Name: Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Öğrenin, GIFM tekniği ile fare embriyolarında hücre soylarını izleyerek erken beyin gelişimini ve gen inaktivasyonunu nasıl çalıştığını. Bu yöntem gelişimsel biyoloji ve sinirbilim araştırmalarında güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mGFP fareler için S. Arber ve kağıt eleştirel okuma ve teknik yardım sağladı Zervas laboratuar üyelerine teşekkür ediyoruz. A. Brown Beyin Bilim Kaplan Yaz Lisansüstü Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir. E. Normand Beyin Lisans Programı Lisansüstü Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir. Bu araştırma aynı zamanda başlangıç ​​araştırma fonları (MZ) tarafından finanse edildi.

Tamoksifen hazırlanması ve ağızdan sonda Prosedürü (E8.5) <ul><li> Önceden ısıtılmış mısır yağı tamoksifen eriterek tamoksifen bir 20 mg / ml stok solüsyonu hazırlayın. </li><li> 37 ° çözüm inkübe ° C nutator ve aralıklı olarak vorteks üzerinde 2 saat. </li><li> 4 ışık, mağaza ° C tamoksifen stok koruyun ve bir aya kadar kullanabilirsiniz. </li><li> Bir genin özel CreER T alleli ve bir muhabir aleli taşıyan bir erkek; kaderi haritalama deneyler için, Swiss Webster kadın (Taconic satın wild tip) oluşan bir üreme çifti kurmak. MGFP erkek (Ellisor 2009); gösteri amaçlı Wnt1-CreER T kullanıyorsanız. </li><li> İsviçre Webster kadın, vajinal bir fiş görünüm için her sabah kontrol edin. Vajinal fiş 0.5 gün sonrası cinsel birleşmede olarak görülüyor günün sabahı (0900) belirleyin ve bu başlangıç ​​noktasına göre tamoksifen tarihini hesaplamak. (Bu deneme için, kullanılan embriyonik gün 8,5). </li><li> Tamoksifen stok solüsyonu (4 mg tamoksifen) 200 ul yukarı çekmek için bir hayvan besleme iğne (20G x 1-1/2) ile 1 ml şırınga kullanın. </li><li> Boynun ense tutarak sıkıca zaman hamile Swiss Webster kadın dizginlemek ve başın arka tarafında hareketsiz ve ventral yüzü yukarı bakacak şekilde ters çevirin. </li><li> Vücudu düz bir çizgide tutmak için ücretsiz parmaklar arasında kuyruk tutun. </li><li> Beslenme iğne ağız köşeye yerleştirin ve yavaşça ağız çatı boyunca iğne kılavuzu. </li><li> Vücuda paralel olacak şekilde aynı anda baş eğerek geri boynun düz tutmak için ise, iğne döndürün. </li><li> Mide doğru, yemek borusu aşağı iğne Kılavuzu. Trakea girmek için dikkatli olun. Iğne, hayvan öğürme refleksi yürütmektedir veya fare mücadeleleri ise, iğneyi hemen çıkarın ve sonda tekrar deneyin direnç varsa. </li><li> Besleme iğne midede sonra mideye tamoksifen yönetmek ve diseksiyon tarihe kadar kadın evine kafesine geri dönmek. </li></ul> Kraniotomi: <ul><li> Intrakardiyak yetişkin kaderi% 4 PFA eşlenen fare serpmek ve omuzlar üzerinde omuriliğe ile kesme makası ile baş kaldırmak. </li><li> Kesilmiş ve kafa derisi ile kafatası açığa çıkarmak için kafa (kaudal için rostral) dorsal orta hat boyunca bir neşter çalıştırın. </li><li> Neşter kullanarak, kafatası yan ve arka boyunca herhangi bir aşırı doku veya kas kazınması gerekir. </li><li> Ponksiyon forseps, sadece koku ampuller rostral ve ince makas ipuçları karşılamak için küçük bir delik oluşturmak orta hatta kafatası. </li><li> Ince makas, bu deliğin içine yerleştirin ve yaklaşık uzunluğu koku ampuller lateral medial bir kesi yapmak. Bu kesim, burun kemik ve frontal kemik kesiştiği kafatası kırmak ve makas için iyi erişim sağlayacak. </li><li> Altta yatan doku zarar görmesini önlemek için, beyin uzak açılı makas ipuçları tutmak için emin olun kafatası (dorsal orta hat) sagital sütür boyunca kesin. </li><li> Beyin yavaşça ortaya çıkarmak için medial insizyon boyunca kemik forseps ve uzakta kabuğu kafatasını