Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo

Kader haritaları, progenitörlerin gelişmekte olan ve yetişkin dokulardaki belirli yapılara ve hücre tiplerine nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için hücrelerin in vivo olarak işaretlenmesi ve izlenmesiyle oluşturulur. Bu kavramdaki gelişmiş bir yöntem, genetik soyağacına dayalı kader haritaları oluşturmak için gen ifadesini, hücre davranışlarını ve in vivo süreçleri birbirine bağlayan genetikle indüklenebilir kader haritalaması veya GIFM'dir. Merhaba, ben Brown Üniversitesi'ndeki Mark Servisleri Laboratuvarı ile Moleküler Biyoloji, Hücre Biyolojisi ve Biyokimya bölümünden Deborah Ellisor.

Bugün meslektaşlarım Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown ve ben, genetikle tetiklenen kader haritalama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarda bu prosedürü erken beyin gelişimini incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca bu tekniği gen inaktivasyon çalışmalarına ve insan hastalıklarının hayvan modellerine de uygulayabiliyoruz.

Hadi başlayalım. X cre, E-R-M-G-F-P embriyolarında, MGFP LAE, gri ovallerle temsil edilen tüm hücrelerde bulunan bir raporlayıcı aleldir X cre, er, burada X gen düzenleyici elementleri temsil eder. C ER ekspresyonunun kontrolü, maviyle gösterilen gen X'in ekspresyon alanı ile mekansal olarak sınırlıdır ve CRE ER proteini HSP 90 tarafından sitoplazmada tutulur.

Tamoksifen yokluğunda, raporlayıcı kapalı olacaktır. Tamoksifen uygulaması, CER'in HSP 90'dan salınarak çekirdeğe transloke olması ve raporlayıcı allelden stop kasetini kaldırması nedeniyle domain X'teki hücrelerin kader haritalanmasıyla sonuçlanır. Kalıcı ve kalıtsal rekombinasyon, hücrelerin sürekli olarak MG FP LA Z eksprese etmesini sağlar. Raporlayıcı allel CER ve tamoksifen kombinasyonu markalamayla sonuçlanır; bir hücre popülasyonu başlangıçta embriyonun primordial bir beyin bölgesinde gen ekspresyonuna göre markalandığında, bu kader haritalanmış hücreler, CER'i yönlendirmek için kullanılan başlangıç gen ekspresyonu söndükten sonra bile takip edilir.

Bu sayede, genetik olarak tanımlanmış bir hücre soyunun yetişkin bireydeki nihai dağılımı ve terminal kaderi belirlenebilir. Bu prosedür, 20 mg/mL'lik bir tamoksifen stok çözeltisinin hazırlanmasıyla başlar; bunun için 200 mg tamoksifen, cam bir inhalasyon flakonunda 10 mL önceden ısıtılmış mısır yağı içinde çözülür.

Ardından çözeltiyi bir Tator vorteks cihazında 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Hazırlanan Tamoksifen stok çözeltisini, tüpü folyo ile sararak ışıktan koruyun ve 4 °C'de saklayın. Stok çözelti bir aya kadar kullanılabilir.

Kader haritalama deneyleri için, yabanı tip Swiss Webster dişi ve hem gene özgü CreER aleli hem de bir reporter aleli taşıyan bir erkekten oluşan bir çiftleştirme çifti oluşturun. Bu gösterim amacıyla, win to one CreER MG FP bir erkek kullanacağız. Swiss Webster dişiyi her sabah vajinal tıkanıklık (plug) oluşumu açısından kontrol edin.

Vajinal tıkaç görülen günün sabahını koit sonrası 0,5 gün olarak belirleyin ve Tamoksifen uygulama tarihini hesaplayın. Bu deneydeki başlangıç noktasına dayanarak, Tamoksifen embriyonik gün 8,5'te uygulanacaktır. Hayvan besleme iğneli bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, 200 µL Tamoksifen stok çözeltisini çekin.

Zaman ayarlı gebe Swiss Webster dişi fareyi, başını sabitlemek için ensesinden ve sırtından kavrayarak sıkıca tutun ve karnı yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Vücudun düz bir hatta kalmasını sağlamak için kuyruğu boşta kalan parmaklarınızla tutun. Ardından, besleme iğnesini ağzın köşesine yerleştirin ve iğnenin ucuna göz hizasına gelene kadar, iğneyi ağız tavanına paralel olacak şekilde nazikçe yönlendirin.

Özofagusa erişmek için başı nazikçe geriye doğru eğin. İğneyi epiglotun ötesine ve özofagus boyunca mideye doğru yönlendirin. Trakeaya girmemeye dikkat edin.

Besleme iğnesi mideye yerleştirildikten sonra tamoksifen uygulanır ve iğne çıkarılır. Ardından dişi hayvan, diseksiyon tarihine kadar kendi kafesine geri konur. Diseksiyon tarihinde, zamanlanmış gebe dişiden E 12.5 embriyoları diseksiy ile ayrılır ve ardından GFP işaretlemesi açısından değerlendirilir.

GFP pozitif bir embriyoda, wind one kaynaklı nöronların orta beyne, arka beyne ve omuriliğe katkıda bulunduğunu gözlemliyoruz. MG FP raporlayıcısı, aksonal projeksiyonları işaretler; bu projeksiyonlar, PPS içeren bir Petri kabına home mount yöntemiyle aktarılan GFP pozitif embriyolarda da görülebilir ve bunlar picture frame kullanılarak fotoğraflanabilir. Embriyolar fotoğraflandıktan sonra, her bir embriyodan kuyruğun küçük bir parçasını pensle koparın ve her bir parçayı bir PCR tüpüne yerleştirin. Whole mount analiziyle görülen sonuçları doğrulamak için dokulardan her iki alel için PCR kullanılarak genotipleme yapılacaktır.

