini iyi bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bazı teknik hususlar canlı hücre görüntüleme için hala geçerlidir. 96 oyuklu bir plakayı tohumlamak için gereken 24 oyuklu bir plakanın kuyu sayısı, her bir PDO modelinin yoğunluğuna ve büyüme hızına bağlı olacaktır. Topaklanma, görüntü analizini karıştırabileceğinden (Ek Şekil 4), PDO modelleri, kaplamadan önce ek işlem adımlarına ihtiyaç duyabilir. Gerekirse, PDO'lar işleme sırasında geniş çaplı olmayan bir p200 ucuyla kuvvetli pipetleme yoluyla mekanik olarak kesilebilir. TrypLE Express kullanılarak enzimatik sindirim, PDO ayrışmasını ve topaklanmayı azaltmak için kaplamadan önce de kullanılabilir. Deneyimlerimize göre, TrypLE inkübasyonunun uzunluğunun modele bağlı olarak oldukça değişken olduğunu belirttik. Bu nedenle, özellikle araştırmacılar tek hücreli süspansiyonlar elde etmek istiyorlarsa, TrypLE inkübasyonu her model için optimize edilmelidir. Enzimatik sindirime özellikle duyarlı olan PDO modelleri için tedaviye başlamadan önce iyileşme süresi gerekli olabilir.

Spesifik canlı hücre görüntüleme reaktifleri için yöntemler sunuyoruz. Burada sunulan yöntemlerin geniş uygulanabilirliğindeki bir sınırlama, BME ile uyumlu reaktiflerin yetersizliğidir. PDO'larda kullanım için henüz optimize edilmemiş diğer boyalar/reaktifler için, optimum konsantrasyonu belirlemek ve çözücü etkilerini en aza indirmek için ek sorun giderme gerekebilir. İlgilenilen okumaya bağlı olarak (ör., apoptoz veya sitotoksisite), reaktif koşullarını optimize etmek için staurosporin veya daunorubisin13 gibi hücre ölümünü indüklediği bilinen bir bileşikle tedavi kullanılmalıdır. Ek bir husus, BME kubbesine boya entegrasyonu için en uygun zamandır. Deneylerimizde, boyanın kubbelere tam olarak alınmasına izin vermek ve temel hücre sağlığını belirlemek için tedaviden önce bir gece inkübasyon gerçekleştiriyoruz. Sinyal yoğunluğu zamanla artacağından, araştırmacılar aşırı pozlanmış görüntülerden kaçınmak için deneyin sonunda ideal maruz kalma süresini belirlemek için boyalarla pilot çalışmalar yapmalıdır. Son olarak, reaktifler hücresel süreçlere müdahale etmemelidir. Örneğin, DNA'ya karışan boyalar kinetik görüntüleme ile uyumlu değildir. Bununla birlikte, canlı hücre görüntüleme, uç nokta tahlillerinde veri normalizasyonu için kullanılabilir. Gerçekten de, AOPI kullanarak hücre canlılığını ve yaşayabilir: ölü hücre oranını ölçmek için ek bir yöntem sunuyoruz. Bu deneyde, floresan sinyali, 0. günde (tedavi günü, Şekil 6) canlı hücre görüntüleme ile belirlendiği gibi her kuyu için PDO sayısına normalleştirilir.

Bu yöntem kağıdının bir diğer sınırlaması, deneyler için manuel pipetlemeye güvenilmesidir ve bu da teknik kopyalarda daha fazla farklılığa yol açabilir. Diğerleri tarafından gösterildiği gibi, kaplama ve ilaç dağıtımı için otomatik bir sıvı işleyicinin kullanılması gibi deneysel sürecin diğer adımlarına otomasyonun eklenmesiyle veri tekrarlanabilirliğinde daha fazla iyileştirme sağlanabilir 8,10. Ancak bu ekleme, tüm araştırmacılar için mevcut olmayabilecek araştırma altyapısına ek bir yatırım gerektirir. Her model için PDO alanındaki heterojenlik göz önüne alındığında, sonuçları 0 saat zamanındaki ilk PDO sayısına veya alanına normalleştirmek, otomatik tohumlama ile hala yararlı bir yaklaşımdır.