kavramak. Kafatası, küçük parçalar halinde kapalı çip ya da daha büyük bölümlerde uzak kırılabilir. Frontal, parietal interparietal ve oksipital kemiklerin tümünü kaldırmak için forseps kullanarak devam edin. </li><li> Paraflocculi (beyincik seviyesinde beynin lateral kenarlarında bulunan) her iki tarafta küresel kemikleri kısma encasing kemikleri Crack. Kemikler yavaşça çekin. </li><li> Baş baş aşağı çevirin (dorsal yüzü aşağı) ve kraniyal sinirlerin sever ve kafatası beyin çıkarmak için forseps kullanabilir. </li></ul> Tüm Mount Mikroskopi: Yetişkin Beyin <ul><li> GFP işaretlemesi yetişkin beyin floresan diseksiyon kapsamı kullanarak değerlendirin. </li><li> PBS ve diğer uygun yazılım kullanarak PictureFrame veya fotoğraf içeren bir Petri çanak beyin aktarın. </li></ul> Tüm Mount Mikroskopi: E12.5 Embriyolar <ul><li> GFP işaretlemesi için tüm montaj embriyolar floresan diseksiyon kapsamı kullanarak değerlendirin. </li><li> PBS ve diğer uygun yazılım kullanarak PictureFrame veya fotoğraf içeren bir Petri kabı bütün montaj pozitif GFP bu aktarın. </li><li> Forseps kullanımı, her embriyo küçük bir parça kuyruk çimdik PCR tüp içinde her parçanın yeri ve genotip tüm montaj analizi ile görülen sonuçları doğrulamak için, her iki allel için PCR (Ellisor 2009) kullanarak doku. </li></ul> Mikro-disseksiyon ve eksplant hazırlama E12.5 embriyolar ventral mezensefalon <ul><li> Diseksiyonu takiben rahim zinciri ve idbütün montaj floresan, buz gibi bir hücre kültürü çanak steril PBS transfer embriyolar kader eşlemeli embriyoların entification. </li><li> Rhombomere 1 kaudal enine kesme embriyonun baş kısmı, ince makas kullanarak, çıkarın. </li><li> Sonra, diensefalon aracılığıyla koronal kesilmiş baş rostral bölümü çıkarın. Bu bir tüp benzeri yapı mezensefalik vezikül dorsal ve ventral dokular arasında bir kanal ile 4. ventrikül gösterecektir </li><li> Makas ipuçlarını dikkatli bir şekilde, dorsal orta hat boyunca rostral için kaudal 4. ventrikül ve snip, tam bir "açık-kitap" hazırlanması oluştururken, tüp açma takın. Mezensefalon iki dorsal yarısı yanal bulunacağı ventral mezensefalon mediale maruz olacaktır. </li><li> Ventral doku için daha kesin bir dille yatıyordu mezensefalon altında kalan non-nöral doku çıkarın. Eğer gerekirse, eksplant dorsal "kanatlarını" de düz koymak olacağını rostral ve kaudal yönleriyle çentikler olun. Eksplant "dorsal mezensefalon kanatları temsil eden bir kelebek, ve rhombomere 1 kuyruk benzer. </li><li> Ventral mezensefalon FACS analiz veya hücre kültürü deneyleri için daha fazla izole etmek için, doku lateral (dorsal) çıkarın. </li></ul> Temsilcisi Sonuçlar: Bu GIFM deneyde, Wnt1-ifade hücreleri kalıcı ve heritably E8.5 Wnt1-CreERT tamoksifen idare tarafından embriyogenez sırasında belirgin mGFP embriyolar. Daha sonra bu işaretlenmiş hücreler hücreleri sinir yapılarının gelişme karşısında nasıl katkıda Wnt1-kökenli belirlemek için tüm montaj floresan ve bölüm immünhistokimya ile görüntülendi. Tüm montaj floresan mGFP muhabiri membran bağlı GFP bileşeni dayanmaktadır ve bu nedenle hücresel bilgilerin yanı sıra, Wnt1-kaynaklı nöral projeksiyonlar görüşünü sağlar . Örneğin, öncelikle, orta beyin, arka arka beyin ve omurilik (Şekil 1A) E12.5 sergi GFP floresan E8.5, Wnt1 CreERTmGFP embriyolar tamoksifen . Yüksek büyütmede, ince nöronal projeksiyonları, orta beyin, vücut duvar, kol, bacak ve kraniyofasiyal bölge innerve görülür. Bu gelişimsel aşamada, embriyo şeffaf ve iç GFP etiketleme kolayca ayırt edilir. Ancak, beyin geliştikçe, olgun doku yoğunluğu iç beyin yapıları kaynaklanan GFP floresan gizler. Bu nedenle, E8.5 tamoksifen, sadece küçük