Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Özet

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Özet

Protein-protein etkileşimi (PPI) ağları, hastalıkta dinamik olarak yeniden şekillenir, ancak çoğu sistem biyolojisi yaklaşımı, kritik etkileşim düzeyindeki işlev bozukluğunu gözden kaçırarak protein bolluğundaki değişikliklere odaklanır. Burada, hücrelerde ve birincil insan dokusunda ÜFE ağ işlev bozukluklarının yüksek verimli, sistematik, hastalık bağlamlı haritalanmasını sağlayan sağlam, kemoproteomik bir yöntem olan işlevsiz Protein-Protein İnaktertomu (dfPPI) sunuyoruz. Bu yöntem, yalnızca transkriptomik veya proteomik verilerden anlaşılmayan protein ağlarının yeniden kablolanmasını ortaya çıkarmak için etiketsiz sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ve ağ tabanlı hesaplamalı analiz ile epikaperom tabanlı interaktom düzeneklerini seçici olarak yakalayan kimyasal biyoloji problarını entegre eder. dfPPI platformu, eyleme geçirilebilir işlev bozukluğu düğümlerini belirlemek ve hastalığın ilerlemesine ilişkin yüksek çözünürlüklü, sistem düzeyinde içgörüler sağlamak için hastalık durumları, türler ve dokular arasında uygulanabilir. Bu protokolde, dfPPI veri kümelerini oluşturmak ve yorumlamak için kullanılan numune hazırlama, kimyasal prob işleme, afinite zenginleştirme, etiketsiz LC-MS/MS analizi ve biyoinformatik iş akışları için adım adım prosedürleri gösteriyoruz. Bu makale, bu yaklaşımın tekrarlanabilirliğini ve erişilebilirliğini teşvik etmeyi, daha geniş sistem biyolojisi ve translasyonel araştırma toplulukları tarafından benimsenmesini desteklemeyi amaçlamaktadır.

Giriş

Hücrelerin ve buna bağlı olarak organizmaların işlevi, protein-protein etkileşimi (PPI) ağlarının ^1,2 kesin koordinasyonuna bağlıdır. Bu ağlar neredeyse tüm biyolojik süreçlerin organize edilmesinden ve yürütülmesinden sorumludur. ÜFE ağları doğası gereği dinamik ve strese duyarlı olsa da, hastalıkta anormal şekilde yeniden yapılandırılabilir ve uyumsuz işlevlere yol açabilir. Daha da önemlisi, bu yeniden kablolama mutlaka gen veya protein ekspresyonundaki değişiklikleri içermez; daha ziyade, normalde ^3,4,5 eksprese edilen proteinler arasındaki değişmiş fiziksel etkileşimlerden kaynaklanır. Sistem biyolojisindeki transkriptomik veya proteomik gibi geleneksel yaklaşımlar, etkileşim düzeyindeki bu kritik değişiklikleri yakalamakta başarısız olur.

ÜFE haritalama teknolojileri, hücresel ağların organizasyonu ve düzenlenmesi hakkında içgörüler sunarak^önemli ölçüde ilerlemiştir 6,7,8,9,10,11. Afinite saflaştırma-kütle spektrometrisi (AP-MS), çapraz bağlama (XL)-MS, yakınlık etiketleme ve ko-fraksiyonlama dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan yaklaşımların her biri, yüksek özgüllük, uzamsal çözünürlük veya geçici kompleksleri tespit etme yeteneği gibi belirli avantajlar sunar 6,8,9,10,11 . Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle yem proteinleri, genetik manipülasyon veya karmaşık biyoinformatik gerektirir ve doğal biyolojik sistemlerde^protein ağlarının büyük ölçekli, hastalık güdümlü yeniden kablolanmasını yakalamakta zorlanabilir 6,7,8,9,10,11 . Çoğu aynı zamanda ölçeklenebilirlikten yoksundur, bu da onları büyük numune kohortlarını analiz etmek veya koşullar, hücre tipleri veya zaman noktaları 6,7,8,9,10,11 arasındaki interaktom değişikliklerini sistematik olarak haritalamak için kullanışsız hale getirir (Tablo 1).

Bu boşluğu gidermek için, hastalık fenotiplerinden¹² sorumlu PPI ağ işlev bozukluklarını doğrudan tanımlayan kemoproteomik bir yöntem olan işlevsiz Protein-Protein İnaktertom (dfPPI) platformunu geliştirdik. Önemli bir biyolojik içgörüden yararlanır: hastalık durumlarında, moleküler şaperonların bir alt kümesi, epişaperomlar ^13,14,15 adı verilen supramoleküler yapı iskeleleri oluşturur. Bu yapılar protein katlanmasında hareket etmez, bunun yerine protein bağlantısını yeniden düzenleyen iskele etkileşim merkezleri olarak işlev görür³. En önemlisi, epişaperomlara ayrılan proteinler rastgele değildir; Hastalık fenotipi 16,17,18,19,20'nin sürdürülmesinde aktif olarak yer alanlardır. Bu epikaperiroma bağlı proteinleri ve bunların etkileşimcilerini yakalayarak, dfPPI, belirli hastalık durumlarını yönlendiren kesin ağ değişikliklerini tanımlar. Epikaperom güdümlü ağ yeniden kablolaması, hastalıklar arasında yaygındır - çoğunlukla Alzheimer hastalığı kohortlarında ve ~%70'i kanser örneklerinde ^16,20 - dfPPI'nin büyük, hastalık odaklı çalışmalara uygulanabilirliğini destekler.

dfPPI platformu, numune hazırlama, epikaperom afinite yakalama ve MS ile interaktom tanımlamasından, yol zenginleştirme ve fonksiyonel protein ağı modelleme gibi aşağı akış biyoinformatik analizlerine kadar tüm iş akışını kapsar (Şekil 1). Yöntem, fonksiyonel interaktomu hücrelerden veya dokulardan izole etmek için afinite matrisleri (PU-boncuklar veya diğer problar) 13,16,17 üzerinde hareketsiz hale getirilmiş epikaperiroma özgü kimyasal probları kullanır. Bu problar, epişaperomlara özgüllük ve dfPPI 16,17,18,20,21,22'ye uygunluk açısından çok sayıda yayında titizlikle doğrulanmıştır. Yakalanan kompleksler, hem boncuk üzerinde hem de jel içi sindirim iş akışları kullanılarak MS'e tabi tutulur ve ardından etiketsiz LC-MS/MS uygulanır. Ortaya çıkan veriler daha sonra etkileşim düzeyindeki işlev bozukluğunu tanımlayan ve onu biyolojik süreçlere ve fenotiplere bağlayan özel bir biyoinformatik boru hattı aracılığıyla analiz edilebilir. Epişaperomlar bağlama özgü interaktomları 17,18,20 desteklediğinden, dfPPI, protein ağlarının belirli bir hastalıkta, hücre tipinde veya aşamada nasıl yeniden şekillendiğini ortaya çıkarır ve bu da onu hassas fenotipleme için güçlü bir sistem biyolojisi aracı haline getirir.

Yöntem oldukça ölçeklenebilirdir ve kanser ve nörodejenerasyon gibi çeşitli hastalıklarda ölüm sonrası insan dokusu ve kültürlenmiş hücreler dahil olmak üzere yüzlerce klinik ve deneysel örneğe uygulanmıştır 16,17,18,19,20,22,23. Patolojik bir durumu tanımlayan ÜFE değişikliklerini ortaya çıkararak, dfPPI hem mekanik içgörü hem de eyleme geçirilebilir terapötik hedeflerin^{keşfedilmesini sağlar} 16,17,18,19,20,22,23.

Bu protokolde, epikaperiroma bağlı interaktomların afinite yakalamasından LC-MS/MS için numune hazırlamaya ve MS yoluyla interaktom tanımlamasına kadar dfPPI platformunun deneysel bileşenlerini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Hesaplamalı analiz hattı - yani, diferansiyel etkileşimleri ve fonksiyonel sonuçları tanımlamak için MS tarafından tanımlanan proteinlerin listesiyle ne yapıldığı - alan sınırlamaları nedeniyle burada ele alınmamaktadır. Bununla birlikte, https://epichaperomics.mskcc.org'deki dfPPI Shiny Uygulaması (https://dfppi.mskcc.org'e güncellendi) ve https://www.chiosislab.com/resources'daki Chiosis Lab web sitesi aracılığıyla ücretsiz olarak erişilebilir ve kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir. Bu portallara ek olarak, eksiksiz biyoinformatik boru hattı ve beraberindeki komut dosyaları, dfPPI'yi kanser ^16,17,19 ve Alzheimer hastalığına^18,20 uygulayan çeşitli yayınlarda yer almaktadır.

Protokol

Protokol, kurumumuzun insan araştırmaları etik kurulu ve hayvan bakım ve kullanım komitesinin yönergelerini takip etmektedir. Çalışmada kullanılan ekipman ve reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Afinite yakalama için numune hazırlama