Cytation 5'in diğer canlı hücre görüntüleme platformlarına göre önemli bir avantajı, görüntü ve analiz özelliklerini özelleştirme yeteneğidir. Bununla birlikte, Cytation 5/Gen5 yazılımı dik bir öğrenme eğrisine sahiptir ve kullanıcıların temel bir görüntüleme bilgisine sahip olduğunu varsayar. Bu yöntem makalesinin amaçlarından biri, diğer araştırmacıların PDO araştırma programlarına karmaşık canlı hücre görüntüleme tekniklerini dahil etmelerinin önündeki engeli azaltmak için adım adım talimatlar sağlamaktır. Burada sunulan belirli analiz adımları tek bir sistem için olsa da, kullanıcılar, aşağı akış analizinin NIH ImageJ gibi üçüncü taraf yazılımların kullanılmasını gerektirebileceği anlayışıyla çoğullama ilkelerini diğer platformlara uygulayabilir.

Analiz metrikleri hem deneysel hedeflere hem de kaplama koşullarına göre seçilmelidir. Örneğin, deney hücre ölümünü ölçmek için bir floresan boya kullanılarak yapılırsa, floresan yoğunluğu etkili bir okumadır. En etkili floresan metriği (Toplam Floresan ve Nesne Ortalama Yoğunluğu) kaplama koşullarına bağlı olacaktır (Ek Şekil 4). PDO'lar eşit olarak dağılmışsa ve daha dairesel, yapışkan bir morfolojiye sahipse, tanımlanmış bir PDO alt popülasyonunda floresan belirlenebilir. Gen5 yazılımındaki belirli işlev Hücresel Analiz'dir ve çıktı Nesne Ortalama Yoğunluğu'dur. Bununla birlikte, PDO modeli kümelenmişse veya diskohezif bir morfolojiye sahipse, floresan sinyalini görüntü düzeyinde ölçmenizi öneririz; bu işlev Görüntü İstatistikleri altında bulunabilir ve çıktı Toplam Floresan Yoğunluğu'dur. Bu yöntem, bireysel kuyu seviyesindeki değişiklikleri gözlemlemek için yararlı olsa da, bu metrik, ilgilenilen nesnelere özgü değildir ve PDO'lar deney süresi boyunca belirlenen fişin dışına çıkarsa hatalı bir şekilde değişebilir. Önemli miktarda enkaz veya ölü tek hücrelerin olduğu senaryolarda, özellikle bir PDO ile ilişkili olmayan herhangi bir floresan sinyalini kapatmak için Hücresel Analizin kullanılması önerilir. Hücresel Analiz ve Görüntü İstatistikleri kullanılarak yapılan diferansiyel sonuçların bir örneği Ek Şekil 5'te sunulmuştur.

Görüntü İstatistikleri işlevi için en uygun eşiği belirlemek için çizgi aracı kullanılabilir. Kullanıcılar, çizgi aracını kullanarak bir görüntüdeki floresan yoğunluğu aralığını belirleyebilir. Alt eşiği, görüntüdeki tepe yoğunluğunun %25 değeri olarak belirledik. Belirlenen eşiğe dahil edilen floresan alanları görüntülemek için "Eşik Aykırı Değerleri" kutusunu işaretleyin. Alt eşik değerinin ek ince ayarı gerekli olabilir.

Canlı hücre görüntülemede önemli bir zorluk, her deneyde üretilen büyük miktarda veriyi depolamaktır. Bu, özellikle Z-Stack'lerin birkaç odak düzleminde görüntüleme yapmak ve bir Z Projeksiyonu oluşturmak için kullanıldığı PDO kültürleri söz konusu olduğunda geçerlidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için birden fazla yöntem vardır. İlk olarak, yeterli depolama kapasitesi sağlayın. Toplam 17 TB'lık üç katı hal sabit diski kurduk. Diğer seçenekler arasında deneysel dosyaların harici sabit sürücülere veya ağa bağlı depolamaya aktarılması yer alır. Dosyaları doğrudan bulut tabanlı depolamaya yazmanız önerilmez. Harici bir sürücüde depolanan verileri analiz etmek için, deneyi ve görüntü dosyalarını Gen5 yazılımına sahip bir bilgisayara aktarmanız yeterlidir (NOT: büyük dosyaların aktarılması uzun sürebilir). Analizden önce, görüntülerin deneye yeniden bağlanması gerekir. Deneme dosyasını açın, araç çubuğunda Protokol'e tıklayın, Protokol Seçenekleri'ni seçin. Image Save Options (Görüntü Kaydetme Seçenekleri) ve Select new image folder (Yeni görüntü klasörü seç) seçeneğini tıklatın. Görüntü dosyasını bulun ve yeniden bağlanmak için Klasör Seç'i tıklayın.

