JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo

Full Text

17,003 Views

13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça hücreleri

Transcript

Kader haritaları, progenitörlerin gelişmekte olan ve yetişkin dokudaki belirli yapılara ve hücre tiplerine nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için hücrelerin in vivo olarak işaretlenmesi ve izlenmesiyle oluşturulur. Ve bu kavramdaki ilerleme, genetik soylara dayalı kader haritaları oluşturmak için gen ekspresyonu, sülfat ve hücre davranışlarını in vivo olarak birbirine bağlayan genetik indüklenebilir kader haritalaması veya GIFM'dir. Merhaba, benim adım Mark Services Laboratuvarı'ndan ve Brown Üniversitesi Moleküler Biyoloji, hücre biyolojisi ve biyokimya bölümünden Deborah Ellisor.

Bugün meslektaşlarım Ashley Brown, Liz Norman, Neen Hagen, Steve Brown ve ben genetik olarak indüklenebilir kader haritalaması için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarda erken beyin gelişimini incelemek için kullanıyoruz. Bu tekniği gen inaktivasyon çalışmalarına ve insan hastalığının hayvan modellerine de uygulayabiliriz.

Öyleyse başlayalım X cre, E-R-M-G-F-P embriyolarında. MGFP LAE, gri ovaller X cre ile temsil edilen tüm hücrelerde bulunan bir raportör aleldir, burada X, gen düzenleyici elementleri temsil eder. C ER ekspresyonunun kontrol edilmesi, mavi ile gösterilen gen X'in ekspresyon alanı ile uzamsal olarak sınırlıdır ve CRE ER proteini, sitoplazmada HSP 90 tarafından sekestre edilir.

Tamoksifen'in yokluğunda, muhabir kapalı olacaktır. Tamoksifen uygulaması, CER'in HSP 90'dan salınması, çekirdeğe yer değiştirmesi ve muhabir alelinden durdurma kasetini çıkarması nedeniyle, X alanındaki kader haritalanmış hücrelerle sonuçlanır. Kalıcı ve kalıtsal rekombinasyon, hücrelerin yapısal olarak MG FP LA Z eksprese etmesini sağlar.Raportör alel CER ve tamoksifen kombinasyonu, bir hücre popülasyonu başlangıçta gen ekspresyonuna dayalı olarak embriyonun ilkel bir beyin bölgesinde işaretlendiğinde işaretleme ile sonuçlanır, bu kader haritalanmış hücreler, CER'i sürmek için kullanılan ilk gen ekspresyonu söndürüldükten sonra bile izlenir.

Bu şekilde. Genetik olarak tanımlanmış bir hücre soyunun nihai dağılımı ve terminal kaderi yetişkinde tanımlanabilir. Bu prosedür, mililitre sap başına 20 miligramlık bir tamoksifen çözeltisinin hazırlanmasıyla başlar, 200 miligram tamoksifeni bir cam inhalasyon şişesinde 10 mililitre savaş öncesi mısır yağı içinde çözer.

Daha sonra çözeltiyi bir Tator girdabında iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Çözelti, şişeyi folyo ile sararak ve dört santigrat derecede saklanarak hazırlanan Tamoksifen stok çözeltisini aralıklı olarak ışıktan korur. Stok bir aya kadar kullanılabilir.

Kader haritalama deneyleri için, vahşi tip bir İsviçre Webster dişisi ve hem gene özgü bir CreER aleli hem de bir raportör aleli taşıyan bir erkekten oluşan bir üreme çifti oluşturun. Bu gösterinin amacı doğrultusunda, bir CreER MG FP erkeğine bir galibiyet kullanacağız. İsviçreli Webster kadınını her sabah vajinal tıkaç görünümü açısından kontrol edin.

Vajinal tıkaç gününün sabahını cotus'tan 0.5 gün sonra olarak belirleyin ve Tamoksifen uygulama tarihini hesaplayın. Bu deneydeki bu başlangıç noktasına dayanarak, Tamoksifen embriyonik gün 8.5'te uygulanacaktır. Hayvan besleme iğnesi ile bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, 200 mikrolitre Tamoksifen sap çözeltisi hazırlayın.