1. Dokudan protein ekstraksiyonu
   NOT: Bu protokol ölüm sonrası beyin dokusu örnekleri için optimize edilmiştir.
   1. 20 mM Tris (pH 7.5), 20 mM KCl, 5 mM MgCl₂ ve %0.01 NP-40 (doğal lizis tamponu) içeren bir protein ekstraksiyon tamponu hazırlayın. Kullanmadan hemen önce proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin. Tamponu buz üzerinde tutun.
   2. Dondurulmuş dokuyu (hedef hacim yaklaşık 50 mm³), havaneli ile donatılmış özel bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünden oluşan bir mikro doku homojenizatör tüpüne yerleştirin. 500-700 μL doğal lizis tamponu ekleyin, hacmi doku kompaktlığına ve homojenizasyon kolaylığına göre ayarlayın. Homojen bir süspansiyon oluşana kadar tokmağı yavaşça yukarı ve aşağı ve homojenizatör tüpünün aşındırıcı duvarlarına doğru hareket ettirerek numuneyi buz üzerinde homojenize edin.
      NOT: Protein düzeneklerini doğal konfigürasyonlarında tutmak ve protein bozulmasını önlemek için tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
   3. Şişeyi bir rotasyon ünitesine yerleştirerek lizatları 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında numuneleri döndürerek yavaşça karıştırın.
   4. Kalıntıları gidermek için bir tezgah üstü santrifüj kullanarak numuneleri 13.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   5. Süpernatanları toplayın ve şeffaf 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Transfer sırasında peleti rahatsız etmekten kaçının.
   6. Üreticinin talimatlarına göre bisinkoninik asit (BCA) test kitini kullanarak süpernatanttaki toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Protein lizatları kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir. Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının. Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinin ve depolama sıcaklığının protein düzeneklerinin bütünlüğü üzerindeki etkisi için önceki bir yayına²⁴ bakın.
2. Örnek normalleştirme
   NOT: HSP90α ve HSP90β, epikaperomun temel bileşenleridir ve interaktom yakalama 13,21,23 için kullanılan kimyasal probun doğrudan bağlanma ortaklarıdır. HSP90α'ya (veya HSP90β'ya) dayalı numunelerin normalleştirilmesi, yakalanan interaktomların doğru bir şekilde karşılaştırılması için gerekli olan, probla hedeflenebilir epikaperom miktarının numuneler arasında eşleştirilmesini sağlar. Numuneler, Western blot tarafından belirlenen HSP90 seviyelerine göre normalleştirilebilir, ancak başka yöntemler de kullanılabilir. HSP90 seviyeleri numuneler arasında karşılaştırılabilirse, bu bölümü atlayın ve adım 1.3'e geçin. Burada HSP90α/β lekelemenin kullanımı yalnızca girdi normalizasyonu içindir ve bir epikaperom bolluğu ölçüsü olarak yorumlanmamalıdır.
   1. %4 sodyum dodesil sülfat (SDS), %20 gliserol, %10-merkaptoetanol, %0,02 bromofenol mavisi ve 0,125 M Tris-HCl, pH ~6,8'den oluşan 2× Laemmli numune tamponu hazırlayın.
      DİKKAT: 2-merkaptoetanol toksik ve uçucudur ve çeker ocakta kullanılmalıdır.
   2. 5 μg toplam beyin proteini ekstraktını (adım 1.1'den itibaren) 1:1 (h/h) 2× Laemmli numune tamponu ile 1.5 mL'lik şeffaf bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
   3. Sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerine yüklemeden önce proteinleri denatüre etmek için numuneleri bir ısıtma ünitesinde 95 °C'de 3-5 dakika ısıtın.
   4. Numuneleri prekast %8 Tris-Glisin protein jellerine yükleyin. Alternatif olarak, elle dökülen jeller kullanın.
   5. Protein moleküler ağırlığını belirlemek için her jelin üzerine, örneğin ilk kuyucuğa 5 μL önceden boyanmış protein standardı yükleyin.
   6. Jelleri RT'de 1× TGS (Tris-Glisin-SDS) çalışma tamponunda çalıştırın. Tipik çalışma süresi 100 V'ta 1,5-2 saattir.
   7. 25 mM Tris, 192 mM glisin ve %20 metanol içeren bir transfer tamponu hazırlayın.
      DİKKAT: Metanol yanıcıdır ve güvenlik kurallarına göre kullanılmalıdır.
   8. Proteinleri, sabit voltajda (100 V) 60 dakika boyunca 4 °C'de transfer tamponunda bir nitroselüloz membran üzerine aktarın.
   9. Bir membran yıkama solüsyonu (1× TBS-%0,1 Tween-20) ve bloke edici solüsyon (1× TBS-%0,1 Tween-20'de %5 süt) hazırlayın. Bu protokol, ticari bir kaynaktan alınan yağsız kuru süt tozunu kullanır.
   10. Membranı, bir platform külbütör üzerinde hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca bloke edici solüsyona yerleştirin. Mini jel başına 10 mL bloke edici solüsyon kullanın.
   11. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve membranı anti-HSP90α antikoru (10 mL bloke edici çözelti içinde 1:6.000 seyreltme) ile gece boyunca 4 °C'de bir platform külbütör üzerinde inkübe edin.
   12. Antikor solüsyonunu çıkarın ve membranı her biri 10 mL yıkama solüsyonu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   13. HRP konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikorunu (10 mL 1× TBS-%0.1 Tween-20'de 1:5.000 seyreltme) ekleyin ve bir platform rocker üzerinde RT'de 1 saat inkübe edin.
   14. İkincil antikoru çıkarın ve membranı dört kez yıkama solüsyonuyla yıkayın (yukarıdakiyle aynı hacim ve zamanlama).
   15. Üreticinin talimatlarına göre gelişmiş bir kemilüminesans (ECL) kiti kullanarak HSP90α'ya özgü kemilüminesan sinyalini tespit edin. Bir kemilüminesans görüntüleme sistemi veya otoradyografik film kullanın.
   16. Sinyal yoğunluğuna dayalı olarak numunelerdeki HSP90α seviyelerini ölçün ve aşağı akış aşağı çekme için bir normalleştirme faktörü hesaplayın.
       NOT: HSP90 sinyalinin yoğunluğu, her numunedeki prob hedeflenebilir epikaperom miktarını yansıtır. Numuneler arasındaki sinyal yoğunluğunu karşılaştırarak ve her jel üzerinde çalışan bir referans numuneye normalleştirerek, interaktom yakalama için giriş hacimleri buna göre ayarlanabilir. Niceleme, dansitometri yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Lekeler arasında normalizasyona izin vermek için her jele her zaman bir referans numunesinin bir alikotu ekleyin.
3. PU boncuk hazırlama
   NOT: PU boncuklar ve kontrol boncukları, daha önce^21,25 bildirildiği gibi kurum içinde sentezlenebilir veya bir malzeme transfer anlaşmasının (MTA) imzalanması üzerine Chiosis laboratuvarından talep edilebilir. İzopropanol içinde -20 °C'de saklanmalıdırlar.
   1. Doğrudan izopropanol stoğundan poliüretan (PU) boncuklardan veya kontrol boncuklarından oluşan bir kısım alın. Yıkama ve taşıma sırasında boncuk kaybını hesaba katmak için yaklaşık %30 fazlalık ekleyin.
   2. Depolama çözücüsünü çıkarın: boncukların çökmesine izin verin, ardından izopropanolü aspire edin. Doğal lizis tamponu ekleyin (1,5 mL'lik bir tüp için 1 mL; 15 mL'lik bir konik için 5 mL) ve nazik pipetleme veya ters çevirme yoluyla tamamen yeniden süspanse edin.
   3. Üç kez yıkayın ve dengeleyin: her yıkama için, yeniden süspanse etmek için girdap, santrifüjleyin (1,5 mL tüp: 10.000 × g, 1 dakika; 15 mL konik: 3.000 × g, 5 dakika), ardından peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı pipet ucuyla donatılmış bir vakum hattıyla aspire edin.
   4. Düzgün bir çalışma boncuk bulamacı oluşturmak için yıkanmış boncuklara 1:1 hacim oranında (boncuklar:tampon) doğal lizis tamponu ekleyin.
   5. Numune başına 40 μL PU boncuk (veya kontrol boncuğu) bulamacı (örneğin, 1:1 v/v boncuklar: tampon) 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine bölün. Boncuk dağıtımını kolaylaştırmak için ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanın.
      NOT: PU boncuklar ışığa duyarlıdır. Aşağı çekme adımları sırasında koyu veya folyoya sarılmış 1,5 mL'lik tüpler kullanın. Küçük moleküllü epikaperom bağlayıcı ile hidrofobik yüzey kaplamaları nedeniyle, PU boncuklar topaklanma ve plastik yüzeylere yapışma eğilimindedir. Yavaşça pipetleyin ve düzgün bir yeniden süspansiyon sağlamak için iyice karıştırın. Tutarsız veya tekrarlanamayan sonuçlara yol açabilecek protein yakalamadaki değişkenliği önlemek için her numuneye eşit hacimde boncuk bulamacı dağıtmak kritik öneme sahiptir.
   6. Her tüpe 1 mL tampon ekleyerek, vorteksleyerek, 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyerek ve süpernatanı aspirasyon yoluyla atarak boncukları doğal lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Her yıkama arasında boncukların tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun.
      NOT: Aspirasyon yaparken boncuklara dokunmaktan kaçının. Sıvıyı çıkarırken pipet ucunu tüpün duvarına hafifçe bastırın.
   7. Son yıkamadan sonra, boncuk peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek sıvının çoğunu tüplerden çıkarın.
      NOT: Yıkanmış boncuklar 4 °C'de birkaç gün saklanabilir. Tipik olarak, boncuklar hazırlandıktan sonra 1-2 gün içinde kullanılır.
4. İnteraktom açılır menüsü
   NOT: Aşağı çekmenin ilk adımı, epişaperomları¹⁶ bağlamayan inert küçük bir moleküle konjuge edilen kontrol boncuklarını kullanan bir ön temizleme adımıdır. Bu adım, spesifik olarak etkileşime girmeyen proteinleri, agregaları ve çözünmeyen kalıntıları lizattan uzaklaştırır, böylece sonraki PU-boncuk aşağı çekme işleminin özgüllüğünü artırır. Ön temizleme, arka plan bağlanmasını azaltır ve spesifik epikaperomla ilişkili proteinlerin tespitini geliştirir.
   Bu protokol tarafından geri kazanılan interaktom, deneysel kirleticilere karşı oldukça hassas olan MS tarafından analiz edilir. Doğru protein tanımlamasını sağlamak ve veri kalitesini korumak için her zaman taze hazırlanmış tamponlar ve reaktifler kullanın, toza ve keratine maruz kalmayı en aza indirin ve numuneleri, sarf malzemelerini veya ekipmanı tutarken temiz, pudrasız eldivenler giyin. Tüm aşağı çekme ve jel içi sindirim adımları için MS'e özel cam eşyalar/sarf malzemeleri kullanın ve Western blotlama için kullanılan tüm öğeleri fiziksel olarak ayrı tutun. Cam eşyaları yeniden kullanıyorsanız, %100 metanol, ultra saf su, %80 asetik asit, ultra saf su ile sırayla durulayarak dekontamine edin ve ardından havayla kurutun. Deterjan kullanmayın; eser kalıntılar bile LC kolonlarını ve iyon kaynaklarını kirletebilir.
   1. Normalleştirilmiş protein ekstraktlarını (HSP90 leke yoğunluğuna göre hesaplanan adım 1.2'ye göre) 40 μL kontrol boncuk bulamacı (yani, 20 μL boncuk + 20 μL tampon) içeren ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve uygun hacimde doğal lizis tamponu ekleyerek son hacmi 250 μL'ye ayarlayın.
      NOT: Numuneye özgü girdi hacimlerini belirlemek için, A1 = (60 / C1) × X1 formülünü kullanın, burada A1 eklenecek normalleştirilmiş toplam protein hacmidir (μL), C1 ölçülen protein konsantrasyonudur (μg/μL) ve X1, HSP90 lekelemeden türetilen normalleştirme faktörüdür (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Eklenecek ek tampon hacmi 250 μL eksi A1 olarak hesaplanır. Normalizasyon gerekmiyorsa, 250 μL'de 250 μg toplam protein kullanın.
   2. Numuneleri 4 °C'de 30 dakika boyunca uçtan uca döndürücü (10-15 rpm) üzerinde döndürerek inkübe edin.
   3. Kontrol boncuklarını agrega edilmiş veya çözünmeyen protein ile birlikte peletlemek için tüpleri 4 °C'de 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı 1 mL'lik bir pipet kullanarak kontrol boncuklarından dikkatlice toplayın ve 40 μL yıkanmış PU boncuk bulamacı içeren 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
   5. Numuneleri 4 °C'de 3 saat boyunca uçtan uca döndürücü (10-15 rpm) üzerinde döndürerek inkübe edin.
   6. Her tüpü 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve boncukları 1 mL doğal lizis tamponu ile dört kez yıkayın. Her yıkama için: adım 1.3'te açıklanan parametreleri kullanarak vorteks, santrifüj ve aspire edin.
      NOT: Bu aşamada, numuneler iki iş akışından biri kullanılarak LC-MS/MS için işlenebilir: (1) SDS-PAGE ve ardından jel içi sindirim veya (2) yakalanan proteinlerin boncuk üzerinde sindirimi.
      Jel içi sindirim iş akışı için protokole yazıldığı gibi devam edin. Boncuk üzerinde sindirim için, boncukları soğuk PBS ile iki kez daha yıkayın ve hemen Bölüm 3'e geçin. Boncuk üzerinde sindirime devam ediyorsanız boncukları dondurmayın; numuneler aynı gün taze olarak işlenmelidir. Boncuk bağlı protein komplekslerinin dondurulması, protein çözünürlüğünün toplanmasını veya kaybını teşvik ederek sindirim verimliliğini bozabilir, bu da daha düşük peptit geri kazanımına ve artan değişkenliğe yol açabilir. MS çekirdek tavsiyelerine göre, boncuk üzerinde tutarlı sindirimi sağlamak için numuneler aynı gün taze olarak işlenmelidir.
5. Jel içi sindirim için numune hazırlama
   1. Adım 1.4.6'da hazırlanan ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde bulunan boncuk numunelerine 25 μL 2× Laemmli numune tamponu ekleyin.
      NOT: Bu noktadaki numuneler -80 °C'de 24 saate kadar saklanabilir. Proteom kapsamını en üst düzeye çıkarmak ve interaktomun tam temsilini sağlamak için jel içi sindirim için her zaman tüm numune hacmini SDS-PAGE jeline yükleyin. Kısmi yükleme önerilmez. Numune hacmi sınırlıysa ve kısmi yükleme kaçınılmazsa, donma-çözülme döngülerini en aza indirmek ve interaktom bütünlüğünü korumak için kalan malzeme alikotlarda saklanmalıdır.
   2. Protein komplekslerini denatüre etmek ve SDS-PAGE'e yüklemeden önce boncuklardan ayrıştırmak için her numuneyi 95 °C'de 3 dakika ısıtın (yukarıdaki gibi eklenen 2× Laemmli numune tamponu ile). Tampondaki SDS ve indirgeyici maddeler, ÜFE'leri bozar ve matristen proteinleri serbest bırakır.
   3. Her tüpü RT'de 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin.
   4. Her süpernatanı %4-20 prekast gradyan SDS-PAGE jellerine yükleyin.
   5. Jelleri RT'de 1× TGS çalışma tamponunda çalıştırın ve çalışmayı yarıda durdurun (100 V'ta jelin içine ~3,5-4 cm, tipik olarak 30-60 dakika çalışma süresi).
   6. Jeli elektroforez ünitesinden çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre Coomassie parlak mavi ile boyamaya devam edin.
      NOT: Plastik bir kapta 5-7 mL ultra saf suya batırılan lekeli jel, protein tanımlaması için MS tesisine taşınabilir. Hemen işlenmezse, 4 °C'de ultra saf suda 1-2 haftaya kadar saklayın. İşi gerçekleştiren çekirdek tesise ve deneysel hedeflere bağlı olarak iki alternatif proteomik iş akışı kullanıldı: Bölüm 2, jel içi sindirimi ve ardından dört kutuplu orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak veriden bağımsız edinim (DIA)-MS analizini açıklar; Bölüm 3, paralel birikim-seri parçalanma (diaPASEF)²⁶ ile kapana kısılmış iyon hareketlilik spektrometrisi için optimize edilmiş bir boncuk üzerinde sindirim protokolünü detaylandırmaktadır. Uygun olduğunda adımlara çapraz referans verilebilir.