GFP etiketleme tüm montaj floresans (Şekil 1C, içerlek) yetişkin üstün colliculi görülmektedir. Buna ek olarak, bazı aksonal projeksiyonlar Beyin ventral yüzeyi boyunca akan (gösterilmemiştir) görülmektedir. Buna karşılık, tamoxifen E9.5 verildiğinde, önemli GFP etiketleme tüm inferior colliculi (Şekil 1B, içerlek) boyunca oluşur. Bütün montaj floresan Bu artış gösterebilir Wnt1 ifade E9.5 az hücreler dorsal orta beyin yüzeysel bölgelere daha E8.5 gelen Wnt1 ifade hücrelerden daha önemli ölçüde katkıda bulunan veya bu bölgede daha fazla süreçleri uzatmak . Ne olursa olsun, tüm montaj floresan bu fark gelişimi sırasında Wnt1 ifade dinamik doğasını yansıtır ve GIFM olgun yetişkin içine embriyo farklı hücre popülasyonlarının izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Wnt1-CreERT immünohistokimya, kader eşlenen doku kesitlerinde; mGFP hayvanlar hücresel düzeyde analiz edilmektedir. GFP ve β-galaktosidaz (β-gal) karşı antikorlar, sinir yapıları ve hücre tipleri Wnt1 soy ince çaplı hücresel katkısını belirlemek için çeşitli doku spesifik biyobelirteçleri bir ile birlikte kullanılır . E12.5 az E8.5 tamoksifen ve doku analizleri ile çift pozitif hücrelerin (GFP + ve β-gal +), ventral orta beyin (Şekil 1B) dolaşmakta projeksiyonları ile orta beyin ve arka boyunca gözlenir. E8.5 işaretlenmiş Wnt1 soy yetişkin beyin superior ve inferior colliculi yanı sıra, ventral tegmental alan ve substantia nigra (Şekil 1D) dopaminerjik hücre popülasyonlarının çevresinde (bkz. dahil olmak üzere pek çok orta beyin yapıları doğurur 2004) Zervas. Buna karşılık, E9.5 işaretlenmiş Wnt1 soy aşağı colliculi dopaminerjik hücre popülasyonlarının (Şekil 1F) çevresinde nöronların yanı sıra yol açmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Wnt1-kaderi haritalama Temsilcisi Sonuçları: Wnt1-CreERT tüm montaj ve immünhistokimya sonuçları Örnekler; mGFP embriyo ve yetişkin beyinlerini kaderi E8.5 (AD) eşlenen (işaretli)E9.5 (EF). A. Wnt 1-CreER, öncelikle orta beyin E12.5 sergi GFP floresan (Mb), arka arka beyin (Hb) ve spinal kord (Sp) mGFP embriyolar. B. İşaretli hücreleri görüntülendi ve bu 1 mikron kalınlığında optik bölümü (40x amacı, z-serisi satın alma) gösterildiği gibi immünohistokimya ile hücresel düzeyde analiz. Nükleer β-galaktosidaz (nβ galon) antikor etiketleme (kırmızı) ve GFP antikor etiketleme (yeşil), ventral orta beyindeki gösterilen kaderi eşleşmiş hücrelere gösterir. Burada yeniden birleştirilmesi, hücreleri koşullu mGFP muhabiri doğası nedeniyle (nβ-gal + / GFP +) çift pozitif. C. Tüm montaj floresans mikroskopisi yetişkin üstün colliculi (SC) (inset) soluk GFP floresan ortaya koymaktadır. (C) düşük büyütme yetişkin bölümlerde E8.5 işaretlenmiş Wnt1 soy Değerlendirilmesi (5X) mikroskopi Wnt1 soyu (SC), üstün ve aşağı (IC) colliculi de dahil olmak üzere orta beyin yapıları sebebiyet verdiğini ortaya koymaktadır. D. A nβ-gal + hücreleri ve zengin bir GFP + aksonal pleksus dopaminerjik nöronların çevresinde ventral orta beyin alınan 40x, 1 mm optik bölüm. E. kolayca bütün montaj floresan (inset) tarafından Ortabeyin inferior colliculus gözlenen önemli GFP etiketleme E9.5 sonuçları Markalama. Düşük büyütme (5X) mikroskobu (E) görüldüğü gibi yetişkin bölümler (β-gal +, kırmızı) E9.5 işaretlenmiş Wnt1 soy inferior colliculus (dorsal-arka orta beyin) yoğunlaşmıştır. F. A nβ-gal + hücreleri ve zengin bir GFP + aksonal pleksus dopaminerjik nöronların çevresinde ventral orta beyin alınan 40x, 1 mm optik bölüm. E8.5 karşı E9.5 işaretlenmiş Wnt1-türevli nöronlar ventral orta beyin katkıda Wnt1 soy devam ederken, kademeli olarak, dorsal orta beyin katkıda sınırlı .