Denemenin hedeflerine bağlı olarak, Gen5 içinde gruplama özelliğini kullanmak da uygun olabilir. Gruplama, piksel sayısını azaltarak dosya boyutunu azaltır ve bu da görüntü çözünürlüğünün düşmesine neden olur (bkz. adım 3.5.3.2). Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü görüntüler gerekiyorsa gruplama önerilmez. Gruplama özelliğini kullanırken, pozlama ayarlarının yapılması gerekecektir. Deney dosyası oluşturulduktan sonra, Görüntü bölümüne çift tıklayın ve Görüntüleyici Manuel Modunu yeniden açmak için mikroskop simgesine tıklayın. Otomatik pozlama işlevini kullanın veya pozlamayı gerektiği gibi manuel olarak ayarlayın.

Özet olarak, sitotoksik ajanlara yanıt olarak PDO'ların apoptozu ve hücre sağlığını değerlendirmek için yöntemler sunuyoruz. Gelecekteki çalışmalar, yöntemleri optimize etmek ve PDO'ların kinetik görüntülenmesi için diğer fenotipler ve sitotoksik yerine sitostatik ilaçların etkileri gibi ek analiz stratejileri geliştirmek için gereklidir. Önemli bir engel, BME ile uyumlu boyaların ve reaktiflerin ticari mevcudiyetidir. Bu modellerden en fazla veriyi elde etmek için kinetik canlı hücre görüntülemenin tam olarak nasıl kullanılabileceğini daha iyi anlamak için daha fazla çalışma yapılması gerekiyor.