2. Jel içi protein sindirimi ile LC-MS/MS ile Protein Tanımlaması

1. Sisteinile proteinlerin jel içi indirgenmesi ve alkilasyonu
   1. Her Coomassie lekeli jel şeridinin lekeli bölgesini çıkarın ve yaklaşık beş eşit büyüklükte jel dilimi halinde kesin. Her dilimi, sıcaklık kontrollü bir mikrotüp çalkalayıcıda 700 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de 1 dakika boyunca 500 μL %50 (v / h) metanol içinde üç kez inkübe ederek lekeleyin.
      NOT: Sonraki adımlarda reaktiflerin verimli difüzyonunu × gece boyunca verimli jel içi tripsin sindirimini sağlamak için her jel dilimi ~1 cm'den × 0,5 cm'den 1 cm'den büyük olmamalıdır. Kimyasal probun doğrudan bağlayıcılarını ve epikaperom 15,16,23'ün çekirdek bileşenlerini temsil eden HSP90 ve HSC70 gibi ağır lekeli proteinlere karşılık gelen jel bölgesini, jelin geri kalanından ayrı olarak çıkarın. Aksi takdirde yüksek bollukları, LC-MS/MS analizi sırasında düşük bolluktaki etkileşim aktörlerinin saptanmasına ve miktarının belirlenmesine müdahale edebilir.
   2. Her jel dilimini 37 °C'de %30 asetonitril (ACN) içinde hazırlanmış 500 μL 5 mM amonyum bikarbonat (ABC) içinde inkübe edin ve kalan lekeyi çıkarmak için sıcaklık kontrollü bir mikrotüp çalkalayıcıda 15 dakika boyunca 700 rpm'de çalkalayın. Jel dilimi tamamen lekelenene kadar inkübasyonu tekrarlayın.
      NOT: Kalan herhangi bir görünür protein lekesi, peptit temizleme adımı sırasında peptitin C18 matrisine bağlanmasını engelleyerek iyileşmeyi ve aşağı akış MS duyarlılığını azaltabilir.
   3. ABC/ACN solüsyonunu ince uçlu bir pipet kullanarak jel parçalarını kaybetmemeye dikkat ederek çıkarın ve atın (yani jel parçalarını sıvıyla birlikte aspire etmeyin). Daha sonra her tüpe 500 μL %100 ACN ekleyin ve jel parçalarının tamamen suya batırıldığından emin olun. RT'de 700 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 10 dakika veya jel parçaları yarı saydam hale gelene, boyut olarak küçülene ve beyaz kağıt görünümünü alana kadar inkübe edin.
      DİKKAT: ACN yanıcıdır ve çeker ocakta kullanılmalıdır.
   4. Jel parçalarını aspire etmemeye dikkat ederek ince uçlu bir pipet kullanarak ACN'yi her tüpten çıkarın ve atın. Kalan sıvıyı toplamak için 10 saniye boyunca 1.000 × g'da kısa bir süre santrifüjleyin ve kalan damlacıkları ince uçlu bir pipetle dikkatlice aspire edin. Açık tüpleri RT'de 10-15 dakika veya jel dilimleri kuru ve sert olana kadar bir vakum santrifüjüne yerleştirin.
      NOT: Aşırı kurutmayın. Jel parçalarının çatlamasını veya aşırı büzülmesini önlemek için periyodik olarak kontrol edin. Kuruduktan sonra jel parçalarını sindirime kadar kapalı, düşük bağlayıcı bir tüpte veya mikrosantrifüj tüpünde 4 °C'de saklayın; jele bağlı ve saflaştırılmış proteinler, 4 °C'de tutulduğunda birkaç güne kadar stabildir.
   5. İndirgeme: Her numune tüpüne ~100 μL 10 mM Ditiyotreitol (DTT) (500 mM amonyum bikarbonat içinde 500 mM stoktan taze hazırlanmış) ekleyin ve jel parçalarının tamamen suya daldırıldığından emin olun. Sıcaklık kontrollü bir mikrotüp çalkalayıcıda 700 rpm'de çalkalama ile 56 °C'de 45 dakika inkübe edin.
      DİKKAT: DTT cildi ve solunum yolunu tahriş edicidir. Kimyasal çeker ocak içinde tutun ve eldiven giyin.
      NOT: Buharlaşmayı önlemek ve DTT konsantrasyonunu korumak için inkübasyon sırasında tüplerin sıkıca kapatıldığından emin olun.
   6. Alkilasyon: Jel parçalarını rahatsız etmemeye dikkat ederek ince uçlu bir pipet kullanarak DTT solüsyonunu her tüpten çıkarın. Jel dilimlerini tamamen kaplamak için hemen 50 mM ABC'ye ~100 μL 55 mM iyodoasetamid (IAA) ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca 700 rpm'de çalkalama ile RT'de inkübe edin.
      DİKKAT: IAA toksiktir ve ışığa duyarlıdır. Tüm işlemleri eldiven giyerek çeker ocakta gerçekleştirin.
      NOT: Alkilasyon reaksiyonunun söndürülmesini önlemek için IAA eklemeden önce DTT'nin tamamen çıkarıldığından emin olun. IAA bozulmasını en aza indirmek için tüpleri alüminyum folyoya sarın veya inkübasyon sırasında ışığı engelleyen kaplar kullanın.
   7. Alttaki artık sıvıyı toplamak için tüpleri RT'de 5 saniye boyunca 1.000 × g'da kısaca santrifüjleyin. Jel parçalarını rahatsız etmemek için ince delikli bir pipet ucu (örn. P10 ucu) kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Jel parçalarının aspire edilmesi riskini en aza indirmek için tüpü hafifçe eğin ve kenardan aspire edin.
   8. Dengeleyin: Jel parçalarını %30 ACN'de 500 μL 50 mM ABC ile kaplayın. RT'de 10 dakika inkübe edin, ısıtılmış bir yörünge çalkalayıcıda 700 rpm'de çalkalayın. Bu adım, fazla alkilasyon reaktifinin uzaklaştırılmasına yardımcı olur ve dehidrasyondan önce jeli dengeler.
   9. Çözeltiyi çıkarın: 5 saniye boyunca 1.000 × g'da kısaca döndürün ve yukarıda açıklandığı gibi ince uçlu bir pipet kullanarak süpernatanı atın.
   10. Tekrar kurutun: Jel parçalarını %2.1.3 ACN kullanarak yeniden kurutmak için 2.1.4 ve 100 adımlarını tekrarlayın ve ardından kuruyana kadar vakumlu santrifüjleme yapın. Bu adım, enzimatik sindirim sırasında optimum peptit geri kazanımını sağlar.
2. Jel içi proteoliz ve peptit temizliği
   1. Jel parçalarını tamamen yeniden sulandırmak için 50 mM ABC'de 5 ng/μL'lik bir nihai konsantrasyonda MS dereceli tripsin ekleyerek kurutulmuş jel numunelerini sindirin (tipik olarak 50-100 μL toplam hacim veya jel dilimlerini kaplayacak kadar). Gece boyunca 37 °C'de 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde inkübe edin ve buharlaşmayı önlemek için tüplerin sıkıca kapatıldığından emin olun. Mümkünse hafifçe çalkalayın (örneğin, sıcaklık kontrollü bir mikrotüp çalkalayıcıda 300 rpm).
   2. %1 (h/h) nihai konsantrasyon elde etmek için damla damla %10 formik asit (FA) ekleyerek gece boyunca sindirimin ardından numuneyi asitleştirin (örneğin, 100 μL sindirime 1 μL %10 FA ekleyin). Yavaşça karıştırın, ardından peptit ekstraksiyonunu arttırmak için tüpleri bir RT su banyosu sonikatöründe 10 dakika boyunca sonikleştirin.
   3. Peptit içeren süpernatanı ince uçlu bir pipet (örn. P10 dar delikli uç) kullanarak, jel matrisini veya aspirat jel parçalarını bozmamaya dikkat ederek dikkatlice çıkarın. Toplanan süpernatanı düşük bağlı 500 μL'lik bir tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
   4. Her tüpe %5 FA/%50 ACN (h/h) çözeltisi ekleyin (tipik olarak ~50-100 μL veya jel parçalarını tamamen kaplayacak kadar) ve RT'de hafifçe çalkalayın (örneğin, 70 rpm'de 10-15 dakika boyunca bir çalkalayıcıda) kalıntı peptitleri çıkarmak için. Süpernatanı dikkatlice toplayın ve adım 2.2.3'teki orijinal peptit çözeltisiyle birleştirin.
   5. Kombine peptit ekstraktını, RT'de vakumlu santrifüjleme kullanarak (örneğin, ~30 dakika boyunca 1.000 × g ) sadece küçük bir damlacık kalana kadar konsantre edin. Tüpün duvarlarına yapışması nedeniyle peptit kaybına neden olabileceğinden numunenin tamamen kurumasına izin vermeyin. Kısmen kurutulmuş ekstraktı tuzdan arındırmak için hemen kullanın veya -20 °C'de kapalı, düşük bağlanmalı bir tüpte saklayın.
   6. ^{Daha önce} 27 açıklandığı gibi, 200 μL'lik bir pipet ucuna yerleştirilmiş iki istiflenmiş C18 ekstraksiyon diski ile hazırlanmış, elle paketlenmiş küçük ölçekli C18 paketli pipet uçları (yani StageTips) kullanarak peptitlerin tuzunu aşağıdaki modifikasyonlarla tuzdan arındırın:
   7. 40 μL metanol ekleyerek C18 disklerini etkinleştirin. Diskleri içeren pipet ucunu (200 μL'lik boş bir pipet ucuna yerleştirilmiş ve 500 μL'lik bir tüpün içine yerleştirilmiş) 1.500 × g'da bir tezgah üstü santrifüj kullanarak 3 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Tüm adımlarda C18 disklerinin kurumasına izin vermeyin. Kurutma, peptit bağlanmasını ve elüsyonunu engelleyecektir. Elle paketlenmiş küçük ölçekli C18 paketli pipet ucunu tutan dış 200 μL pipet ucunun (manşon), tüp içi iki uçlu düzeneğin santrifüje düzgün şekilde oturduğundan emin olmak için uçtan ~ 1 cm kesilerek kısaltılması gerekebilir.
   8. %0.1 FA ekleyerek ve yukarıdaki gibi santrifüjleyerek diskleri dengeleyin.
   9. 20 μL %0.1 FA'da sulandırılmış peptit çözeltisini doğrudan istiflenmiş disklerin üstüne uygulayın.
   10. Peptitlerin C18 disklerine bağlanmasını kolaylaştırmak için 5 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjleyin.
   11. Bağlı peptitleri kolondan 40 μL %0.1 FA geçirerek yıkayın.
   12. %0.1 FA içeren 40 μL %70 ACN içeren elüt peptitler. Ayrıştırılan peptitleri, LC-MS/MS analizine kadar -80 °C'de düşük bağlayıcı tüplerde saklayın. Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının.
3. DIA kullanılarak MS analizine bağlı Nano-LC
   1. Tuzdan arındırılmış peptit elüatını vakumlu santrifüjleme kullanarak (örneğin, RT'de 20-30 dakika, 1.000 × g) küçük bir damlacık bırakarak konsantre edin. Peptitleri, LC-MS dereceli suda 10 μL %0.1 FA içinde, yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek ve kısa bir süre vorteksleyerek sulandırın. Devam etmeden önce tüpün dibindeki sıvıyı toplamak için kısa bir süre aşağı döndürün.
   2. Sulandırılmış peptit numunesinin 4 μL alikotlarını nano-LC-MS/MS ile analiz edin. Peptitleri, 50 °C'de tutulan, kendinden paketlenmiş bir ters fazlı kolon (75 μm ID × 2 cm, C18 reçinesi, 3 μm partikül boyutu) üzerinde ayırın. Bir C18 reçinesi bulamacını (metanol içinde, 1:3 v/v) entegre 10 μm püskürtme ucu (360 μm OD × 75 μm ID × 10 μm uç) ile kaynaşmış bir silika kılcal damara paketleyerek bir basınç bombası²⁸ kullanarak kolonu hazırlayın. Kolonu nanosprey iyonizasyon yoluyla DIA iş akışlarını destekleyen yüksek çözünürlüklü bir hibrit kütle spektrometresine (dört kutuplu-Orbitrap tipi) bağlayın.
      NOT: SDS-PAGE jel dilimlerinden üretilen peptit karışımları için optimum ayırma sağladığı için 20 cm'lik bir kolon uzunluğu önerilir.
   3. Tutarlı peptit tutma ve ayırma sağlamak için bir kolon fırını veya ısıtma bloğu kullanarak analitik kolonu 50 °C'de tutun. Dalgalanmalar tekrarlanabilirliği etkileyebileceğinden çalışma boyunca sabit sıcaklık kontrolü sağlayın.
   4. 250 nL/dak'lık bir akış hızında, 110 dakika boyunca %0.1 FA'da %3-40 ACN'lik doğrusal bir gradyan kullanarak peptitleri ayrıştırın. Bu gradyan, MS tespitinden önce etkili peptit ayrımı sağlar. Kolon dengelemesi dahil toplam analiz süresi 120 dakikadır.
   5. Daha önce açıklandığı gibi yüksek çözünürlüklü bir MS kullanarak DIA modunda veri alın²⁹.
      1. 300-1650 m/z tarama aralığında 120.000 çözünürlükte (m/z 200'de) profil modunda alınacak tam MS1 anket taramalarını ayarlayın. Kayan bir izolasyon penceresi şeması kullanarak 30 sıralı öncü pencerenin (364-1370 Th) MS2 parçalanması ile her MS1 taramasını takip edin.
      2. 25.5, 27.0 ve 30.0'lık kademeli normalleştirilmiş çarpışma enerjilerini kullanarak parçalanma gerçekleştirin. Varsayılan maksimum öncü şarj durumu 4'tür. MS/MS taramalarında sabit ilk kütleyi 200 Da'ya ayarlayın ve 30.000 çözünürlükte MS2 spektrumları elde edin.
      3. MS2 için otomatik enjeksiyon süresi ayarı ve MS1 için maksimum 60 ms enjeksiyon süresi kullanın. Hem MS1 hem de MS2 taramaları için iyon hedefini (AGC) 3e6 olarak ayarlayın.
4. Afinite ile yakalanan interaktomların göreceli nicelleştirilmesi
   NOT: Afinite ile yakalanan epikaperom interaktomlarının DIA-MS analizlerinde tanımlanan proteinleri ölçmek için, DIA iş akışlarını destekleyen ve peptit yoğunluğuna veya spektral sayımlara dayalı güvenilir niceleme sağlayan bir yazılım platformu kullanın. Bu protokol, peptit/protein tanımlaması ve etiketsiz yoğunluğa dayalı niceleme için MaxQuant'ı (örneğin, sürüm 2.5.1.0) ve MaxDIA iş akışını^20,29 kullandı. Aramalar, PSM/peptit ve protein seviyelerinde %1 FDR ile ters sıralı bir tuzak stratejisi kullandı; "Ters" ve "Potansiyel kirletici" girişleri biyoinformatikten önce filtrelenmiştir. Hiçbir çivi kullanılmadı; cihazın hazır olduğu, dahili ID ve RT-stabilite kriterlerini karşılayan 250 ng HeLa sindirimi (ve aralıklı 10 fmol 6-protein karışımı) ile doğrulandı.
   1. Ham DIA-MS verilerini tüm örneklerde tutarlı parametrelerle analiz edin. En fazla iki kaçırılan bölünmeyi dahil edin ve değişiklikleri aşağıdaki gibi ayarlayın: sisteinin sabit, karbamidometilasyonu; değişken, metiyoninin oksidasyonu ve protein N-terminalinin asetilasyonu.
   2. UniProt insan protein veritabanına (örneğin, ~20.000 giriş) dayalı in silico-tahmin edilmiş bir spektral kitaplık kullanın ve doğru yanlış keşif oranı (FDR) tahmini için tuzak ve kirletici dizilerinin dahil edildiğinden emin olun. Alternatif bir enzim kullanılmadığı sürece triptik sindirimi belirtin. Doğrulanmış bir insan spektral kitaplığı (18.06.2020 UniProt sürümüne, 20.956 girişe göre) Max Planck Biyokimya Enstitüsü deposu^30'dan edinilebilir.
      NOT: Tahmin edilen kitaplıklara sahip bu iş akışına bir alternatif olarak, adım 3.4, bu veri kümelerinde karşılaştırılabilir tanımlama ve niceleme üreten kitaplıksız işlemeyi gösterir.
   3. Protein bolluklarını yoğunluk değerlerini (etiketsiz niceleme [LFQ] yoğunlukları değil) kullanarak ölçün, çünkü bunlar aşağı akış ÜFE ağ analizleri için daha uygundur. Benzeşim zenginleştirme verilerini bozabilecek normalleştirme yapıtlarını önlemek için LFQ'nun seçiminin kaldırıldığından emin olun. Bunun yerine, global protein ekspresyonundan ziyade etkileşim gücünü yansıtan peptit spektral eşleşmelerinden türetilen ham yoğunluk değerlerini kullanın. Protein tanımlama ve miktar tayininin güvenilirliğini artırmak için uygun filtreleme kriterlerini (örneğin, protein grubu başına en az bir benzersiz peptit) uygulayın. Sonraki istatistiksel ve ağ tabanlı analizler için elde edilen protein yoğunluğu tablosunu dışa aktarın.
      NOT: LFQ değerlerinin tüm lizatlar arasında protein yüklemesi için normalleşmeye yardımcı olduğu standart proteomik iş akışlarının aksine, burada proteinler epipaparomların afinite yakalaması yoluyla zenginleştirilir. Bu zenginleştirme adımı, LFQ normalizasyonunun gizleyebileceği biyolojik varyansı ortaya çıkarır. Bu nedenle, koşullar arasında diferansiyel protein-epikaperom etkileşimlerini daha iyi yansıttıkları ve aşağı akış ağ düzeyinde (örneğin, dfPPI) analiz için gereken sinyali korudukları için ham yoğunluk değerleri tercih edilir. Maskot tabanlı aramaların^16,18 kullanıldığı önceki çalışmalarda, yoğunluklar yerine MS/MS spektral sayım değerleri de kullanılmıştır. Bunun gibi afinite yakalama iş akışlarında, spektral sayımlar etkileşim sıklığını yansıtır ve koşullar arasında diferansiyel olarak etkileşime giren proteinleri tanımlamak için çok uygundur. LFQ değerlerinden farklı olarak, MS/MS sayımları, epichaperom zenginleştirme adımından biyolojik olarak anlamlı varyansı koruyarak, proteom boyunca küresel normalleşmeyi varsaymaz.