<ol><li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li>
<li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li>
</ol>

Tüm yazarlar eşit olarak bu çalışmaya katkıda bulundu ve alfabetik olarak sıralanmıştır. Veya video makalede onun katılımı ile her bireyin katkısı açıktır.

Olduklarını ortaya koyduk GIFM sistemi geniş bir yelpazede hücresel süreçlerin çeşitli soruları cevaplamak için kullanılacak. Örneğin, farklı Cre sürücüleri ile mühendislik fareler, herhangi bir hücre tipi, doku veya ilgi genetik soy hedef kullanılabilir. Buna ek olarak, tamoksifen embriyonik ya da doğum sonrası herhangi bir zaman noktasında idare olabilir, çünkü, rekombinasyon, ilgili herhangi bir gelişme aşamasına hedef olabilir. Bu sistemin mekansal ve zamansal kontrol belirli genleri ifade hücrelerinin gelişimi sıra...

genetik Đndüklenebilir kader haritalama pratik bir yaklaşım: hücreler mark ve track görsel bir rehberi in vivo</em

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Kader haritalar atalarıdır, gelişmekte olan ve yetişkin doku özel yapılar ve hücre tiplerinin nasıl katkıda belirlemek için, in vivo hücre işaretleme ve izleme tarafından üretilir. Bu kavramı bir ilerleme genetik soy dayalı kaderi haritaları oluşturmak için, F, M aritalandırma (GIFM) gen ekspresyonu, hücre kaderi, ve in vivo hücre davranışları birbirine bağlayan yedik nducible, G enetic. GIFM patlatır X-CreER hatları burada X, değiştirilmiş bir bakteriyofaj protein, Cre recombinase (CreER T) mekansal ifade bahşeder gen ya da gen düzenleyici elemanlar bir set. CreER T, T CreER kılan bir değiştirilmiş bir e strogen r eceptor ligand bağlayıcı etki alanı içeren ilaç tamoksifen yokluğunda sitoplazma saklamış. LoxP siteleri tarafından çevrili DNA dizilimleri arasındaki çekirdek ve aracılık rekombinasyon translocates tamoksifen bültenleri CreER T, bağlayıcı değildir. LoxP bir muhabir gibi GFP geninin önceki kaset Dur çevrili arasında GIFM, rekombinasyon genellikle oluşur. Fare, bir bölge veya hücre tipine özgü CreER ve koşullu bir muhabir aleli içeren cins vardır . Muhabir Durdur kaset muhabir gen transkripsiyonu önler, çünkü tedavi görmeyen farelere işaretleme olmayacaktır. CreER T serbest bırakılması ve muhabir Durdur kaset çıkarmadan çekirdeğine sonraki translokasyon zamansal kontrolü sağlar zamanlı hamile kadın, ağızdan sonda ile tamoksifen yönetmek. Rekombinasyon sonra, muhabir allel yapısal ve heritably ifade. Bu olaylar dizisi, bu tür hücrelerin genetik geçmişi silinmez kayıtlı olduğunu işaret ediyor. Recombined muhabiri, böylece, bir kez, başlangıçta CreER T sürmek için kullanılan gen ekspresyonu çözüldükten bir yüksek sadakat genetik soy tracer olarak hizmet vermektedir. Biz genetik soy, yetişkin hücre tipleri ve dokuların normal gelişimini ve katkısını tespit çalışma fare GIFM geçerlidir. Ayrıca hücreleri mutant genetik kökenden insan genetik bozukluklar göze çarpan özellikleri taklit karmaşık fenotipleri daha iyi anlamak için takip etmek GIFM kullanabilirsiniz. Deneysel yöntemlerle kılavuzları Bu video makalede araştırmacılar başarıyla GIFM uygulamak için. Biz iyi karakterize Wnt1-CreER T yöntemi kullanarak göstermek; E12.5 diseksiyon ve Epifloresans stereomicroscopy analiz ağızdan sonda ile embriyonik gün (E) 8.5 tamoksifen idare tarafından mGFP fareler. Ayrıca eksplant hazırlama veya FACS analiz kaderi eşlenen etki alanı mikro-incelemek ve tüm montaj floresan görüntüleme için yetişkin kader eşlenen beyinleri teşrih nasıl göstermektedir. Toplu olarak, bu işlemler, araştırmacılar, gelişim biyolojisi ve hastalık modelleri kritik soruları yanıtlamak için izin verir.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça hücreleri<em&gt; In vivo</em&gt; Ve belirli bir genetik soy hücreleri, gelişmekte olan ve yetişkin dokularda katkıda bulunmak nasıl izah etmektedir. Epifluorescent ve eksplant analizi için kader haritası E12.5 fare embriyoları için gerekli teknikleri burada gösterdi.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Kader haritaları, progenitörlerin gelişmekte olan ...'daki belirli yapılara ve hücre tiplerine nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek amacıyla, hücrelerin in vivo olarak işaretlenmesi ve izlenmesiyle oluşturulur.