Zamanlanmış hamile Swiss Webster dişisini, başını hareketsiz hale getirmek için boynun ve sırtın kestirmesini kavrayarak sıkıca tutun ve fareyi ventral taraf yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Vücudu düz bir çizgide tutmak için kuyruğu serbest parmaklarınızın arasında tutun. Ardından, besleme iğnesini ağzın köşesine yerleştirin ve besleme iğnesinin ucu yaklaşık olarak gözün konumuna gelene kadar iğneyi ağzın çatısına paralel olarak nazikçe yönlendirin.

Yemek borusuna erişmek için başınızı hafifçe geriye doğru eğin. İğneyi epiglottan geçirin ve yemek borusundan mideye doğru yönlendirin. Soluk borusuna girmemeye dikkat edin.

Besleme iğnesi mideye girdikten sonra tamoksifeni uygulayın ve iğneyi çıkarın. Daha sonra dişiyi diseksiyon tarihine kadar ev kafesine geri koyun. Diseksiyon tarihinde, zamanlanmış gebe kadından alınan E 12.5 embriyoları serbest olarak diseke edilir ve daha sonra GFP işaretlemesi için değerlendirilir.

GFP pozitif bir embriyoda, rüzgardan türetilen nöronların orta beyne, arka beyne ve omuriliğe katkıda bulunduğunu gözlemliyoruz. MG FP muhabiri, evde GFP pozitif olan embriyoları PPS içeren bir Petri kabına transfer ederek ve bunları resim çerçevesi kullanarak fotoğraflayarak da görülebilen aksonal projeksiyonları etiketler: Embriyoların fotoğrafı çekildikten sonra, her embriyodan küçük bir kuyruk parçasını sıkıştırmak için forseps kullanın ve her parçayı bir PCR tüpüne yerleştirin. Dokular, tüm montaj analizi yoluyla görülen sonuçları doğrulamak için her iki alel için PCR kullanılarak genotiplendirilecektir.

Aşağıdaki prosedürler, embriyonik bölgelerden türetilen işaretli hücrelerin kraniyotomiye başlamadan önce yetişkin beynini nasıl doldurduğunu analiz etmemizi sağlar. Farenin tamamen innu olduğu bir ayak parmağı tutamıyla onaylandı. Nembutal ile güçlendirilen kişiler, göğüs kafesi yoluyla kalbe erişim sağlamak için kesiler yaparlar.

Daha sonra kalbin tepesine veya sol ventrikülüne bir kelebek iğne yerleştirin ve C kelepçesi ile sabitleyin. Makasla sağ atriyumda bir sıvı çıkış yeri oluşturun, ardından sıvı berraklaşana kadar 10 ila 15 mililitre buz gibi tuzlu su ile perfüzasyon yapın. Bunu 20 ila 25 mililitre% 4 paraform aldehit takip eder.

İntrakardiyak profüzyon tamamlandığında, omuzların hemen üzerindeki omurgayı keserek başı makasla çıkarın. Başın dorsal orta hattı boyunca bir neşter çalıştırın, kafa derisini kesmek ve S kafatasını ortaya çıkarmak için rostral de cottle. Neşteri kullanarak, kafatasının yan ve arka tarafındaki fazla doku veya kasları kazıyın.

Forseps ile kafatasını orta hatta delin, sadece koku soğancıklarına rostral yapın ve ince makasın uçlarını yerleştirmek için küçük bir delik oluşturun. İnce makası bu deliğe sokun ve koku ampullerinin uzunluğunu takip ederek orta hattan iki taraflı kesi yapın. Bu kesi, burun kemiği ile ön kemiğin kesiştiği noktada kafatasını kıracak ve makas için iyi bir erişim sağlayacaktır.

Kafatasındaki sagital dikişleri kesin, alttaki dokuya zarar vermemek için makas uçlarını beyinden uzak tuttuğunuzdan emin olun. Daha sonra, kafatasını forseps ile nazikçe kavrayın ve beyni açığa çıkarmak için medial insizyon boyunca kemiği soyun. Kafatası küçük parçalar halinde parçalanabilir veya daha büyük bölümler halinde kırılabilir.