3. Boncuk üzerinde protein sindirimi ile LC-MS/MS ile Protein Tanımlaması

1. Boncuk üzerinde sindirim
   NOT: MS analizi için boncuk üzerinde protein sindirimi sırasında optimum protein geri kazanımını sağlamak ve numune kaybını en aza indirmek için, düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerinin kullanılması esastır. Bu tüpler, tüp duvarlarına protein emilimini azaltmak ve böylece numune geri kazanımını artırmak için tasarlanmıştır. Bu bölümde kullanılan tüm reaktifler, LC-MS sınıfı su ve kimyasallar kullanılarak taze olarak hazırlanmalıdır. Numuneleri bir proteomik çekirdeğe gönderiyorsanız, bazı tesisler kullanımdan önce tüm tamponların filtreyle sterilize edilmesini gerektirebileceğinden yerel politikaları kontrol edin.
   1. Adım 1.4.6'dan itibaren tüpte kalabilecek PBS kalıntılarını çıkarın. Boncukları, 50 mM ABC, pH 8.5'te taze hazırlanmış 80 μL 2 M üre içinde yeniden süspanse edin. Pipetleme veya kısa vorteksleme yoluyla tam karıştırma sağlayın.
      NOT: Hacmi boncuk miktarına ve türüne göre orantılı olarak ayarlayın. Bu protokol, 40 μL PU boncuk bulamacı için optimize edilmiştir.
   2. 1 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için DTT ekleyin.
      NOT: DTT çözeltide oksidasyona eğilimli olduğundan, kullanmadan hemen önce LC-MS sınıfı suda 1 M DTT stok çözeltisinden 10 mM DTT çözeltisinden taze bir 1 mM DTT çözeltisi hazırlayın. Gerekli hacmi doğrudan numuneye ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın.
   3. Tüpün kapağını kapatın ve ısıtılmış bir yörünge çalkalayıcıda 1.100 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Buharlaşmayı en aza indirmek için kapakları sıkıca kapatın.
   4. 3.67 mM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için IAA ekleyin. RT'de karanlıkta 45 dakika boyunca 1.100 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
      NOT: Kullanmadan hemen önce LC-MS sınıfı suda taze bir 10 mM IAA stoğu hazırlayın. Numuneye gerekli hacmi ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın.
   5. Reaksiyona girmemiş IAA'yı söndürmek için ilave DTT ekleyin ve 3.67 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Pipetleyerek hafifçe karıştırın.
      NOT: Reaksiyona girmemiş IAA'nın söndürülmesi, proteaz aktivitesini ve sindirim verimliliğini tehlikeye atabilecek aşırı alkilasyonu önler. DTT'yi taze hazırlayın ve hedef konsantrasyona ulaşmak için mevcut numune hacmine göre hacmi hesaplayın.
   6. Numuneye 750 ng 0.5 mg/mL MS dereceli Lys-C proteaz ekleyin. 1.150 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Lys-C'yi LC-MS sınıfı suda çözerek hazırlayın. Enzim alikotlarını -80 °C'de saklayın ve çoklu donma-çözülmelerden kaçının.
   7. Taze hazırlanmış 750 ng 0.5 mg/mL dizileme dereceli tripsin ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de 1.150 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Aşırı sindirimi ve peptit bozulmasını önlemek için 16-18 saatten fazla inkübe etmeyin.
   8. Ertesi gün, numuneyi RT'de 1-5 dakika boyunca 1.000-5.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek aktarın. Boncukları atın.
   9. Damla damla %50 trifloroasetik asit (TFA) ekleyerek sindirimin pH'ını 3'ün altına ayarlayın. pH gösterge şeritlerini kullanarak pH'ı doğrulayın.
      NOT: Tipik pH aralığı ~2.5-3.0 olmalıdır ve numuneler tuzdan arındırılmadan önce asitleştirilmelidir.
      DİKKAT: TFA aşındırıcı ve uçucudur. Çeker ocak ekleyin ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin.
2. Peptit tuzdan arındırma
   NOT: Peptit tuzdan arındırma ve temizleme için küçük ölçekli C18 paketli pipet uçları (yani StageTips) kullanın³¹. Üç kat C18 malzemesini (örneğin, C18 katı faz ekstraksiyon diskleri) 200 μL'lik bir pipet ucuna paketleyerek C18 StageTips'i hazırlayın. Önceden hazırlanmış, piyasada bulunan C18 döndürme kolonları da kullanılabilir. Koşullandırma, numune yükleme ve peptit elüsyonu için üreticinin protokolünü izleyin. Performans (örneğin, elde tutma verimliliği, geri kazanım verimi) ev yapımı ve ticari cihazlar arasında değişiklik gösterebilir. Küçük ölçekli C18 paketli pipet uçları, baypas akışını önlemek için sıkıca paketlenmelidir.
   1. Küçük ölçekli C18 paketli pipet uçlarını sırayla aşağıdakilerle koşullandırın: (1) 100 μL metanol. 400 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın; (2) 100 μL %70 ACN/%0.1 TFA. 400 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın; (3) 100 μL %0,1 TFA. 400 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
      NOT: Şartlandırma, hidrofobik C18 reçinesinin tamamen ıslanmasını sağlar. Önceden hazırlanmış, ticari olarak temin edilebilen C18 döndürme kolonları için vakum manifoldları da kullanılabilir. Kullanıcılar özel kullanım önerileri için üreticinin talimatlarına başvurmalıdır.
   2. Numuneyi doğrudan uca yavaşça pipetleyerek asitlendirilmiş peptit sindirimini şartlandırılmış küçük ölçekli C18 paketli pipet uçlarına yükleyin. Sindirimin reçineden geçmesine izin vermek için 300 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın. Numune hacmi kapasiteyi aşarsa, birden fazla tur halinde yükleyin.
      NOT: Digest'i doğrudan paketlenmiş reçine yatağına pipetleyin, hava kabarcıklarından kaçının. Düşük tutma uçları kullanıyorsanız, sıvıyı yavaş ve eşit bir şekilde serbest bırakmak için küçük ölçekli C18 dolgulu pipet uçlarının iç duvarına dokunun.
   3. 100 μL %0,1 FA'yı doğrudan küçük ölçekli C18 paketli pipet ucuna pipetleyin ve çözeltinin C18 malzemesini tamamen doyurmasını sağlayın. 400 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın. Tuzları ve enterferans yapan maddeleri çıkarmak için bu adımı iki kez tekrarlayın.
      NOT: Her sıkmadan önce sıvının C18 malzemesinden tamamen aktığından emin olun. Yıkama solüsyonunu pipet ucunun duvarından aşağı yavaşça dağıtarak hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyin.
   4. Küçük ölçekli C18 paketli pipet ucuna 50 μL %70 ACN/%0,1 FA pipetleyerek bağlı peptitleri ayrıştırın. 300 × g'da santrifüjleyin ve elüatı temiz, düşük bağlamalı bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Tam elüsyon sağlamak için bu adımı iki kez tekrarlayın.
      NOT: Elüatı tamamen geri kazanmak için birden fazla santrifüj turu gerekebilir. Uç tabanında kalan sıvı kalırsa, küçük ölçekli C18 paketli pipet ucuna hafifçe vurun veya kalan hacmi toplamak için kısa süreli ek dönüşler yapın. Devam etmeden önce elüatları birleştirin ve son hacmi kontrol edin.
   5. Ayrıştırılan peptitleri kuruyana kadar bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak dondurun ve kurutun. Havalandırmaya izin vermek için kapağın gevşek bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun, ancak sıçramasını önleyin.
   6. Doğrudan tüpün dibine LC-MS dereceli su içinde 12 μL %0.1 FA ekleyerek kurutulmuş peptitleri sulandırın. Peptitleri tamamen çözmek için tüpleri nazikçe vorteksleyin ve sonikleştirin.
      NOT: Tüm pelet veya kurutulmuş filmin tamamen sulandırıldığından emin olun. Pipet bazlı çözünme, uç yüzeylerine yapışma nedeniyle peptit kaybı riski taşır.
   7. Tam çözünmeyi sağlamak ve aşırı ısınmayı önlemek için sulandırılmış peptitleri soğuk suyla dolu bir banyo sonikotöründe 5 dakika boyunca sonikasyon yapın.
   8. Peptitleri 20.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Peptit süpernatanını LC-MS sistemine yüklemek için uygun bir otomatik örnekleyici şişesine aktarın. Numune kaybını en aza indirmek için bağlı silikon/politetrafloroetilen (PTFE) septum kapaklarına sahip düşük hacimli, yüksek kaliteli, gaz kromatografisi (GC) testinden geçirilmiş polipropilen şişeler kullanın. Şişeleri numune kimliği ve enjeksiyon sırası ile net bir şekilde etiketleyin.
   9. 280 nm'de bir spektrofotometre kullanarak peptit konsantrasyonunu tahmin edin. Bunun yaklaşık olduğunu ve aromatik kalıntı içeriğinden veya kirleticilerden etkilenebileceğini unutmayın. Alternatif olarak, daha doğru miktar tayini için kolorimetrik peptit tahlillerini kullanın.
3. LC ve MS parametreleri
   NOT: Aşağıdaki LC ve MS parametreleri, mevcut protokolde kullanılan kütle spektrometresi ile birleştirilmiş nano-LC sistemi için optimize edilmiştir. Diğer nano-LC sistemleri ve kütle spektrometreleri için parametreler buna göre ayarlanmalıdır.
   1. LC-MS uyumluluğunu sağlamak ve kontaminasyonu en aza indirmek için mobil fazları haftalık olarak hazırlayın: (1) Mobil Faz A: 1 L LC-MS sınıfı suya 1 mL LC-MS sınıfı FA ekleyin ve (2) Mobil Faz B: 1 L LC-MS sınıfı ACN'ye 1 mL LC-MS sınıfı FA ekleyin.
      NOT: Yalnızca LC-MS sınıfı çözücüler ve asit kullanın. Her iki fazı da temiz cam şişelerde hazırlayın ve LC sistemi gerektiriyorsa gazdan arındırın. Mikrobiyal büyümeyi veya bozulmayı önlemek için kullanılmayan fazları haftalık olarak atın.
   2. 1,7 μm C18 ters fazlı parçacıklarla dolu 25 cm uzunluğunda, 75 μm iç çaplı erimiş silika kılcal kolon takın.
      NOT: Hava kabarcıklarının oluşmasını veya ambalaj malzemesine zarar vermemesi için kolonları dikkatli tutun. Kurulum ve kolon dengeleme için üreticinin talimatlarını izleyin.
   3. %3 Mobil Faz B kullanarak akış hızını kademeli olarak 50 nL/dk'dan 300 nL/dk'ya yükselterek kolonu koşullandırın.
      NOT: Bu adım, numune enjeksiyonundan önce sabit fazın uygun şekilde ıslatılmasını ve dengelenmesini sağlar. Akış hızı artışı sırasında kolon basıncını izleyin. Ani basınç artışları hava kabarcıklarının veya kolon tıkanıklığının göstergesi olabilir. Temel basınç dengelendiğinde dengeleme tamamlanmış sayılabilir.
   4. Optimum kromatografik performans sağlamak için kolon sıcaklığını 50 °C'de tutun.
   5. Sistem performansını değerlendirmek için kalite kontrol (QC) standardı olarak 100 ng HeLa hücre triptik sindirimi enjekte edin.
      NOT: Bu QC enjeksiyonu, LC tutma süresi tutarlılığını, MS duyarlılığını ve çalışmalar boyunca proteom kapsamını değerlendirmek için bir kıyaslama görevi görür. Deneysel numuneleri analiz etmeden önce sistemin hazır olduğunu doğrulamak için protein tanımlama sayılarını, alıkonma süresi tekrarlanabilirliğini ve sinyal yoğunluğunu bir referans QC veri kümesiyle karşılaştırın. Deneyler arasında tekrarlanabilirlik için bilinen konsantrasyonlarda hazırlanan ticari HeLa özet standartlarını kullanın.
   6. 300 nL/dak akış hızında 90 dakika boyunca %2'den %35'e mobil faz B'den %2'ye bir gradyan elüsyon kullanın. 90 dakikalık gradyan, karmaşık proteomlar için uygun yüksek çözünürlüklü peptit ayrımı sağlar. Eğimi takiben, kolonu yıkamak için 7 dakika boyunca %95 Mobil Faz B'de tutun.
      NOT: Çalışmalar arasında kolon tekrarlanabilirliğini sağlamak için bir sonraki enjeksiyondan önce bir yeniden dengeleme adımı (örneğin, 10-15 dakika boyunca %2 B'ye dönüş) ekleyin. Tutma süresi stabilitesini ve tepe şeklini etkileyebilecek ani gradyan değişikliklerinden kaçının.
   7. Nanoflow uyumlu bir elektrosprey iyonizasyon kaynağı (örneğin, CaptiveSpray tarzı) ile donatılmış bir kütle spektrometresi kullanarak MS analizi yapın.
      NOT: CaptiveSpray iyon kaynağı, düşük nanoakış hızlarında kararlı elektrosprey sağlayarak iyonizasyon verimliliğini ve hassasiyetini artırır. Alternatif kütle spektrometreleri kullanan laboratuvarlar için, edinim ve iyonizasyon parametrelerini buna göre ayarlayın. Doğruluğu ve çözünürlüğü korumak için analizden önce uygun ayarlama ve kalibrasyonu sağlayın. Sprey yayıcıyı doğru şekilde konumlandırın ve sinyal kesintilerini önlemek için çalışma sırasında sprey stabilitesini izleyin.
   8. Veriden bağımsız bir edinim diaPASEF yöntemi^{kullanın 32}. diaPASEF'e aşina olmayan kullanıcılar için, farklı numune türleri veya gradyan uzunlukları için optimize etmek üzere üreticinin teknik belgelerine veya kapana kısılmış iyon hareketlilik spektrometrisi (TIMS)-DIA iş akışlarını³³ açıklayan son protokollere bakın.
      NOT: diaPASEF, hareketlilik boyutu^34'te öncü ve fragman iyonlarını hizalayarak dizileme hızını ve hassasiyetini artırmak için TIMS'i DIA ile birleştirir. İyon hareketliliğinin ve kütle pencerelerinin yanlış hizalanmasını önlemek için TIMS cihazının uygun şekilde kalibre edildiğinden ve dört kutuplu ile senkronize edildiğinden emin olun.
   9. Aşağıdaki cihaz ayarlarını kullanın: (1) Kütle aralığı: 100 - 1700 m/z; (2) İyon hareketlilik aralığı: 0,60-1,60 V·s/cm²; (3) Çarpışma enerjisi: 20-59 eV, rampalı; (4) Rampa süresi: 100 ms; (5) Biriktirme süresi: 100 ms; (6) diaPASAF için kütle aralığı: 400-1201 Da; (7) Kütle pencere genişliği: 1 Da örtüşme ile 26 Da; (8) Döngü başına kütle adımı sayısı: 32; (9) Çevrim süresi: ~1,8 sn
      NOT: Bu ayarlar, kapsama derinliğini ve tarama hızını dengelemek için optimize edilmiştir. Örnek karmaşıklığına, gradyan uzunluğuna ve LC-MS sistem performansına bağlı olarak küçük ayarlamalar (örneğin, pencere genişliği veya adım sayısı) gerekebilir. HeLa sindirimi için 7.500'den fazla proteinin tanımlanması, optimum sistem performansını gösterir. Tanımlama sayısı cihaza göre değişebilir ve buna göre değerlendirilmelidir.
   10. Analitik kolonun aşırı yüklenmesini önlemek için enjeksiyon başına 300-400 ng peptit numunesi yükleyin. Aşırı yükleme, tepe noktasının genişlemesine, iyonun bastırılmasına ve tekrarlanabilirliğin azalmasına neden olabilir. Çalışmalar arasında değişkenliği önlemek için enjeksiyondan önce bir spektrofotometre veya kolorimetrik peptit tahlili kullanarak peptit konsantrasyonunu doğrulayın.
   11. Taşınmayı önlemek için numune grupları arasında boş enjeksiyonlar yapın. Enjeksiyon boşluğu olarak %100 mobil faz A (%0,1 FA'lı su) kullanın. Bu, artık peptitleri kolondan temizler ve çalışmalar arasındaki kontaminasyonu azaltır. Yeterli temizliği doğrulamak için taban çizgisi ve arka plan iyonlarını izleyin.
4. DIA veri analizi
   1. directDIA iş akışını³⁵ kullanarak veri analizini ve DIA proteomik verilerinin kitaplıksız işlenmesini destekleyen uygun bir yazılım kullanın. Standart arama parametreleri ve varsayılan niceleme ayarları ile bir UniProt FASTA veritabanı^36'ya dayalı olarak protein tanımlama ve miktar tayini gerçekleştirin.
      NOT: Enzim özgüllüğü, modifikasyon ayarları, FDR eşikleri ve analiz sonrası çıktılar dahil olmak üzere tüm parametreler Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Benzer iş akışlarını ve çıktıları destekliyorlarsa DIA-NN³⁷ gibi alternatif DIA analiz platformları da kullanılabilir.
   2. Öncül, peptit ve protein grubu seviyelerinde %1 FDR'ye karşılık gelen q değeri eşikleriyle kitaplıksız directDIA çalıştırın; Aşağı akış analizinden önce tuzak tanımlamalarını hariç tutun.
      NOT: Hiçbir iRT standardı eklenmemiştir; performans, önceden tanımlanmış tanımlama ve saklama süresi kararlılık kriterlerine göre HeLa özet çalışmalarıyla karşılaştırıldı.