Açıklamalar

KWT, Immortagen Inc.'in ortak sahibidir. CJD, Agilent'in bir çalışanıdır. JSdB, Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo ve Vertex Pharmaceuticals'tan danışma kurullarında görev almış ve ücret almıştır; AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer ve Vertex'ten araştırma çalışmaları için fon veya başka destek almış olan ve DNA onarımı kusurlu kanserlerde abirateron, PARP inhibisyonu ile ticari ilgisi olan Kanser Araştırmaları Enstitüsü'nün (ICR) bir çalışanıdır. ve PI3K/AKT yolu inhibitörleri (kişisel gelir yok); Janssen tarafından sunulan ve abirateron asetatın kortikosteroidlerle kullanımını kapsayan 8 822 438 numaralı patent için hiçbir mali çıkarı olmayan bir mucit olarak adlandırıldı; endüstri destekli birçok klinik araştırmanın CI/PI'si olmuştur; ve Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (NIHR) Kıdemli Araştırmacısıdır. Başka hiçbir yazarın ifşa edilecek herhangi bir potansiyel çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Hasta tümör örnekleri sağladıkları için Iowa Üniversitesi'nden Doku Tedarik Çekirdeği ve Dr. Kristen Coleman'a ve PDO modeli oluşturmaya yardımcı olduğu için Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü'nden Dr. Sofia Gabrilovich'e minnettarız. Ayrıca makalenin eleştirel analizi için Dr. Valerie Salvatico'ya (Agilent, ABD) teşekkür ederiz. Aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul ediyoruz: KWT'ye CA220729P1 NIH/NCI CA263783 ve DOD CDMRP; İngiltere Kanser Araştırmaları, Prostat Kanseri İngiltere, Prostat Kanseri Vakfı ve JSdB Tıbbi Araştırma Konseyi. Fon sağlayıcıların deneylerin tasarımında veya analizinde veya yayınlama kararında hiçbir rolü yoktu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüDot Scientific Inc1008113
15 mL konik santrifüj tüpüSarstedt62.554.100
554 NM LED KüpAgilent1225012
96 oyuklu plakaCorning Costar359637 °C'ye önceden ısıtılmış; C
96 oyuklu plakaAgilent204626-10037 °C'ye önceden ısıtılmış; C
A83-01Tocris2939Nihai konsantrasyon 500 nM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Gelişmiş DMEM/F-12Gibco12634-010organoid kültür ortamının bileşeni
B27 TakviyesiGibco17504044Nihai konsantrasyon 1x'tir (organoid kültür ortamının bileşeni)
BioTek BioSpa 8 Otomatik İnkübatörAgilentBIOSPAG-SNMasa üstü kuluçka makinesi; BioSpa OnDemand programlama yazılımı, görüntüleme için BioSpa ve Cytation 5 arasında plakaları aktarmak için Gen5 ile iletişim kurar (bu protokol sürüm 1.01.10'u kullanır)
BioTek Cytation 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuAgilentCYT5PW-SNPlaka okuyucu; Bu cihaz için Gen5 yazılımı kullanılmaktadır (bu protokol 3.12.08 sürümünü kullanır)
Cultrex UltiMatrix Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran ÖzüR& D SistemleriBME001-10
Daunorubisin HClSigma-AldrichS3035
EDTA (0.5 M)Thermo FisherAM9260G
; M (organoid kültür ortamının bileşeni)
GlutamaxGibco35050-061Nihai konsantrasyon 1x'tir (organoid kültür ortamının bileşeni)
HEPESGibco15630-080Nihai konsantrasyon 10 mM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
İnsan EGF, Hayvansız Rekombinant ProteinGibcoAF-100-15-1MGNihai konsantrasyon 0,5 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
İnsan FGF-10 Rekombinant ProteinGibco100-26-1MGNihai konsantrasyon 10 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
İnsan R-Spondin 1 Rekombinant ProteinGibco120-38-5UGNihai konsantrasyon 250 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Hidrokortizon Stok ÇözeltisiKök Hücre Teknolojileri7926Nihai konsantrasyon 500 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Görüntüleme Filtresi Küpü- GFPAgilent1225101
Görüntüleme Filtresi Küpü- TRITCAgilent1225125
Görüntüleme LED'i GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Kırmızı BoyaSartorius4641Organoid kültür ortamında sulandırıldı
İnkosit Sitotoks Yeşil BoyaSartorius4633DMSO çözeltisi
N-Asetil-L-sisteinSigma-AldrichA7250Nihai konsantrasyon 1.25 mM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Boyama ÇözeltisiFisher-Scientific133661691:50 hacim
NikotinamidSigma-AldrichN0636Nihai konsantrasyon 10 mM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
NogginR& D Systems6057-NGNihai konsantrasyon 100 ng/mL (organoid kültür ortamının bileşeni)
Penisilin-StreptomisinGibco15140122Nihai konsantrasyon 10 birim/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Fosfat Tamponlu Salin (1x)Gibco14190-144
PrimosinInvivoGenant-pm-05Nihai konsantrasyon 100 &mikrodur; g/mL (organoid kültür ortamının bileşeni)
Rekombinant İnsan Heregulinβ-1Pepro Tech100-03Nihai konsantrasyon 37.5 ng/mL'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
Streptomyces sp.'den staurosporin çözeltisi.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000Nihai konsantrasyon 5 ve mikrodur; M (organoid kültür ortamının bileşeni)
ve beta;-EstradiolSigma-AldrichE2758Nihai konsantrasyon 100 nM'dir (organoid kültür ortamının bileşeni)
DMSO Dimetil sülfoksit Sigma-Aldrich D2438 Forskolin Tocris 1099'da Sulandırıldı Nihai konsantrasyon 10 &mikro ekleyin

Kaynaklar

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hasta Kaynakl Organoidlerla Yan t AnaliziMultiplex G r nt lemeOrganoid la TaramaFloresan BoyalarKinetik G r nt lemeZ Y n G r nt lemeApoptoz NicemlemesiH cresel Fenotipleme

İlgili makaleler