Kader haritaları, progenitörlerin gelişmekte olan ve yetişkin dokulardaki belirli yapılara ve hücre tiplerine nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için hücrelerin in vivo olarak işaretlenmesi ve izlenmesiyle oluşturulur. Bu kavramdaki gelişmiş bir yöntem, genetik soyağacına dayalı kader haritaları oluşturmak için gen ifadesini, hücre davranışlarını ve in vivo süreçleri birbirine bağlayan genetikle indüklenebilir kader haritalaması veya GIFM'dir. Merhaba, ben Brown Üniversitesi'ndeki Mark Servisleri Laboratuvarı ile Moleküler Biyoloji, Hücre Biyolojisi ve Biyokimya bölümünden Deborah Ellisor.Bugün meslektaşlarım Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown ve ben, genetikle tetiklenen kader haritalama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarda bu prosedürü erken beyin gelişimini incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca bu tekniği gen inaktivasyon çalışmalarına ve insan hastalıklarının hayvan modellerine de uygulayabiliyoruz.Hadi başlayalım. X cre, E-R-M-G-F-P embriyolarında, MGFP LAE, gri ovallerle temsil edilen tüm hücrelerde bulunan bir raporlayıcı aleldir X cre, er, burada X gen düzenleyici elementleri temsil eder. C ER ekspresyonunun kontrolü, maviyle gösterilen gen X'in ekspresyon alanı ile mekansal olarak sınırlıdır ve CRE ER proteini HSP 90 tarafından sitoplazmada tutulur.Tamoksifen yokluğunda, raporlayıcı kapalı olacaktır. Tamoksifen uygulaması, CER'in HSP 90'dan salınarak çekirdeğe transloke olması ve raporlayıcı allelden stop kasetini kaldırması nedeniyle domain X'teki hücrelerin kader haritalanmasıyla sonuçlanır. Kalıcı ve kalıtsal rekombinasyon, hücrelerin sürekli olarak MG FP LA Z eksprese etmesini sağlar. Raporlayıcı allel CER ve tamoksifen kombinasyonu markalamayla sonuçlanır; bir hücre popülasyonu başlangıçta embriyonun primordial bir beyin bölgesinde gen ekspresyonuna göre markalandığında, bu kader haritalanmış hücreler, CER'i yönlendirmek için kullanılan başlangıç gen ekspresyonu söndükten sonra bile takip edilir.Bu sayede, genetik olarak tanımlanmış bir hücre soyunun yetişkin bireydeki nihai dağılımı ve terminal kaderi belirlenebilir. Bu prosedür, 20 mg/mL'lik bir tamoksifen stok çözeltisinin hazırlanmasıyla başlar; bunun için 200 mg tamoksifen, cam bir inhalasyon flakonunda 10 mL önceden ısıtılmış mısır yağı içinde çözülür.Ardından çözeltiyi bir Tator vorteks cihazında 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Hazırlanan Tamoksifen stok çözeltisini, tüpü folyo ile sararak ışıktan koruyun ve 4 °C'de saklayın. Stok çözelti bir aya kadar kullanılabilir.Kader haritalama deneyleri için, yabanı tip Swiss Webster dişi ve hem gene özgü CreER aleli hem de bir reporter aleli taşıyan bir erkekten oluşan bir çiftleştirme çifti oluşturun. Bu gösterim amacıyla, win to one CreER MG FP bir erkek kullanacağız. Swiss Webster dişiyi her sabah vajinal tıkanıklık (plug) oluşumu açısından kontrol edin.Vajinal tıkaç görülen günün sabahını koit sonrası 0,5 gün olarak belirleyin ve Tamoksifen uygulama tarihini hesaplayın. Bu deneydeki başlangıç noktasına dayanarak, Tamoksifen embriyonik gün 8,5'te uygulanacaktır. Hayvan besleme iğneli bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, 200 µL Tamoksifen stok çözeltisini çekin.Zaman ayarlı gebe Swiss Webster dişi fareyi, başını sabitlemek için ensesinden ve sırtından kavrayarak sıkıca tutun ve karnı yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Vücudun düz bir hatta kalmasını sağlamak için kuyruğu boşta kalan parmaklarınızla tutun. Ardından, besleme iğnesini ağzın köşesine yerleştirin ve iğnenin ucuna göz hizasına gelene kadar, iğneyi ağız tavanına paralel olacak şekilde nazikçe yönlendirin.