Sonuçlar

Protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesinin ardından kullanıcılar, aşağı yöndeki dfPPI analizine uygun yüksek kaliteli etkileşim veri kümeleri elde etmelidir. Protein tanımlaması, %1 FDR'de (PSM ve protein seviyeleri) DIA verilerinden gerçekleştirilir ve niceleme, ham yoğunlukları veya MS/MS spektral sayımlarını (LFQ değil) kullanır. Beklenen QC imzaları şunları içerir: PCA tarafından teknik kopyaların sıkı bir şekilde kümelenmesi, yaklaşık %10-12'lik medyan öncü/protein CV'leri, çoğaltmak yerine biyolojik köken tarafından yönlendirilen hiyerarşik kümeleme ve g:Profiler/Reactome'da sağlam yol düzeyinde zenginleştirme.

Kullanımdan önce PU boncuklu prob üretimi ve aktivite doğrulaması

PU-boncuklar, daha önce tarif edildiği gibi, bir epikaperom bağlayıcı küçük molekül analoğunun NHS ile aktive olan agaroza bağlanmasıyla hazırlanır²⁵. Standart bir 25 mL reçine paketi, izopropanol içinde 1:1 bulamaç olarak depolanan ~25 mL PU boncuk verir. Düşük bağlı tüplere ayırın ve -20 °C'de ışıktan koruyarak saklayın (örneğin, alüminyum folyoya sarın). Bu koşullar altında, bir parti ≥12 ay boyunca sabit kalır. Kullanmadan önce izopropanolü çıkarın ve boncukları doğal bağlanma tamponunda dengeleyin (adım 1.3). Her parti sentezde ve daha sonra periyodik olarak iki tahlil kullanılarak nitelendirilir (Şekil 2): (i) Biyolojik özgüllük-aynı koşullar altında bir epikaperom yüksek lizattan (örneğin, MDA-MB-468) ve bir epikaperom düşük lizattan (örneğin, ASPC1) eşleşen aşağı çekmeler gerçekleştirir (250 μg toplam protein içeren 40 μL boncuk bulamacı; 4 ° C'de 3 saat; doğal yıkamalar), elüt/denatüre ve HSP90 için immünoblot, HSC70 ve HOP. Kabul: düşük numunede minimum sinyal ile epikaperom-yüksek numunede güçlü zenginleştirme; Bir referans lotla karşılaştırılabilir bant yoğunluğu oranları (%±20-30). (ii) Eşleştirilmiş inert kontrol boncuklarına karşı PU boncuklu epikaperom yüksek lizattan küresel kargo profili tarafından çalıştırılan paralel yakalamalar, SDS-PAGE üzerinde eşit elüat hacimleri yükleyin ve Coomassie-stain. Kabul: PU boncuklar, kontrol boncuk şeridinde minimum arka plana sahip zengin, yüksek moleküler ağırlıklı bir kargoyu gösterir. 25 mL'lik bir parti, numune başına 40 μL'de ~600 yakalamayı destekler; Özgüllük veya kargo profili, yeniden yıkama/yeniden dengeleme sonrasında kabulün dışında kalırsa çok fazla emekliye ayırın.

Jel içi ve boncuk üstü protokollerin temsili sonuçları

Epikaperom açısından yüksek MDA-MB-468 hücreleri üzerinde yapılan bir pilot kafa kafaya karşılaştırmada, jel içi ve boncuk içi iş akışları oldukça uyumlu interaktomlar üretti: 6.333 proteinin 4.616'sı (%73) protein grubu düzeyinde paylaşıldı, 1.275'i (%20) sadece jel içi ve 442'si (%7) sadece boncuk üstü tarafından tespit edildi. Yol düzeyinde uyum daha da yüksekti: 860 Reactome terimi arasında 727'si (%85) yaygındı, 81'i (%9) jel içi ve 52'si (%6) boncuk içi terimi benzersizdi. Medyan protein yoğunlukları, jel elüsyon konsantrasyonu ile tutarlı olarak, jel içi için boncuk üzerine göre ~×3 daha yüksekti, ancak bu, yol uyumunu önemli ölçüde etkilemedi.

Kohort ölçeğinde örnek ve QC imzaları

Örnek olarak, on iki biyolojik örneği analiz ettik (Şekil 3). Dört numune ayrıştırıldı ve jel içi sindirim ile işlendi; sekiz numuneye epikaperom komplekslerinin afinite saflaştırması uygulandı, ardından boncuk üzerinde sindirim ve teknik kopya halinde nano-LC-MS/MS uygulandı. Beklenen QC imzaları gözlemlendi: teknik kopyaların PCA tarafından sıkı bir şekilde kümelenmesi, ~%10-12'lik medyan öncü/protein CV'leri, çoğaltmak yerine biyolojik kökene göre yönlendirilen hiyerarşik kümeleme ve g:Profiler/Reactome üzerinde sağlam yol düzeyinde zenginleştirme. Bu sonuçlar, iş akışı bileşenleri arasında tekrarlanabilirliği, epikaperomla ilgili proteinlerin geniş tespitini ve yol düzeyinde diferansiyel etkileşimcilerin net fonksiyonel yorumlanabilirliğini göstermektedir. Her iki iş akışından elde edilen yol zenginleştirmeleri, bu hat için yayınlanmış dfPPI çıktılarımızla eşleşti ve birkaç biyokimyasal ve fonksiyonel ortogonal tahlil¹⁷ ile doğrulandı.

Girdi malzemesinin kalitesi ve sindirim

Jel içi sindirim ile işlenen numunelerin dördü için temsili bir Coomassie boyalı SDS-PAGE jeli gösterilmiştir (Şekil 3A). Jel, tekrarlanabilir protein yakalamayı ve şeritler boyunca bantlamanın tutarlı dağılımını göstererek, kütle spektrometrisinden önce doğal lizatlardan protein komplekslerinin başarılı bir şekilde zenginleştirildiğini doğrular. Bu denatüre interaktom profilleri, afinite yakalama adımının, aşağı akış MS analizi için yeterli ve tutarlı protein girdisi sağladığını göstermektedir.

Yakalanan interaktomlar, moleküler ağırlıklar boyunca geniş protein kapsamı gösterir ve bu, protein düzeneklerinin doğal lizatlardan başarılı bir şekilde zenginleştirilmesini yansıtır. Kritik olarak, bu geri kazanım bol miktarda proteinle sınırlı değildir, aynı zamanda sistem düzeyinde analiz için gereken karmaşıklığı ve derinliği sağlayan daha düşük bolluktaki etkileşimleri de içerir.

Geniş ölçekte kontroller ve özgüllük

Bu iş akışında, kontrol boncuklarını yalnızca ön temizleme için kullanırız (bkz. adım 1.3 ve 1.4); Her bir biyonumune üzerinde rutin "inert-prob" karşılaştırmalı yakalamalar yapmıyoruz. Büyük klinik kohortlar için, inert yakalamalar değerli materyal tüketir, ancak dfPPI için çok az yorumlayıcı değer katar çünkü aşağı akış istatistikleri herhangi bir tek protein düzeyinde değil, ağ/yol düzeyinde çalışır. Rastgele veya reçine yapışkan kirleticiler, aynı yolun üyeleri arasında koordineli bir şekilde görünmez ve bu nedenle yol düzeyinde zenginleştirme testlerinden veya kohort düzeyinde tutarlılık filtrelerinden sağ çıkamaz. Uygulamada, özgüllük (i) ön temizleme, (ii) sıkı kopya tekrarlanabilirliği (PCA/CV) ve (iii) eşikler ve yeniden örnekleme boyunca yol stabilitesi ile sağlanır. Tarihsel olarak, inert yakalama ve çözünür rakip (PU-H71) blok deneylerini değerlendirdik ve yeri doldurulamaz klinik materyal tüketirken dfPPI yolu sonuçlarını 16,17,21 değiştirmediklerini bulduk; bu nedenle, bunları yalnızca pilot doğrulaması için ayırıyoruz. Açık çalışma düzeyi denetimlerini tercih eden gruplar için, her iki seçeneğin de protokolle uyumlu olduğunu ancak kohort ölçeğinde dfPPI analizleri için gerekli olmadığını not ediyoruz.

Numarayı çoğalt

dfPPI'daki yol çıkarımı küme tabanlıdır ve sabit bir kopya numarası gerektirmez. Sağlam edinimlerle, koşul başına tek bir örnek, keşif yolu çağrıları sağlayabilir. Doğrulayıcı analizler için, kültürlenmiş hücreler için koşul başına ≥3 biyolojik kopya (mümkün olduğunda çift LC-MS/MS enjeksiyonları ile) ve insan dokusu için kohort uygun N'ler (keşif için grup başına tipik olarak ≥5-10, ortak değişkenlere göre tabakalandırılırsa daha büyük) öneriyoruz. Kümelemeyi (PCA), medyan öncü CV'yi (hedef ~%10-15) ve zenginleştirme sonuçlarının önyüklemesini/yeniden örneklemesini çoğaltarak kararlılığı değerlendiriyoruz.

Çalışmalar arasında teknik tekrarlanabilirlik

Teknik tekrarlanabilirlik, boncuk üzerinde sindirilmiş numunelerden (sekiz murin beyni, iki kopya halinde çalıştırılan) peptit yoğunluğu verilerinin temel bileşen analizi (PCA) (Şekil 3B) kullanılarak değerlendirildi. Kopyalar, her biyolojik numune için sıkı bir şekilde kümelenirken, farklı numuneler ilk iki ana bileşen boyunca temiz bir şekilde ayrıldı. İlk iki ana bileşen, toplam varyansın sırasıyla %28.6 ve %22.0'ını açıkladı ve numuneleri teknik gürültüden ziyade biyolojik farklılıklara göre dağıttı. Bu yapı, yüksek analitik tutarlılığı yansıtır ve yöntemin, dfPPI'nin duruma özgü ağ yeniden kablolamasını tespit etmesini sağlamak için kritik olan biyolojik olarak ilgili farklılıkları koruduğunu doğrular.

Numuneler arasında algılama tutarlılığı

Öncü iyon yoğunlukları için varyasyon katsayısı (CV) dağılımları, özelliklerin büyük çoğunluğunun %20 CV'nin altına düştüğünü ve medyan değerlerin koşullar arasında %9.7 ila %11.9 arasında değiştiğini göstermektedir (Şekil 3C). Bu sonuçlar, replikalar arasında tutarlı MS tespitini ve peptit geri kazanımını doğrular.

Dinamik aralık ve proteom kapsamı

Log-dönüştürülmüş protein bolluğu değerlerinin hiyerarşik kümelenmesi (Şekil 3D), MS çalışmalarında yakalanan geniş dinamik aralığı yansıtırken, numunelerin güçlü bir şekilde ayrıldığını ve numuneler arası varyasyonun korunduğunu gösterdi. Protein yoğunlukları, maviden sarıya gradyan ile görselleştirildiği gibi, düşük bolluktaki etkileşimcilerden yüksek oranda zenginleştirilmiş protein gruplarına kadar uzanıyordu. Veriler, protokolün hem çekirdek hem de periferik bileşenleri yakalayarak çeşitli protein düzeneklerinin ve etkileşimlerinin saptanmasını sağladığını doğrulamaktadır.

dfPPI aracılığıyla fonksiyonel yorumlama

Yorumlamayı ve tekrarlanabilirliği desteklemek için, dfPPI veri kümesi analizleri için iki tamamlayıcı kaynak sağlıyoruz: (i) etkileşimli bir Shiny web uygulaması (https://epichaperomics.mskcc.org/ https://dfppi.mskcc.org'e güncellendi) ve (ii) önceki dfPPI çalışmaları (GitHub / Zenodo) ile yayınlanan açık, komut dosyası yazılabilir iş akışları ve Cytoscape oturum dosyaları38,39,40,41. Uygulama, ham yoğunluk veya MS/MS spektral sayım tablolarını alır, kalite kontrolü gerçekleştirir (kümelemeyi çoğaltma, eksik değer kontrolleri), isteğe bağlı gürültü/toplu işleme (ortak değişken regresyonu), diferansiyel olarak meşgul proteinleri tanımlar ve etkileşimli grafikler ve indirilebilir raporlar aracılığıyla yol/ağ okumaları sunar - kodlama gerektirmeden.

dfPPI, ölçülen yoğunlukları veya spektral sayıları "epikaperom etkileşimi" için vekiller olarak ele alır. Kullanıcılar, basit bir iki kuyruklu t-testinden (varsayılan) ortak değişkene duyarlı doğrusal modellere kadar değişen bir diferansiyel bağlantı (DC) modeli seçer; DC adımı da atlanabilir. DC sonrası, kullanıcılar adayları zenginleştirmeye geçirmek için katlama değişimi ve p değeri eşiklerini ayarlar (varsayılanlar önceki dfPPI çalışmasını yansıtır; örneğin, FC > 1.0, nominal p ≤ 0.25). İki zenginleştirme motoru mevcuttur: sıralamaya dayalı GSEA (imzalı istatistikler üzerinde) ve çoklu test düzeltmesi ile g:Profiler aracılığıyla aşırı temsil (hipergeometrik). Şaperon merkezli bir bağlam için, boru hattı ayrıca, şaperon iskele proteinlerinin doğrudan etkileşimcilerinin diferansiyel olarak angaje proteinler arasında aşırı temsil edilip edilmediğini test etmek için İnteraktom Zenginleştirme Analizi (iEA) sağlar. Ağ, ağırlık düğümlerini/kenarlarını etki büyüklüğüne ve/veya istatistiksel desteğe göre görüntüleyerek, tek protein etkileri yerine koordineli yeniden kablolamanın görselleştirilmesini sağlar. Komut dosyası iş akışlarını tercih eden kullanıcılar için, ağ haritaları ve şekilleri oluşturmak için kullanılan temel R kodu ve Cytoscape oturum dosyaları kamuya açıktır (örneğin, GitHub / Zenodo) 38,39,40,41 ve ilgili yayınlar 17,18,19,20 ve yerel olarak çalıştırılabilir veya yeni veri kümeleri için uyarlanabilir.

