Mikroakışkan Perifusion Cihaz içindeki Multi-Parametrik Islet Perifusion Sistemi

Bu sunumda, insülin salgılayan köpeklere yanıt olarak dinamik insülin sekresyonu, kalsiyum akışı ve pankreas deliklerinin mitokondriyal potansiyel değişikliklerinin eş zamanlı ölçümü için mikroakışkan tabanlı bir göz kapağı perfüzyon sistemi tanıtılacaktır. Perfüzyon sistemi, üç katmanlı bir mikroakışkan cihaz, şırınga pompaları ve bir fraksiyon toplayıcı insülinden oluşur. Sekretagogların neden olduğu kalsiyum akışı ve mitokondriyal potansiyeller floresan mikroskop düzeneği kullanılarak görüntülenir.

Merhaba, benim adım Ola, Chicago'daki Illinois Üniversitesi Organ Nakli Cerrahisi Bölümü'nde Dr.Val Holter'in laboratuvarından bir Waller. Merhaba, ben Don Lee, aynı zamanda Ekim Laboratuvarı'ndan. Merhaba, ben Tricia Hart, yine Dr.Al Holster'ın laboratuvarındanım.

Bugün size doğrusal bir glikoz gradyanı kullanarak eşzamanlı göz kapağı görüntüleme için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda kuşgözü görsellerini ve işlevini incelemek için kullandık. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedür için kullanılan mikroakışkan cihaz, standart fotolitografi ile üretilen üç kürlenmiş PDMS katmanından birleştirilir. Bir silikon master'dan üretilen ilk katman, 150 mikrometre derinliğinde ve 500 mikrometre çapında, delikleri nazikçe yerinde tutacak mikroakışkan cihazın kuyularına sahiptir. İkinci katman, 500 mikrometre yüksekliğinde ve iki milimetre genişliğinde kanallara sahiptir.

Kanalın ortası, daha iyi çözelti alışverişi için akışı yaymak üzere genişletilir Cihazın içinde, takas kuyusu, katmanın ortasında üç milimetre yüksekliğinde ve yedi milimetre genişliğinde bir delik açılarak yapılır. Üçüncü katman, kalın bir PDMS levhasıdır. Bu katmanı hazırlamak için, her iki tarafa kanalın girişi ve çıkışı ile hizalanan küçük delikler açın.

İkinci katmanda, üç katmanın tümü oluşturulduktan sonra, ilk katman, kuyucuklar yukarı bakacak şekilde bir cam slayta bağlanır. İkinci katman daha sonra kanal aralığı yukarı bakacak şekilde ilk katmana bağlanır. Son olarak, üçüncü katman ikinci katmana bağlanır.

Katmanlar birleştirildikten sonra, cihaz deneyler için kullanıma hazırdır. % 70 etanol ile doldurulmuş ve boru üzerinde Tai ile cihazın giriş portuna bağlı 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, etanolü cihaz kanallarından akıtarak mikroakışkan cihazı sterilize edin. Daha sonra aynı kurulum akışını kullanarak, etanolü yıkamak için deiyonize su.

Cihaz sterilize edildikten sonra, tigon tüpü kullanarak ısıtılmış bir mikroskop sahnesine yerleştirin, yüksek ve düşük glikoz çözeltileri içeren şırınga pompalarını bir Y konektörüne bağlayın. Ardından mikroakışkan cihazın girişine bağlayın. Mikroakışkan cihazın çıkışını bir fraksiyon toplayıcıya bağlayın.

Borunun 37 santigrat derecelik bir sıcak plaka üzerinde durduğundan emin olun. Çözeltilerin deney boyunca fizyolojik sıcaklıkta tutulması çok önemlidir. Ardından, deney sırasında mikroakışkan ağ üzerinden perfüze edilecek glikoz gradyanını başlatmak için laboratuvar görünümü programını kullanın.

Bu yazılım, iki glikoz çözeltisinin akış hızını değiştirir. Şırınga pompalarını kontrol ederek, burada doğrusal, çan şeklinde ve kare şeklinde glikoz gradyan profilleri olmak üzere çeşitli glikoz gradyan profilleri oluşturulabilir. Bu deneyde gösterilen hesaplanan beklenen değerlerle karşılaştırıldığında, iki milimolar ila 25 milimolar glikozun doğrusal gradyanı, iki glikoz çözeltisinin dakikada 0.01 mililitrelik değişen bir akış hızı ve çözeltiler karıştırıldıktan sonra cihaza giren dakikada 0.25 mililitrelik sabit bir akış hızı ile kullanılacaktır.