Özofagusa erişmek için başı nazikçe geriye doğru eğin. İğneyi epiglotun ötesine ve özofagus boyunca mideye doğru yönlendirin. Trakeaya girmemeye dikkat edin.Besleme iğnesi mideye yerleştirildikten sonra tamoksifen uygulanır ve iğne çıkarılır. Ardından dişi hayvan, diseksiyon tarihine kadar kendi kafesine geri konur. Diseksiyon tarihinde, zamanlanmış gebe dişiden E 12.5 embriyoları diseksiy ile ayrılır ve ardından GFP işaretlemesi açısından değerlendirilir.GFP pozitif bir embriyoda, wind one kaynaklı nöronların orta beyne, arka beyne ve omuriliğe katkıda bulunduğunu gözlemliyoruz. MG FP raporlayıcısı, aksonal projeksiyonları işaretler; bu projeksiyonlar, PPS içeren bir Petri kabına home mount yöntemiyle aktarılan GFP pozitif embriyolarda da görülebilir ve bunlar picture frame kullanılarak fotoğraflanabilir. Embriyolar fotoğraflandıktan sonra, her bir embriyodan kuyruğun küçük bir parçasını pensle koparın ve her bir parçayı bir PCR tüpüne yerleştirin. Whole mount analiziyle görülen sonuçları doğrulamak için dokulardan her iki alel için PCR kullanılarak genotipleme yapılacaktır.Aşağıdaki prosedürler, kraniyotomiye başlamadan önce embriyonik bölgelerden türetilen işaretli hücrelerin yetişkin beynine nasıl yerleştiğini analiz etmemizi sağlar. Nembutal ile anestezi uygulanan farenin tamamen uyuduğu ayak kıstırma testiyle onaylanır. Kaburga kafesi üzerinden kalbe erişmek için insizyonlar yapılır.Ardından, kalbin apeksine veya sol ventrikülüne bir kelebek iğne yerleştirin ve C klemple sabitleyin. Makas yardımıyla sağ atriumda bir sıvı çıkış bölgesi oluşturun, ardından sıvı berraklaşana kadar 10 ila 15 mililitre buz gibi soğuk salin ile perfüzyon yapın. Bunu 20 ila 25 mililitre %4 paraformaldehit ile takip edin.İntrakardiyak perfüzyon tamamlandığında, omuzların hemen üzerindeki omurga boyunca keserek başı makasla çıkarın. Kafa derisini kesmek ve kafatasını açığa çıkarmak için başın dorsal orta hattı boyunca, rostralden caudal yöne doğru bir bistüri ile kesin. Bistüri kullanarak, kraniumun yan ve arka kısımlarındaki fazla doku veya kasları sıyırarak temizleyin.Bir penset yardımıyla, kafa tasını tam orta hattan, olfaktör bulbusların hemen rostralinden delin ve ince makas uçlarının sığabileceği küçük bir delik açın. İnce makasları bu deliğe yerleştirerek, olfaktör bulbusların uzunluğu boyunca orta hattan başlayarak iki adet bilateral insizyon yapın. Bu kesi, nazal kemik ile frontal kemiğin kesişme noktasında kafa tasını kıracak ve makaslar için uygun erişim sağlayacaktır.Makas uçlarını, alttaki dokuya zarar vermemek için beyinden uzağa yönlendirdiğinizden emin olarak kafatasındaki sagital sütürler boyunca kesin. Ardından, kafatasını bir pensetle nazikçe kavrayın ve beyni açığa çıkarmak için kemiği medial insizyon boyunca soyun. Kafatası küçük parçalar halinde kopabilir veya daha büyük bölümler şeklinde ayrılabilir.Frontal parietal, inter parietal ve oksipital kemiklerin tamamını çıkarmak için forseps kullanmaya devam edin. Her iki yandaki küresel kemikleri nazikçe sıkarak, beyincik seviyesinde beynin lateral kenarları boyunca yer alan para oculi yapılarını serbest bırakın. Beyin sapını çevreleyen kemiğin dorsal kısmını dikkatlice kesmek için makas kullanın.Makasın bir ucunu, omuriliğin kesildiği noktadan başlayarak beyinciğe doğru kesecek şekilde kemiğin dorsal