Afinite zenginleştirmesi tarafından sunulan etkileşim durumu sinyallerini korumak için izin verilen bir kesme (katlama değişimi > 1.0; nominal p ≤ 0.25) önerilir. Daha sonra istatistiksel kontrolü yol düzeyine kaydırıyoruz: aday proteinler, g:Profiler kullanılarak küratörlüğünde ontolojiler (örneğin, GO, Reactome) arasında zenginleştirme için test edilir ve çoklu teste göre ayarlanmış yol p değerleri, anlamlılığı ve sıralamayı belirler. Bu tasarım, dfPPI'nin hedefini yansıtır - tek protein diferansiyel ifadesini değil, koordineli ağ yeniden kablolamasını tespit etmek - ve açılır veri kümelerinde zenginleştirme sinyallerini gizleyebilecek proteom çapında normalleştirmeyi önler. Önceki dfPPI çalışmalarında^17,20 gösterildiği gibi, daha yumuşak protein seviyesi eşikleri kararlı, hastalıkla ilgili yol çağrıları verirken, diğer modeller (örneğin, ampirik Bayes büzülmesine sahip doğrusal modeller), varyans veya toplu ortak değişkenler bunu gerektirdiğinde, çekirdek yol merkezli çıkarımı değiştirmeden kullanılabilir.

Afinite yakalama kaçınılmaz olarak "yapışkan" proteinleri (örneğin, keratinler, hücre iskeleti proteinleri, ribozomal proteinler) birlikte zenginleştirir ve PU-boncuklar ayrıca genel şaperon etkileşimcilerini de yakalayabilir. dfPPI'da bunlar çeşitli nedenlerden dolayı biyolojiyi yönlendirmez. İlk olarak, ön temizleme ve sıkı yıkamalar, spesifik olmayan bağlayıcıların çoğunu giderir. İkincisi, birçok şaperon etkileşimcisi de dahil olmak üzere jenerik bağlayıcılar, koşullar ve/veya tutarsız algılama arasında 1.0'a yakın kat değişiklikleri gösterir ve bu nedenle FC/p-değeri taramalarında başarısız olur. Üçüncüsü, yol zenginleştirmesi kümeye dayalıdır ve arka plana duyarlıdır: önem, deneye özgü tespit edilen proteoma karşı hesaplanır ve aynı yolun birden fazla üyesinin birlikte değişmesini gerektirir. Rastgele veya yüksek bolluktaki kirleticiler birçok terime dağılır ve bu nedenle tutarlı, FDR açısından önemli zenginleştirmeler oluşturmazlar. Tek bir protein kirleticisi veya başka türlü - bir yol çağrısı "yapamaz". Dördüncüsü, dfPPI, tek proteinleri değil, ağ düzeyinde tutarlılığı yorumlar; yol çağrıları, çoklu test düzeltmesinden (örneğin, g:Profiler ayarlı p değerleri), minimum gen seti boyutlarından ve çoğaltma tutarlılığından sağ çıkmalıdır. Eşleştirilmiş inert boncuk ön temizlemeleri ve ortak kirletici filtreleme ile birlikte bu çerçeve, dfPPI'yi arka plana karşı sağlam kılar: yüzlerce bilgilendirici olmayan protein mevcut olsa bile, bunlar yol sıralamalarını değiştirmezler çünkü zenginleştirme, protein listesinin toplam uzunluğuna değil, bir yol içindeki uyumlu proteinlerin sayısına bağlıdır. Ayrıca, bugüne kadar yayınlanan her dfPPI çalışması, kapsamlı deneysel doğrulama (örneğin, hedeflenen biyokimya, sinyal okumaları, genetik veya farmakolojik bozulmalar) 16,17,18,19,20 ile yol ve ağ düzeyindeki tahminleri desteklemiştir ve dfPPI çıktılarının sadece gürültülü protein listeleri değil, hastalıkla ilgili PPI ağ işlev bozukluğunun tekrarlanabilir haritaları olduğunu göstermektedir.

Şekil 3D'den dfPPI veri kümesi tarafından yakalanan işlevsel manzarayı değerlendirmek için g:Profiler⁴² (Şekil 3E) kullanarak zenginleştirme analizi gerçekleştirdik. Sonuçlar, Gen Ontolojisi biyolojik süreci (GO-BP), moleküler fonksiyon (GO-MF) ve hücresel bileşen (GO-CC) dahil olmak üzere tüm önemli fonksiyonel ontolojilerin yanı sıra Reactome, KEGG ve WikiPathways gibi küratörlü yol kaynakları dahil olmak üzere sağlam açıklama kapsamını göstermektedir. Bu temsili analiz, dfPPI yaklaşımının önemli bir gücünü göstermektedir: nispeten küçük örneklem boyutlarından bile çeşitli açıklama türleri arasında biyolojik olarak anlamlı yol ilişkilerini ortaya çıkarma yeteneği. Burada gözlemlenen geniş Reactome kapsamı, muhtemelen, dfPPI'nin, Reactome'un yapısında iyi temsil edilen çok bileşenli süreçlere ve sinyal kaskadlarına doğrudan eşlenen protein ağlarının etkileşim düzeyindeki değişiklikleri yakalayan yeniden kablolamasına dayandığı gerçeğini yansıtmaktadır. DfPPI, ifadeden ziyade bağlantıdaki değişikliklerden yararlandığından, transkriptomik veya yalnızca bolluk proteomiği tarafından gözden kaçırılabilecek sistem düzeyindeki işlevsel kaymaları tespit etmek için özellikle uygundur. Bu bulgu, Reactome'un sürekli olarak dfPPI'dan türetilen protein setlerinden 14,15,16,17,18,20,21'den en tutarlı ve hastalıkla ilgili zenginleştirmeleri verdiği diğer çalışmalarla uyumludur.

Reactome, çoklu protein süreçleri ve kompleksleri (sinyal iletim kaskadları, hücre döngüsü modülleri, metabolik düzenekler) etrafında düzenlenir. Çünkü dfPPI, epikaperomla meşgul etkileşimcileri, yani işlevsel olarak hastalık iskelelerine dahil edilen protein gruplarını zenginleştirdiğinden, çıktısı doğal olarak izole edilmiş isabetler yerine uyumlu yol modülleri içerir. Bu koordineli yakalama, ilgili alt yollar ve hiyerarşiler arasında geniş, yüksek öneme sahip Reactome kapsamı sağlar. Buna karşılık, bolluk merkezli omikler (transkriptomik; küresel proteomikler) etkileşim durumlarını değil, ifade değişikliklerini bildirir; tek yemli AP-MS veya yakınlık etiketlemesi, yerel mahallelere her seferinde bir mühendislik yemi etrafında sağlar; ve çapraz bağlama/birlikte fraksiyonlama genellikle seyrek bağlantı sağlar. Bunların hiçbiri, tek başına, dfPPI'nin hücrelerde veya dokuda tek, endojen bir yakalamadan döndürdüğü bağlam seçilmiş, sistem düzeyinde kümeleri rutin olarak üretmez. Sonuç, hem geniş (birden fazla Reactome dalı yanar) hem de mekanik olarak tutarlı (proteinler birlikte değişir çünkü etkileşimleri - yalnızca miktarları değil - epişaperomlar tarafından yeniden bağlanır). Bununla birlikte, dfPPI'nin bir ikame değil, tamamlayıcı olduğunu not ediyoruz: her interaktomik yöntemin farklı güçlü yönleri ve sınırlamaları vardır ve optimal seçim (veya kombinasyon) biyolojik soru, numune kısıtlamaları ve gereken çözünürlük tarafından yönlendirilmelidir.

Birlikte, bu sonuçlar, protokolün, hastalık durumları veya deneysel bozulmalar arasında diferansiyel interaktom yeniden şekillenmesini ortaya çıkarmak için kullanılabilecek tekrarlanabilir, biyolojik olarak bilgilendirici veri kümeleri sağladığını doğrulamaktadır. dfPPI çıktısı, yol zenginleştirme çerçeveleriyle entegrasyon için çok uygundur ve standart bolluğa dayalı yöntemlerle tespit edilemeyen işlevsel yeniden kablolama olaylarının haritalanmasını sağlar.

Şekil 1: dfPPI platformuna genel bakış. (A) dfPPI (işlevsiz Protein-Protein İnaktertom) platformu, kemoproteomik bir iş akışı aracılığıyla hastalığa özgü PPI ağ işlev bozukluklarının tanımlanmasını sağlar. Bölüm 1, afinite matrisleri (örneğin, PU-boncuklar) üzerinde hareketsiz hale getirilmiş epikaperom hedefli kimyasal problar kullanılarak numune hazırlama ve interaktom yakalamayı içerir. Bölüm 2 ve 3, boncuk üzerinde veya jel içinde olmak üzere iki uyumlu sindirim iş akışını ve ardından interaktom tanımlaması için etiketsiz LC-MS/MS'yi özetlemektedir. İstatistiksel modelleme ve yol zenginleştirme dahil olmak üzere hesaplamalı analizler, bu protokolde yer almayan ancak https://epichaperomics.mskcc.org/'de ücretsiz olarak kullanılabilen dfPPI biyoinformatik boru hattı kullanılarak gerçekleştirilir. (B) dfPPI ilkesi. Hastalıkla ilgili bağlamlarda, endojen epişaperomlar, ÜFE ağlarını yeniden düzenleyen supramoleküler yapı iskeleleri oluşturur. Epikaperiroma yönelik kimyasal problar (örneğin, PU-boncuklar veya eşdeğeri), bu yapı iskelelerini bağlı etkileşimcileriyle birlikte doğrudan bozulmamış hücrelerden veya doğal lizatlardan yakalar ve tek bir deneyde çoklu yem aşağı çekme sağlar. Eşleştirilmiş kontroller (örneğin, inert boncuk kontrolü ve/veya serbest prob ile rekabet) paralel olarak işlenebilir. Yakalanan materyal ayrıştırılır ve boncuk veya jel içinde sindirilir, LC-MS/MS ile analiz edilir ve proteinler ölçülür (yoğunluk veya MS/MS spektral sayımları). Ortaya çıkan interaktom, koşullar arasında diferansiyel etkileşimleri hesaplamak ve yol/ağ zenginleştirmesi gerçekleştirmek için kullanılır ve sistem düzeyinde bağlama özgü ÜFE işlev bozukluğunu ortaya çıkarır. İş akışı, genetik etiketleme veya aşırı ekspresyon gerektirmez, hem hücreler hem de dokularla uyumludur ve kohort çalışmalarına göre ölçeklenir. Tersine, geleneksel afinite-saflaştırma-MS, her seferinde bir etiketli yem üzerinde yoğunlaşır, yapı başına yerel bir mahalle üretir ve tipik olarak bir ağı örneklemek için birçok yapı/çalıştırma gerektirir. Buna karşılık, dfPPI, yem olarak endojen epişaperomları kullanır ve birçok işlevsiz ÜFE'yi yerel sistemden aynı anda yakalar, bu da hastalığa özgü ağ yeniden kablolamasının keşfini hızlandırır ve tek bir yakalamadan yol düzeyinde okumalar sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PU-boncuk lot doğrulaması ve yakalama özgüllüğü. (A) Biyolojik özgüllük ve partiden partiye tutarlılık. MDA-MB-468 (epikaperom-yüksek) ve ASPC1 (epikaperom-düşük) hücreler, doğal tamponda (20 mM Tris, pH 7.4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; %0.01 NP-40; proteaz/fosfataz inhibitörleri) parçalandı. Her yakalama için, 40 μL PU-boncuk bulamacı, 250 μg toplam protein (1 μg/μL) ile 4 °C'de rotasyonla 3 saat inkübe edildi. Boncuklar doğal tamponda yıkandı; kompleksler ~100 μL SDS numune tamponu içinde denatüre edildi/ayrıştırıldı. Her elüatın 5-10 μL'si SDS-PAGE ile çözüldü ve HSP90, HSC70 ve HOP için immünoblotlandı. Giriş lizatları referans için gösterilmiştir. İki PU boncuk lotu (Parti 1, taze; Parti 2, yaşlı), MDA-MB-468'de güçlü zenginleştirme ve ASPC1'de minimum sinyal vererek, korunmuş özgüllük ve lot tutarlılığı gösterir. (B) Küresel kargoya karşı kontrol boncukları. MDA-MB-468 lizatları, (A)'daki gibi PU-boncuklar veya eşleştirilmiş kontrol boncukları ile işlendi. Her elüatın ~20 μL'si yüklendi, SDS-PAGE ile ayrıldı ve Coomassie boyandı. PU boncuklar, epikaperiroma bağlı düzeneklerin karmaşık, yüksek MW'lık bir kargo özelliğini geri kazanırken, kontrol boncukları minimum arka plan gösterir. Moleküler ağırlık belirteçleri (kDa) belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: dfPPI afinite yakalama, interaktom tanımlama ve biyoinformatik analizlerden elde edilen temsili sonuçlar. (A) Dört temsili insan beyni örneğinden (PT1-PT4) epikaperiyoma bağlı interaktomların PU-boncuk afinite yakalamalarından ayrıştırılan proteinlerin Coomassie boyalı SDS-PAGE jeli. Boncuk bağlı protein düzenekleri, SDS numune tamponunda kaynatılarak denatüre edildi, SDS-PAGE ile çözüldü ve moleküler ağırlıklar arasında interaktom geri kazanımını değerlendirmek için boyandı. Her numune, çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için numuneler arasında boş bir şerit olacak şekilde ayrı bir şeride yüklendi; Bu boş şeritlerde ara sıra gözlemlenen zayıf bir sinyal, elektroforez sırasında küçük numune yayılımını yansıtır. Bu jeller, MS tesisine gönderilen numuneleri temsil eder, burada her şerit jel içi sindirim ve MS tarafından protein tanımlaması için beş dilime bölünmüştür. (B) Sekiz temsili murin beyin örneğinden (iki kopya halinde çalıştırılan) boncuk üzerinde sindirilmiş epikaperom interaktomlarından tanımlanan protein yoğunluklarının temel bileşen analizi (PCA), teknik kopyaların sıkı bir şekilde kümelenmesini ve PC1 ve PC2 boyunca net biyolojik ayrımı ortaya koymaktadır. Bu, sağlam dfPPI analizi için yüksek teknik tekrarlanabilirliği ve yeterli biyolojik varyansı doğrular. Veri yapısı, teknik eserlerin değil, etkileşim düzeyindeki farklılıkların örnek ayrımını yönlendirdiğini ve yapay normalleştirme gerektirmeden aşağı akış diferansiyel interaktom modellemesi için güçlü bir temel sağladığını göstermektedir. (C) Sekiz numune grubu boyunca öncü iyon yoğunlukları için varyasyon katsayısı (CV) dağılımları, medyan CV'ler %9,7 ila %11,9 arasında değişmekle (dikey kesikli çizgilerle gösterilir) sürekli olarak düşük varyans gösterir. Bu düşük CV'ler, MS tespit ve miktar belirleme hattının tekrarlanabilirliğini ve sağlamlığını vurgulamaktadır. Tutarlılık, ham yoğunluğun veya MS/MS değerlerinin, etkileşim gücündeki varyansın (global protein ekspresyonu değil) ilgilenilen biyolojik sinyal olduğu dfPPI analizi için güvenilir girdiler olarak kullanılmasını destekler. (D) Tüm numunelerde log_2'ye dönüştürülmüş protein yoğunluğu değerlerinin hiyerarşik kümeleme ısı haritası (teknik kopyalar gösterilerek). Numuneler, epişapiroma bağlı interaktomların sağlam bir şekilde yakalandığını ve biyolojik olarak ilgili varyansın korunduğunu doğrulayarak, çoğalmak yerine biyolojik kökene göre kümelenir. Proteinler arasında geniş dinamik aralık ve tutarlı tespit, dfPPI analizi için veri kümesi kalitesini daha da destekler. Ölçek çubuğu, 2 (mavi, düşük bolluk) ile₁₄ (sarı, yüksek bolluk) arasında değişen log 2-dönüştürülmüş protein yoğunluğu değerlerini temsil eder. (E) dfPPI tarafından tanımlanan diferansiyel olarak etkileşen proteinler üzerinde gerçekleştirilen yol zenginleştirme analizinin Manhattan grafiği. Zenginleştirme g:Profiler kullanılarak gerçekleştirildi ve önemli terimler −log₁₀(p-değeri) ile çizildi, açıklama kaynağına göre renklendirildi: GO Moleküler Fonksiyonu (GO:MF), GO Biyolojik Süreci (GO:BP), GO Hücresel Bileşeni (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways ve İnsan Fenotip Ontolojisi (HP). Bu çıktı, dfPPI'nin temel faydasını temsil eder: epikaperom güdümlü interaktom yeniden şekillenmesi yoluyla bozulan biyolojik olarak anlamlı fonksiyonel yolların ortaya çıkarılması. Geniş açıklama kapsamı, bu yaklaşımla elde edilebilecek sistem düzeyindeki içgörünün altını çiziyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yöntem	Neyi yakalar?	Başlıca güçlü yönler	Önemli sınırlamalar	Tipik kullanım	Ölçeklenebilirlik (kohortlar)
AP-MS (afinite saflaştırma–MS)	Tek bir yemin doğrudan/doğruya yakın etkileşimleri	Yüksek özgüllük; Nicel; karmaşık kompozisyon için iyi	Yem/etiket/antikor gerektirir; her seferinde bir yem; geçici/zayıf kaçırabilir	İlgilenilen bir proteinin ortaklarını tanımlayın	Düşük-orta (birçok yem gerekli)
Yakınlık etiketlemesi (örneğin, BioID/APEX varyantları)	Zamanla bir yemin nano ölçekli yakınındaki proteinler	Geçici/zayıf komşuları yakalar; Canlı hücrelerde çalışır	Genetik mühendisliği; hedef dışı etiketleme; parametre-ağır	Yerel mahalle haritaları; Dynamics	Düşük-orta (yem başına mühendislik)
XL-MS (çapraz bağlanan MS)	Proteinlerin içindeki/arasındaki uzamsal yakınlıklar/temaslar	Yapısal kısıtlamalar; Geçici kişileri yakalar	Karmaşık analiz; alt proteom genişliği; örneğe özel	Yapısal/bağlamsal topoloji	Düşük (uzmanlaşmış)
Birlikte Fraksiyonasyon/MS (CF-MS)	Yerel meclislerin birlikte elüsyonu	Etiketleme yok; Yerel derlemeler	Emek yoğun; karmaşık çıkarım; sınırlı hassasiyet	Küresel karmaşık manzara	Ilımlı
CETSA/TPP	Birlikte kararlılık/birlikte toplama profilleri	Etiketsiz; Yerel koşullar	ÜFE'ler için dolaylı; çözünürlük kısıtlamaları	Hedef etkileşim; Termal kaymalar	Ilımlı
dfPPI (epikaperomik)	Endojen epikaperomlar tarafından multipleks yemler olarak yakalanan ağ düzeyinde etkileşim yeniden kablolaması	Endojen; etiketleme yok; bir yakalama binlerce işlevsiz ÜFE'yi sorguluyor; yol/ağ okumaları; doku uyumlu; Kohort dostu	Yalnızca hastalık bağlamına uygulanabilir; özel problar (PU boncuklar, YK5-B); Genel karmaşık keşif için tasarlanmamıştır	Hastalık-bağlam interaktomunun yeniden şekillenmesi, yolak önceliklendirmesi, hipotez oluşturma	Yüksek (yüzlerce numune uygulanabilir)