Uygun gradyan profili seçildikten sonra, degradenin kararlılığını test edin. İlk olarak, gradyan sistemini başlatın. Daha sonra fraksiyon toplayıcıyı başlatın ve perfüz sekizini bir mililitrelik eend orph tüplerinde toplayın.

Daha sonra bir glukometre kullanarak, excel kullanarak her tüpteki glikoz konsantrasyonunu test edin. Glükometreden elde edilen sonuçları analiz edin. Daha sonra, yüksek glikozlu şırıngayı, dakikada bir mililitre hızında cihazdan 50 mililitre Krebs zil tamponu PERFUSE içinde% 0.5 BSA çözeltisi içeren bir şırınga ile değiştirin.

Bu, BSA ile perfüzyondan sonra salgılanan insülin seviyelerini daha sonra ölçerken doğruluğu sağlamak için insülinin mikrokanal duvarlarına spesifik olmayan emilimini önleyecektir. Yüksek glikoz çözeltisi reus ile değiştirin. 25 ila 30 elle seçilmiş fare deliğini, kalsiyum indikatör boyası fira 2:00 ve mitokondriyal potansiyeller indikatör boyası rumine 1 2 3 içeren iki mili molar glikoz Krebs zil tamponunda askıya alın, 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, cihazı perfüzyon sisteminden ayırın ve pipetin ucunu sokarak, adacıkları giriş portuna sokarak ve yüklemeden sonra adacıkları yavaşça dağıtarak delikleri dikkatlice mikroakışkan cihaza yükleyin, cihazı perfüzyon sistemine yeniden bağlayın. Baloncuk sokmamaya dikkat edin. Ardından, iki milimolar glikoz içeren KRB ile deliklere perfüze etmeye başlamak için şırınga pompasını çalıştırın.

Bu adım, fazla boyayı ortamdan yıkayacak, deney sırasında kullanılacak uyarma ve emisyon filtre setlerini ve maruz kalma sürelerini belirleyecektir. Ardından, fraksiyon toplayıcıyı, düşük glikoz çözeltisi ile halkaları kullanırken bir dakikalık aralıklarla toplanacak şekilde ayarlayın. Görüntülemek istediğiniz alanları veya deliklerini tanımlamak için basit PCI görüntüleme yazılımının ilgi alanını veya ROI aracını kullanın.

Ayrıca, hücreler 10 dakika boyunca yıkandıktan sonra çıkarılacak arka plan alanını daire içine alın, glikoz gradyan fraksiyonu toplayıcısını başlatın ve hızlandırılmış görüntülemeyi başlatın. 30 dakika sonra yazılımı ve yüksek glikozlu şırınga pompasını kapatın. Yüksek glikozun etkisini yıkamak için düşük glikoz ile perfüze etmeye devam edin.

10 dakika sonra, şırınga pompasını kapatarak düşük glikoz akışını durdurun. Perfüzyonun ardından, verileri analiz için excel'e aktarın. Perfu sekize salgılanan insülin miktarı, ELA fare delikleri ile belirlenebilir.

Burada gösterildiği gibi iki ila 25 milimolar glikozun doğrusal bir gradyanı ile perfüze edildi. Kalsiyum akışı ve insülin sekresyonu, altı milimolara karşılık gelen yaklaşık 13 dakikalık perfüzyondan sonra tetiklenir. Glikoz. Mitokondriyal potansiyellerdeki değişiklikler, yaklaşık 11 dakikada beklendiği gibi daha erken görülür.

Bu veriler, kuşgözü fizyolojisini karakterize etmek için bu mikroakışkan ağı kullanmanın avantajını göstermektedir. Kuşgözü fizyolojisi çalışması için mikroakışkan para füzyon cihazımızı nasıl kullanacağınızı size az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, deney sırasında deliklerin hareket etmesine neden olabileceğinden, cihazda kabarcık olmadığından emin olmayı unutmamak önemlidir.

Ayrıca, telaş, halkaları rahatsız etmeden dakikada bir ml'ye kadar ayarlanabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.