kenarının hemen altına yerleştirin. Beyinsapını ve beyinciği serbest bırakın. Beyinsapının etrafındaki kalan kemik parçalarını pensetle temizleyin.Kemikleri nazikçe kenara çekin, başı sırt tarafı aşağı gelecek şekilde çevirin ve kranyal sinirleri kesmek ve beyni kafatasından ayırmak için pens kullanın. Beyni buz dolu bir Petri kabına yerleştirin. Soğuk PPS Floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak yetişkin beynini GFP işaretlemesi açısından değerlendirin ve çerçeve kullanarak fotoğraflayın.Bu örnekte, embriyogenez sırasında soy hattı analizi için kullanımına ek olarak orta beyin GFP ile işaretlenmiştir ve yetişkin GIFM, mikrodissection ve doku eksplant deneyleri gibi gelişimsel biyolojide yaygın olarak kullanılan diğer uygulamalarla birleştirilebilir. Örneğin, ventral mezensefalon, wind one genini eksprese eden gelişmekte olan dopamin nöronlarının progenitör bölgesidir. Bu nedenle, ventral mezensefalonun mikrodissection ile izole edilmesi, gelişimini daha detaylı incelemek için in vitro bir ortamın kurulmasına olanak tanır.Bu, genetik geçmişle tanımlanan ilgi çekici bir progenitör bölgesini izole etmek için GIFM kullanımının yalnızca bir örneğidir. Bu prosedüre başlamak için, önceden belirlenmiş GFP pozitif embriyoları ince makaslar kullanarak bir hücre kültürü kabındaki buz gibi soğuk steril PBS'ye aktarın. Bir embriyonun baş kısmını, enine keserek çıkarın.Ardından, sefalon boyunca koronal bir kesi yaparak başın rostral kısmını çıkarın. Bu işlem, dördüncü ventrikülden mezosefalik veziküle kadar olan kısmın dorsal ve ventral dokular arasında bir kanal oluşturduğu tüp benzeri bir yapıyı açığa çıkaracaktır. Makas uçlarını dikkatlice dördüncü ventriküle yerleştirin ve tüpü tamamen açarak "açık kitap" (open book) preparasyonu oluşturacak şekilde dorsal orta hat boyunca rostral yöne doğru kesin.Ventral mezensefalon şimdi medial olarak açığa çıkarılacaktır. Mezensefalonun iki dorsal yarısı lateralde kalırken, ventral mezensefalonun altındaki geri kalan tüm sinir dışı dokuların temizlenmesi gerekebilir. Hazırlanan örneğin düz bir şekilde yatması için, örnek şu an dorsal mezensefalonun kanatları, tromber merinin ise kuyruğu temsil ettiği bir kelebeğe benzemelidir.Ventral mezensefalonu faks analizi veya hücre kültürü deneyleri için daha fazla izole etmek amacıyla dokunun lateral kısımlarını çıkarın. Şimdi GIFM'nin bazı temsili sonuçlarını göstereceğiz. Bu deneyde, E 8.5'te işaretlenmiş WINT one eksprese eden hücreler, wint one direkt hücrelerin gelişim boyunca nöral yapılara nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için görselleştirilmiştir.Örneğin, E 12.5 evresindeki Wnt1-CreER MG FP embriyoları, öncelikle orta beyin, arka beyin posterior kısmı ve omurilikte GFP floresansı sergiler; yüksek büyütmede, orta beyin vücut duvarı, ekstremite ve kraniofasiyal bölgeyi innerve eden ince nöronal projeksiyonlar görülür. İşaretlenmiş hücreler, immünohistokimya ile hücresel düzeyde de görselleştirilebilir ve analiz edilebilir. E 8.5 evresinde Tamoksifen uygulamasıyla işaretlenmiş bir E 12.5 embriyosunun bu bir mikrometre kalınlığındaki optik kesitinde gösterildiği gibi, kırmızı renkteki nükleer beta-galaktos antikor etiketlemesi ve yeşil renkteki GFP antikor etiketlemesi, ventral orta beyinde gösterilen kader haritası çıkarılmış hücreleri belirtmektedir.Burada, erişkin beyindeki koşullu MGFP raporerinin doğası gereği birleştirilen hücreler çift pozitiftir. Olgun dokunun yoğunluğu, beynin iç yapılarından yayılan GFP floresansını