Tüm frontal parietal, inter parietal ve oksipital kemikleri çıkarmak için forsepsleri kullanmaya devam edin. Beynin yan kenarları boyunca yer alan para oculi'yi, her iki taraftaki küresel kemikleri nazikçe sıkıştırarak beyincik seviyesinde serbest bırakın. Beyin sapını çevreleyen kemiğin sırt kısmını dikkatlice kesmek için makas kullanın.

Makasın bir tarafını, omuriliğin kesildiği yerden başlayarak beyinciğe doğru keserek kemiğin sırt kenarının hemen altına sokun. Beyin sapını ve beyinciği serbest bırakmak için. Forseps ile beyin sapının etrafından kalan kemiği çıkarın.

Kemikleri nazikçe çekin, başın sırt tarafını aşağı çevirin ve kraniyal sinirleri koparmak ve beyni kafatasından çıkarmak için forsepsleri kullanın. Beyni bir Petri buz kabına yerleştirin. Soğuk PPS Floresan diseksiyon dürbünü kullanarak yetişkin beynini GFP işaretlemesi için değerlendirin ve resim çerçevesi kullanarak fotoğraf çekin.

Bu örnekte, orta beyin, embriyogenez sırasında soy analizi için kullanımına ek olarak GFP ile işaretlenmiştir ve yetişkin GIFM, mikro diseksiyon ve doku eksplant deneyleri gibi gelişimsel biyolojide yaygın olarak kullanılan diğer uygulamalarla birleştirilebilir. Örneğin, ventral mezensefalon, rüzgar genini ifade eden dopamin nöronlarının geliştirilmesi için progenitör bölgedir. Bu nedenle, ventral mezensefalonun mikro diseksiyon ile izole edilmesi, gelişimini daha fazla araştırmak için in vitro bir ortamın oluşturulmasına izin verir.

Bu, genetik tarih tarafından tanımlanan bir progenitör ilgi bölgesini izole etmek için GIFM kullanmanın sadece bir örneğini temsil eder. Bu işleme başlamak için, daha önce tanımlanmış GFP pozitif embriyoları ince makas kullanarak bir hücre kültürü kabında buz gibi steril PBS'ye aktarın. Bir embriyonun baş kısmını, rommy'ye enine kesilmiş olarak çıkarın.

Bir sonra, başın rostral kısmını sefalondan bir koronal kesim ile çıkarın. Bu, mezosefalik vezikül yoluyla dördüncü ventrikülün dorsal ve ventral dokular arasında bir kanal oluşturduğu tüp benzeri bir yapıyı ortaya çıkaracaktır. Makas uçlarını dikkatlice dördüncü ventriküle yerleştirin ve tüpü tamamen açarak rostral ile donanmış dorsal orta hat boyunca kesin, açık bir kitap hazırlığı oluşturun.

Ventral mezensefalon şimdi medial olarak açığa çıkacaktır. Mezensefalonun iki dorsal yarısı yanal olarak bulunurken, ventral mezensefalonun altında kalan nöral olmayan dokuların çıkarılması gerekebilir. Explan'ın düz durması için, explan'ın şimdi dorsal mezensefalonun kanatları temsil ettiği ve trombonun sadece kuyruğu temsil ettiği bir kelebeğe benzemesi gerekir.

Faks analizi veya hücre kültürü deneyleri için ventral mezensefalonu daha fazla izole etmek için, dokunun yanal yönlerini çıkarın. Şimdi GIFM'nin bazı temsili sonuçlarını göstereceğiz. Bu deneyde, E 8.5 ile işaretlenmiş WINT bir eksprese eden hücreler, bir doğrudan hücrenin gelişim boyunca nöral yapılara nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için görselleştirilmiştir.