Tablo 1: ÜFE-haritalama yaklaşımları ile dfPPI'nin karşılaştırılması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Tam Spectronaut parametre ayarları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, dfPPI platformunu kullanarak doğal biyolojik örneklerdeki işlevsiz ÜFE'lerin haritalanmasını sağlar. Bolluk veya ekspresyon değişikliklerinden işlev bozukluğu çıkarımı yapan geleneksel yöntemlerin aksine, bu platform, epikaperom hedefleme probları ile afinite saflaştırması ve ardından etiketsiz yoğunluğa dayalı kantitatif MS yoluyla hastalığa özgü etkileşimcileri izole ederek yapısal düzeyde ağ yeniden kablolamasını yakalar. Mevcut uygulama ölüm sonrası beyin dokusuna odaklansa da, yöntem, kültürlenmiş hücreler ve kanser, nörodejenerasyon ve bağışıklık fonksiyon bozukluğu^{modellerinden} dokular dahil olmak üzere diğer numune türlerine ve hastalık modellerine geniş ölçüde uygulanabilir 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI, kinetik olarak epişaperomları seçen ve düzenekleri bağlı etkileşimcileriyle yakalayan problara dayanır. PU boncuklar (PU-H71/PU-AD gibi epikaperom bağlayıcı kemotiplerden türetilmiştir), HSP90 çekirdekli epişaperomları kovalent olmayan ancak uzun kalma süresi ile birleştirir, bu da epikaperom konformasyonunun geleneksel şaperon komplekslerine göre kinetik seçiciliğin ayırt edici özelliğidir²³. YK5-B, epikaperomlar içinde HSC70'e yönlendirilmiş, biyotinlenmiş, kovalent bir probdur, lizisten önce hücre içi yakalamayı sağlar ve endojen PPI'ları korur¹⁷. Seçicilik, HSP90/HSC70 konformasyonlarını ve cep kimyasını yeniden şekillendiren ve epikaperom düzeneklerini^{stabilize eden hastalıkla} ilişkili PTM'lerden kaynaklanır 14,23,43,44; bu değişiklikler, PU tipi kovalent olmayan problar⁴⁵ için yüksek afinite, yavaş k_kapalı bağlanma sağlar (ve HSC70'e yönelik YK5-B ile kovalent yakalamayı mümkün kılar), böylece epikaperom komplekslerini kinetik olarak tutar ve LC-MS/MS için doğrudan ve dolaylı etkileşimcilerini birlikte izole eder. Uygulamada, PU boncuklar lizat/homojenat iş akışları için idealdir, oysa YK5-B canlı hücre yakalamayı destekler; her ikisi de LC-MS/MS ile tanımlanabilen ve aşağı akış dfPPI analizi için kullanılabilen bağlama bağlı derlemeleri korur.

dfPPI için, yakalama problarını sentezlemek için kimyada özel uzmanlık gereklidir. Bununla birlikte, bu gereklilik dfPPI'ye özgü değildir: yaygın olarak kullanılan PPI yöntemleri (AP-MS, yakınlık etiketleme, XL-MS) ayrıca özel becerilere dayanır - örneğin, klonlama/mühendislik etiketli yemler, kararlı hücre hattı oluşturma, etiketleme/çapraz bağlama optimizasyonu ve karmaşık biyoinformatik boru hatları. Buna karşılık, dfPPI, genetik manipülasyondan ve yem aşırı ekspresyonundan kaçınır, doğrudan doğal hücreler veya dokular (kıt klinik biyoörnekler dahil) üzerinde çalışır ve proteomik çekirdeklerde zaten rutin olan standart afinite yakalama ve LC-MS iş akışlarını kullanır. Benimseme engellerini azaltmak için, doğrulanmış PU boncuklar ve eşleşen kontrol boncukları, Chiosis laboratuvarından MTA aracılığıyla temin edilebilir ve taşıma/QA adımları, adım 1.3 ve 1.4'te tam olarak belirtilmiştir. Son olarak, analiz, gerekli istatistikleri ve yol/ağ okumalarını uygulayan ve biyoinformatik yükünü azaltan (yani, kodlama geçmişi olmayan ve yalnızca temel biyoinformatik becerileri olan kullanıcılar için) web tabanlı bir dfPPI uygulaması tarafından desteklenir.

AP-MS, XL-MS, yakınlık etiketleme, birlikte fraksiyonlama ve CETSA/TPP'nin her biri farklı soruları yanıtlar (doğrudan bağlayıcılar, mekansal yakınlık, komşuluk etiketleme, birlikte montaj veya termal ortak kararlılık). dfPPI, amaç hastalıkta endojen, bağlama bağlı yeniden kablolamayı haritalamak olduğunda, özellikle genetik etiketlemenin mümkün olmadığı doğal dokularda veya büyük klinik kohortlarda ve tek bir yakalamadan yol/ağ düzeyinde okumalar istendiğinde tercih edilen yöntemdir. dfPPI, tek bir aşağı çekmede birçok protein arasındaki koordineli etkileşim değişikliklerini yakalamak için epikaperomları multipleks yemler olarak kullanır ve birincil malzemeden ölçeklenebilir LC-MS/MS tanımlaması ve yol merkezli analiz sağlar. Uygulamada, dfPPI aşağı yönlü, yem odaklı doğrulamayı (örneğin, belirli düğümlerde AP-MS) tohumlayabilirken, geleneksel yöntemler dfPPI tarafından vurgulanan kompleksler için topolojiyi (doğrudan temaslar, mekansal kısıtlamalar) iyileştirebilir. Yan yana karşılaştırma için Tablo 1'e bakın.

Birkaç kritik adım, iş akışının başarısını etkiler. İlk olarak, yüksek kaliteli protein özleri önemlidir. Bu, proteolizi en aza indirmek ve doğal kompleksleri korumak için dokuların veya hücrelerin (ideal olarak dondurularak dondurulması ve -80 °C'de saklanması) dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirir. Hem proteaz hem de fosfataz inhibitörlerinin dahil edilmesi tartışılamaz: bu tahlilde fonksiyonel "yem" görevi gören epikaperom bütünlüğü, HSP90^23,43 gibi çekirdek bileşenlerin spesifik translasyon sonrası modifikasyonlarına bağlıdır. Örneğin, Ser226 ve Ser255'in fosforilasyonu, epikaperom konformasyonunu stabilize etmek ve iskele işlevini²³ korumak için gereklidir. Fosfataz inhibitörlerinin ihmali, yapısal çökme ve biyolojik özgüllük kaybı riski taşır.

Bir diğer önemli belirleyici ise PU-boncuk afinite matrisinin kalitesi ve işlenmesidir. Boncuklar -20 °C'de %100 izopropanol içinde saklanmalı ve tanımlanmış bir aktivite penceresi içinde, ideal olarak 1-2 yıl içinde kullanılmalıdır. Yaşlı boncuklar azalmış bağlanma kapasitesi veya artan spesifik olmayan etkileşimler sergileyebileceğinden, aktivite kritik deneylerden önce doğrulanmalıdır. İnkübasyon süresi ve protein girişi de optimize edilmelidir: aşırı inkübasyon arka planı yükseltebilirken, yetersiz protein girişi tespit derinliğini tehlikeye atabilir. Her numune türü için uygun girişi kalibre etmek için 3 saatlik inkübasyonlar ve pilot aşağı çekmeler öneririz.

Bu protokolle iki sindirim stratejisi uyumludur: boncuk üstü ve jel içi. Her iki iş akışı da tekrarlanabilir sonuçlar verirken, her biri ödünleşimler sunar. Jel içi sindirim, keratin gibi kirletici maddelerin ortaya çıkmasına neden olabilir ve ek işlem adımları gerektirir. Boncuk üzerinde parçalama, iş akışını kolaylaştırır ve genellikle numune verimi veya girdi miktarı sınırlayıcı olduğunda tercih edilir. Bununla birlikte, proteaz miktarları toplam protein girdisine göre kalibre edilmelidir: yöntem 750 ng tripsin için tasarlanmış olsa da, protein seviyeleri yüksekse eksik sindirim meydana gelebilir, bu da gözden kaçan bölünmelere ve peptit geri kazanımının azalmasına neden olur. Sindirim verimliliğinin değerlendirilmesi ve enzim girdisinin buna göre ayarlanması tavsiye edilir. Tüm sindirim adımları, tutarlılığı sağlamak ve arka planı en aza indirmek için taze hazırlanmış, kontaminasyonsuz reaktifler kullanılarak düşük bağlayıcı tüplerde gerçekleştirilmelidir.

LC-MS enjeksiyonu başına protein yüklemesi, yakalama iş akışına, peptit verimine ve kolon kapasitesine bağlıdır. Standart nano-LC C18 kolonlarında (~50-75 μm ID, ~15-25 cm) analiz edilen boncuk üzerinde özetler için, tipik olarak enjeksiyon başına 300-500 ng yükleriz; ~400-500 ng'nin üzerinde performans artışı gözlemlemedik, daha yüksek yükler ise iyon baskılama ve tepe genişlemesi riski taşıyor. Jel içi iş akışları için (örneğin, şerit başına beş dilim), genellikle kopya başına dilim başına tuzdan arındırılmış malzemenin ~%25'ini enjekte ederiz ve gerekirse yeniden enjeksiyon için yedek olarak ~%50'sini tutarız. Her durumda, enjeksiyondan önce peptit konsantrasyonunu ölçün, bir QC özeti ile doğrusal yanıtı doğrulayın ve yükü, kromatografik tepe şekli ve tanımlama derinliği aşırı yüklenme olmadan korunacak şekilde ayarlayın.