gölgeleyebilir. Bu nedenle, tüm örneğin incelendiği floresans mikroskobu, erişkinin üst CUI bölgesinde kazanımı değerlendirirken yalnızca zayıf GFP floresansı ortaya koymaktadır.Yetişkin kesitlerinde düşük büyütmeli mikroskopi ile E 8.5'te işaretlenen tek bir soy hattı, WINT soy hattının superior ve inferior kollikuluslar dahil olmak üzere orta beyin yapılarını oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Dopaminerjik nöronların civarındaki ventral orta beyinden alınan bu yüksek büyütmeli görüntüde, nükleer beta-katin pozitif hücreler ve zengin bir GFP pozitif aksonal pleksus görülebilmektedir; buna karşın E 9.5'teki işaretleme, tüm mount floresan ile orta beynin inferior kollikulusunda kolayca gözlemlenen kapsamlı bir GFP etiketlemesi ile sonuçlanmaktadır. Yetişkin kesitlerinde E 9.5'te işaretlenen WINT soy hattı, düşük büyütmeli mikroskopi ile görüldüğü üzere inferior kollikulusda yoğunlaşmıştır.Dopaminergik nöronların bulunduğu ventral mezensefalondan alınan bu yüksek büyütmeli görüntüde, nükleer beta gel pozitif hücreler ve zengin bir GFP pozitif aksonal pleksus görülebilmektedir. Böylece, E 8.5 ile E 9.5 arasında işaretlenmiş Wnt1 türevli nöronlar dorsal mezensefalona katkı sağlamaktan kademeli olarak uzaklaşırken, Wnt1 soyu ventral mezensefaloa katkı sağlamaya devam etmektedir.Sizlere, in vivo ortamda hücre soyalarını işaretlemek ve izlemek için kullanılan genetik uyarılabilir kader haritalama prosedürünü göstermiş olduk. Bu yöntem, hücreleri genetik soylarına göre işaretlememize ve gen ekspresyonu sona erdikten sonra bile zaman içinde onları takip etmemize olanak tanır. Sekiz buçuk günde uygulanan tamoksifen ile, wit 1 domaininin yetişkinlerdeki tüm orta beynin yanı sıra gelişmekte olan orta beyne de katkıda bulunduğunu göstermiş olduk.Buna karşılık, wit one domain'i kısıtlandığında, dokuz buçukuncu günde tamoksifen uygulanması, embriyogenez sırasında gelişmekte olan orta beyne daha kısıtlı bir katkıye yol açar ve bu durum yetişkin döneme kadar devam eder. Bu prosedür gerçekleştirilirken, sistemin hücreleri mozaik şeklinde işaretlediği ve bu nedenle belirli bir yapıdaki her hücrenin etiketlenmeyebileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Bu durum, muhtemelen kullanılan CRE er hattından veya koşullu raporlayıcı alelden kaynaklanmaktadır.Önemli bir nokta olarak, hücre işaretlemesi mozaik olsa da mar hücrelerinin örüntüsü ve dağılımı oldukça tekrarlanabilirdir. Tamoksifenin oral gavage yoluyla uygulanmasının, intraperitoneal enjeksiyona kıyasla avantajlı olduğunu; çünkü bu yöntemin intraperitoneal boşluktaki inflamasyonu ve embriyolardaki mekanik hasarı minimize ettiğini saptadık. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

a-practical-approach-to-genetic-inducible-fate-mapping-visual-guide

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Bu makalede, R26R-Confetti fareleri kullanarak çok renkli bir soy izleme deneyi tasarlama ve gerçekleştirme ilkelerini açıklıyoruz. İlgilenilen diğer dokular için modifiye edilebilen kornea epitel hücrelerinin izlenmesi için özel bir protokol sunuyoruz.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed (TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

Öğrenin, GIFM tekniği ile fare embriyolarında hücre soylarını izleyerek erken beyin gelişimini ve gen inaktivasyonunu nasıl çalıştığını. Bu yöntem gelişimsel biyoloji ve sinirbilim araştırmalarında güçlü bir araçtır.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo

Daha fazla video keşfet