Örneğin, E 12.5'te bir C EER MG FP embriyosu, yüksek büyütmede öncelikle orta beyin, arka beyin ve omurilikte GFP floresan sergiler, ince nöronal projeksiyonlar innerve edici olarak görülür. Orta beyin, vücut duvarı, uzuv ve kraniyal yüz bölgesi işaretli hücreler de immünohistokimya ile hücresel düzeyde görüntülenebilir ve analiz edilebilir. Gösterildiği gibi, E 8.5'te Tamoksifen uygulaması ile işaretlenmiş bir E 12.5 embriyosunun bir mikrometre kalınlığındaki optik kesiti, kırmızı nükleer beta galakto antikor etiketlemesi ve yeşil GFP antikor etiketlemesi, ventral orta beyinde gösterilen kader haritalanmış hücreleri gösterir.

Burada, yetişkin beynindeki koşullu MGFP raportörünün doğası nedeniyle birleştirilmiş hücreler çift pozitiftir. Olgun dokunun yoğunluğu, iç beyin yapılarından yayılan GFP floresansını gizleyebilir. Bu nedenle, tam montajlı floresan mikroskobu, kazancı değerlendiren yetişkinin üstün CUI'sinde yalnızca zayıf GFP floresansını ortaya çıkarır.

Düşük büyütme mikroskobu ile yetişkin bölümlerinde E 8.5'te işaretlenen bir soy, WIN bir soyunun, üst ve alt cui dahil olmak üzere orta beyin yapılarına yol açtığını ortaya koymaktadır. Dopaminerjik nöronların yakınındaki ventral orta beyinden alınan bu daha yüksek büyütme görüntüsünde, nükleer beta kal pozitif hücreler ve zengin bir GFP pozitif aksonal pleksus, E 9.5'te kontrast işaretleme görülebilir, bu da orta beynin alt kolusunda tüm floresan ile kolayca gözlenen önemli GFP etiketlemesi ile sonuçlanır. Yetişkin bölümlerinde E 9.5'te işaretlenen WINT bir soy, düşük büyütme mikroskobu ile görüldüğü gibi alt kauluda yoğunlaşmıştır.

Dopaminerjik nöronların ventral orta beyinden alınan bu yüksek büyütmeli görüntüde nükleer beta jel pozitif hücreler ve zengin GFP pozitif aksonal pleksus görülebilir. Bu nedenle, E 8.5'e karşı E 9.5 olarak işaretlenmiş bir türetilmiş nöronların dorsal orta beyne katkıda bulunması giderek kısıtlanır. WIN bir soyu, ventral orta beyne katkıda bulunmaya devam eder.

Hücre soylarını in vivo olarak işaretlemek ve izlemek için genetik olarak indüklenebilir kader haritalama prosedürünü size gösterdik. Bu, hücreleri genetik soylarına göre işaretlememize ve gen ekspresyonu söndükten sonra bile zaman içinde onları izlememize olanak tanır. Sekiz buçukta uygulanan tamoksifen ile, bir wit alanının, yetişkinlerde tüm orta beyne ek olarak gelişmekte olan orta beyne katkıda bulunduğunu gösterdik.

Buna karşılık, bir alan kısıtlandığında dokuz buçukta tamoksifen uygulamak, embriyogenez sırasında gelişmekte olan orta beyne daha sınırlı bir katkı sağlar ve bu da yetişkine kadar devam eder. Bu prosedürü yaparken, sistemin hücreleri mozaik olarak işaretlediğini ve bu nedenle belirli bir yapıdaki her hücrenin etiketlenemeyeceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bunun nedeni büyük olasılıkla CRE er hattı veya kullanılmakta olan koşullu raportör alelidir.

Daha da önemlisi, hücre işaretlemesi mozaik olmasına rağmen, mar hücrelerinin modeli ve dağılımı yüksek oranda tekrarlanabilir. Oral gavaj ile tamoksifen uygulamasının, interperitoneal boşluktaki iltihabı ve embriyolardaki mekanik hasarı en aza indirdiği için İnterperitoneal enjeksiyon ile uygulamaya kıyasla avantajlı olduğunu bulduk. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

Explore More Videos

Gelişimsel Biyoloji Sayı 34 nörogelişimsel genetik genetik indüklenebilir kaderi haritalama (GIFM) immün fare embriyo GIFM soy tracer kader haritalama