DIA yoluyla etiketsiz miktar tayini, tekrarlanabilirliği ve derinliği nedeniyle proteomikte yaygın olarak kullanılmaktadır⁴⁶. Bununla birlikte, amacın küresel protein bolluğunu ölçmek yerine epikaperom iskeleleri ile etkileşime giren proteinleri tanımlamak olduğu bunun gibi afinite yakalama deneyleri bağlamında, MaxLFQ gibi normalleştirme stratejileri uygun değildir. Bu yaklaşımlar, bu protokole özgü zenginleştirme adımı tarafından ihlal edilen tek tip girdi ve proteom çapında benzerlik varsayar. Bunun yerine, yoğunluk değerleri veya MS/MS spektral sayımları, aşağı akış fonksiyonel analizi için yeterli ve biyolojik olarak anlamlı niceleme sağlar. Bu ölçümler, proteinlerin epikaperomlarla koşullar arasında nispi etkileşim gücünü veya sıklığını yansıtır. Önceki çalışmalarda 16,17,18,20 gösterildiği gibi, bu değerler, proteom çapında normalizasyona dayanmadan değişen biyolojik yolları tanımlayan dfPPI gibi sistem düzeyinde interaktom analizleri için çok uygundur. Hastalık veya tedavinin getirdiği gerçek biyolojik varyansı koruyarak, yoğunluk veya MS/MS tabanlı niceleme, ÜFE ağ işlev bozukluklarının doğru ve sağlam bir şekilde haritalanmasını sağlar.

Afinite yakalama, tüm lizata karşı arama alanını azaltsa da, dfPPI pull-down'ları hala geniş bir dinamik aralığa yayılan yüzlerce ila binlerce protein ve ayrıca birlikte zenginleştirilmiş arka plan içerir. Kohort ölçeği karşılaştırmaları için, DDA'nın stokastik öncü seçimi, çalıştırmadan çalıştırmaya eksik değerlere ve düşük bolluktaki etkileşimcilerin değişken örneklemesine yol açar¹⁸. DIA, tüm iyonları önceden tanımlanmış pencerelerde sistematik olarak parçalayarak, daha fazla derinlik, daha az eksik değer ve aşağı akış çıkarımı tek protein yerine yol/ağ düzeyinde olduğunda çok önemli olan daha yüksek çalıştırmadan çalıştırmaya tekrarlanabilirlik özellikleri sağlar. Bu nedenle dfPPI için DIA'yı standartlaştırıyoruz.

Tüm afinite yakalama yöntemlerinde olduğu gibi, spesifik olmayan protein bağlanması doğal bir husustur. Proteinler, reçineye yapışkanlık, yüksek bolluk veya agregasyon nedeniyle tutulabilir. Bu tür spesifik olmayan etkileşimler aşağı açılır elüatta görünebilirken, bunların varlığı bu protokolün¹⁷ aşağı yönlü analitik hedefini zayıflatmaz. dfPPI iş akışı, ikili etkileşimleri tanımlamak için değil, sistem düzeyinde PPI yeniden kablolama modellerini çıkarmak için tasarlanmıştır. İşlevsel zenginleştirme analizleri, diferansiyel etkileşimler üzerinde gerçekleştirilir ve koordineli yol düzeyindeki değişiklikleri ortaya çıkarmak için ağ tabanlı istatistiklerden yararlanır. Önceki çalışma^17'de gösterildiği gibi, bu sistem düzeyindeki yaklaşım, izole edilmiş spesifik olmayan proteinlerin etkisini en aza indirir ve kohort düzeyindeki verilerden sağlam biyolojik sonuçların ortaya çıkmasına izin verir.

Ko-immünopresipitasyon, yakınlık etiketleme veya çapraz bağlama gibi geleneksel interaktom haritalama yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, dfPPI platformu belirgin bir avantaj sunar: yem mühendisliği veya aşırı ekspresyon gerektirmeden hastalıkla ilgili koşullar altında fonksiyonel interaktom yeniden şekillenmesini yakalar. Yöntem, supramoleküler epişaperomlar etrafında oluşan protein komplekslerini izole ettiğinden, sağlıklı sistemlerde bulunmayan ortaya çıkan protein düzeneklerini tespit ederek yeni hastalık etkenlerinin keşfedilmesini sağlar. Yaklaşım, dokular, türler ve hastalık durumları arasında ölçeklenebilir ve uyarlanabilir ve halihazırda kanser ve nörodejenerasyonda proteomun yeniden şekillenmesine ilişkin benzersiz bilgiler sağlamıştır. Bu nedenle, bu yöntem, insan hastalıklarında bozulan işlevsel ağları ortaya çıkarmak için güçlü bir araç sunar.

Buradaki örneklerin ötesinde, dfPPI, (i) hastaları ağ işlev bozukluğuna göre sınıflandırmak ve hedef katılımı ve yol düzeltmesi hakkında rapor veren farmakodinamik biyobelirteçleri keşfetmek için büyük klinik kohortlar için iyi bir konumdadır; (ii) yeniden kablolama yörüngelerini izlemek ve yanıt verenleri tahmin etmek için boylamsal örnekleme (örneğin, tedavi öncesi/sonrası, hastalık evrelemesi); (iii) etkileşim durumu değişikliklerini yukarı akış sinyallemesine bağlamak için fosfoproteomik ve diğer PTM'ye duyarlı omiklerle entegrasyon; (iv) yerel ağ patobiyolojisini haritalamak için mikrodiseke bölgelerden (tümör-normal arayüzler, beyin alt bölgeleri) uzamsal olarak çözümlenmiş yakalamalar; (v) dfPPI okumalarının eyleme geçirilebilir düğümleri ve etki mekanizmalarını aday gösterdiği pertürbasyon taramaları (genetik veya bileşik); ve (vi) prognoz ve terapötik tasarım için dfPPI haritalarından hastalığa özgü ağ özelliklerini öğrenen grafik/AI modellemesi. Metodolojik olarak minyatürleştirme, otomasyon (örneğin, 96 kuyulu formatlar) ve standartlaştırılmış kalite kontrol, translasyonel çalışmalar ve klinik deneyler için yüksek verimli boru hatları sağlayacaktır. Son olarak, dfPPI çıktıları, öncelikli modüllerin topolojisini çözmek için hedeflenen takipleri (AP-MS, XL-MS veya yakınlık etiketleme) tohumlayabilir ve yöntemin interaktomik araç seti içindeki tamamlayıcılığının altını çizebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250	Zehirli, Yanıcı
Asetonitril (ACN) Optima	Fisher Scientific	A955-1	LC/MS derecesi (Yanıcı)
Affi-Gel 10 aktif affinite kromatografi ortamı	Bio-Rad	1536099	PU boncukları ve kontrol boncukları yapmak için kullanılır (Yanıcı)
Amonyum Bikarbonat (ABC)	Sigma-Aldrich	09830-500G
Aurora Ultimate 25x75 C18 UHPLC kolonu	İyonoptikler	AUR3-25075C18-CSI
Otoradyografik film	EWEN-PARKER X-RAY ŞIRKETI	EBA45	Western blot'tan sonra kemilyünesan sinyal algılama için alternatif
Biomasher mikro doku homojenizeri	DWK Yaşam Bilimleri Kimble	7496250010	Protein çıkarımı için donmuş beyin dokusunun homojenleştirilişinde kullanılır
Bromofenol mavisi	Fisher Biyoreagenti	BP115-25
1.5 mL tüpler için santrifüj	Eppendorf	5424
1.5 mL tüpler için santrifüj;	Eppendorf	5417R	Sıcaklık kontrolüyle
15-50 mL tüpler için santrifüj	Eppendorf	5810R	Konik tüpler için kullanılır
ChemiDoc MP görüntüleme sistemi	Bio-Rad	17001402	Jel/leke densitometrisi için kullanılır
Sütun fırını	Sonation GmBH, Almanya	ES071/ES072	NanoLC kolonunu 50 derece ve derecede tutar; C tutarlı tutma için
Konik tüpler (15 mL)	Fisher Scientific	352096
Kontrol-boncuklar	Şioz Laboratuvarı	YOK	Taldone ve ark. (PMID:  21459002)
Coomassie G-250 lekesi (Biyo-güvenli)	Bio-Rad	1610786
Koyu Eppendorf tüpleri (1.5 mL)	USA Scientific	1415-2507
Ditiothreitol (DTT)	Roche	10197777001	Irritan
Kolay nLC 1000	Thermo Fisher Scientific	Kolay nLC 1000	Q Exactive HF ile kullanılan LC sistemi
Empore Katı Faz Çıkarma Diskleri	3M Şirketi	2215-C18 (Oktadesil)	Peptit tuzsuzlaştırma için StageTips hazırlamak için kullanılır; %100 Metanol ile aktive edildi
Geliştirilmiş kemimilüminesans (ECL) kiti	Thermo Fisher Scientific	32209
Eppendorf tüpleri (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Formik Asit (FA) Optima	Fisher Scientific	A117-10X1AMP	LC/MS derecesi
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	BIIT Grubu-Tartu & Uuml; likool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	Yol zenginleştirme
Gliserol	Fisher Biyoreagenti	BP229-1	Moleküler biyoloji derecesi
Glisin	Fisher Biyoreagenti	BP381-5	Kristal Toz
Keçi anti-fare HRP ile konjuge ikincil antikor (RRID: AB_2619742)	Sothern Biotech	1030-05	H90-10 antikoru için ikincil
Keçi anti-tavşan HRP ile konjuge ikincil antikor (RRID: AB_2632593)	Sothern Biotech	4010-05	HSP90&alpha için ikincil sistem; ve HOP antikorları
Keçi anti-sıçan HRP ile konjuge ikincil antikor (RRID: AB_2716837)	Sothern Biotech	3030-05	HSC70 antikoru için ikincil
Isıtılmış yörünge sallayıcısı	Eppendorf	TermoMikser C (2231001127)
HeLa protein sindirimi standard-Pierce	Thermo Fisher Scientific	88329	LC-MS QC değerlendirmesi için kullanılıyor
HOP antikoru (RRID: AB_10828378)	Hücre Sinyalizasyonu	5670	PU-boncuklar için QC
HSC70 antikoru (RRID: AB_10617277)	Enzo	SPA-815	PU-boncuklar için QC
HSP90 (H90-10) antikor (RRID: AB_854214)	StressMarq	SMC-107	PU-boncuklar için QC
HSP90 alfa antikor (RRID: AB_303423)	Abcam	Ab2928	Normalleştirme için Bölüm 1.2
İnsan hücre hattı: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	Kontrol hücre hattı, epichaperome düşük/şaperon yüksek
İnsan hücre hattı: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	Kontrol hücre hattı, epichaperome yüksek/chaperon yüksek
ImageJ (v1.54p)	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	Densitometri
İyodoasetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Zehirli
Düşük proteinli bağlanma mikrosantrifüj tüpleri	Sarstedt	72.706.600
Lys-C proteaz	Promega	VA1170	LC/MS derecesi
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	63068	Moleküler biyoloji derecesi
MaxQuant (v2.1.1.0)	Max-Planck-Biyokimya Enstitüsü	https://www.maxquant.org/	Peptit/protein tanımlama ve etiketsiz yoğunluk temelli nicelik için MaxDIA iş akışı
Metanol	Fisher Chemical	A454-4	HPLC derecesi, yanıcı, toksik
Mini Proteaz İnhibitörü Kokteyl tableti (Tam)	Roche	4693124001
Mini Trans Blot Elektroforetik Transfer Hücresi	Bio-Rad	1703930
Mini-jel elektroforez tankı	Thermo Fisher Scientific	A25977	Novex precast jelleri için kullanılır
Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez Hücresi	Bio-Rad	1658004	Mini-PROTEAN Precast Protein Jelleri veya el döküm jelleri için kullanılır
Mini-PROTEAN  TGX Precast Protein Jelleri (4– 20%)	Bio-Rad	4561094
NanoDrop	Çevik	BioTek Sinerjisi H1	LC-MS enjeksiyonundan önce peptit konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılır
NanoElute 2	Bruker	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	diaPASEF iş akışında kullanılıyor
Nanospray Flex kaynağı	Thermo Fisher Scientific	ES071	Nanospray ESI bağlantısı için
Yeni Objective PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	New Objective Inc.	PF360-75-10-N-5	20 cm uzunluğunda C18 çamur ile doldurulmuştur
Nitroselüloz zarı	Cytiva Amersham	10600006
Yağsız kuru süt	Laboratuvar Bilimsel	M0841
Novex 8% Tris-Glycine prekast jeller	Thermo Fisher Scientific	XP00080BOX
NP-40	Roche	11754599001
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS)	Gibco	10010023
PhosSTOP fosfataz inhibitörü kokteyl tableti	Roche	4906837001
Pierce BCA protein test kiti	Thermo Fisher Scientific	23225
Plastik kaplar	Fisher Scientific	FB0875711A
Platform sallayıcı	Corning	6705
Potasyum klorür	Fisher Biyoreagenti	BP366-1	Beyaz Kristaller
PowerPac Evrensel Güç Kaynağı	Bio-Rad	1645070
Precision Plus Protein Kaleidoskopu Prestained Protein Standardı	Bio-Rad	1610375
PU-boncuklar	Şioz Laboratuvarı	YOK	Taldone ve ark. (PMID:  21459002)
Q Exactive HF Orbitrap kütle spektrometresi	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	DIA-MS için Kullanılıyor
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & mikro; m	Dr. Maisch GmbH, Almanya	R13.aq	peptit ayrımı için silika ortamı; Toz/Metanol Bulamacı (1:3, v/v)
Dönme ünitesi (uç-uç döner cihaz)	Barnstead  Uluslararası	400110
Sep-Pak C18 Fişeği (100 mg)	Waters Corporation	WAT023590
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Fisher Biyoreagenti	BP166-500	Elektroforez derecesi
Sonicator	Branson	2510
SpectraMax Paradigm Çok Modlu Mikroplaka okuyucu	Moleküler Cihazlar	SpectraMax Paradigması
Spectronaut	Biognosys	https://biognosys.com/software/spectronaut/	directDIA iş akışı
SpeedVac konsantratör	Thermo Fisher Scientific	Savant SPD111V
Emici vakum	Kardinal Sağlık	CDL-65651-320
TimsTOF HT kütle spektrometresi	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	diaPASEF analizinde kullanılır
Triflorestik Asit (TFA) Optima	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	LC/MS derecesi (Korozif, yanıcı)
Tris	Fisher Biyoreagenti	BP152-5	Kristal toz; Moleküler biyoloji derecesi
Tris, pH 6.8 (1 M)	Teknova	T1068
Tris, pH 7.5 (1 M)	Fisher Biyoreagenti	BP1757-500	Moleküler biyoloji derecesi
Tris-tamponlu tuzlu (20x TBS) tampon	VWR, Yaşam Bilimleri	97064-338
Tris-Glycine-SDS (TGS 10x) çalıştıran jel tamponu	Fisher Biyoreagenti	BP13414	Elektroforez
Tripsin	Promega	V5111	Sıralama derecesi
Tripsin Gold	Promega	V5280
Tween 20	Fisher Biyoreagenti	BP337-100
Üre	Sigma-Aldrich	U0631-500G
Girdap	Fisher Scientific	02-215-414
Su	Fisher Scientific	W6-1	LC/MS derecesi