Aşağıdaki prosedürler, kraniyotomiye başlamadan önce embriyonik bölgelerden türetilen işaretli hücrelerin yetişkin beynine nasıl yerleştiğini analiz etmemizi sağlar. Nembutal ile anestezi uygulanan farenin tamamen uyuduğu ayak kıstırma testiyle onaylanır. Kaburga kafesi üzerinden kalbe erişmek için insizyonlar yapılır.

Ardından, kalbin apeksine veya sol ventrikülüne bir kelebek iğne yerleştirin ve C klemple sabitleyin. Makas yardımıyla sağ atriumda bir sıvı çıkış bölgesi oluşturun, ardından sıvı berraklaşana kadar 10 ila 15 mililitre buz gibi soğuk salin ile perfüzyon yapın. Bunu 20 ila 25 mililitre %4 paraformaldehit ile takip edin.

İntrakardiyak perfüzyon tamamlandığında, omuzların hemen üzerindeki omurga boyunca keserek başı makasla çıkarın. Kafa derisini kesmek ve kafatasını açığa çıkarmak için başın dorsal orta hattı boyunca, rostralden caudal yöne doğru bir bistüri ile kesin. Bistüri kullanarak, kraniumun yan ve arka kısımlarındaki fazla doku veya kasları sıyırarak temizleyin.

Bir penset yardımıyla, kafa tasını tam orta hattan, olfaktör bulbusların hemen rostralinden delin ve ince makas uçlarının sığabileceği küçük bir delik açın. İnce makasları bu deliğe yerleştirerek, olfaktör bulbusların uzunluğu boyunca orta hattan başlayarak iki adet bilateral insizyon yapın. Bu kesi, nazal kemik ile frontal kemiğin kesişme noktasında kafa tasını kıracak ve makaslar için uygun erişim sağlayacaktır.

Makas uçlarını, alttaki dokuya zarar vermemek için beyinden uzağa yönlendirdiğinizden emin olarak kafatasındaki sagital sütürler boyunca kesin. Ardından, kafatasını bir pensetle nazikçe kavrayın ve beyni açığa çıkarmak için kemiği medial insizyon boyunca soyun. Kafatası küçük parçalar halinde kopabilir veya daha büyük bölümler şeklinde ayrılabilir.

Frontal parietal, inter parietal ve oksipital kemiklerin tamamını çıkarmak için forseps kullanmaya devam edin. Her iki yandaki küresel kemikleri nazikçe sıkarak, beyincik seviyesinde beynin lateral kenarları boyunca yer alan para oculi yapılarını serbest bırakın. Beyin sapını çevreleyen kemiğin dorsal kısmını dikkatlice kesmek için makas kullanın.

Makasın bir ucunu, omuriliğin kesildiği noktadan başlayarak beyinciğe doğru kesecek şekilde kemiğin dorsal kenarının hemen altına yerleştirin. Beyinsapını ve beyinciği serbest bırakın. Beyinsapının etrafındaki kalan kemik parçalarını pensetle temizleyin.

Kemikleri nazikçe kenara çekin, başı sırt tarafı aşağı gelecek şekilde çevirin ve kranyal sinirleri kesmek ve beyni kafatasından ayırmak için pens kullanın. Beyni buz dolu bir Petri kabına yerleştirin. Soğuk PPS Floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak yetişkin beynini GFP işaretlemesi açısından değerlendirin ve çerçeve kullanarak fotoğraflayın.

Bu örnekte, embriyogenez sırasında soy hattı analizi için kullanımına ek olarak orta beyin GFP ile işaretlenmiştir ve yetişkin GIFM, mikrodissection ve doku eksplant deneyleri gibi gelişimsel biyolojide yaygın olarak kullanılan diğer uygulamalarla birleştirilebilir. Örneğin, ventral mezensefalon, wind one genini eksprese eden gelişmekte olan dopamin nöronlarının progenitör bölgesidir. Bu nedenle, ventral mezensefalonun mikrodissection ile izole edilmesi, gelişimini daha detaylı incelemek için in vitro bir ortamın kurulmasına olanak tanır.

Bu, genetik geçmişle tanımlanan ilgi çekici bir progenitör bölgesini izole etmek için GIFM kullanımının yalnızca bir örneğidir. Bu prosedüre başlamak için, önceden belirlenmiş GFP pozitif embriyoları ince makaslar kullanarak bir hücre kültürü kabındaki buz gibi soğuk steril PBS'ye aktarın. Bir embriyonun baş kısmını, enine keserek çıkarın.

Ardından, sefalon boyunca koronal bir kesi yaparak başın rostral kısmını çıkarın. Bu işlem, dördüncü ventrikülden mezosefalik veziküle kadar olan kısmın dorsal ve ventral dokular arasında bir kanal oluşturduğu tüp benzeri bir yapıyı açığa çıkaracaktır. Makas uçlarını dikkatlice dördüncü ventriküle yerleştirin ve tüpü tamamen açarak "açık kitap" (open book) preparasyonu oluşturacak şekilde dorsal orta hat boyunca rostral yöne doğru kesin.

Ventral mezensefalon şimdi medial olarak açığa çıkarılacaktır. Mezensefalonun iki dorsal yarısı lateralde kalırken, ventral mezensefalonun altındaki geri kalan tüm sinir dışı dokuların temizlenmesi gerekebilir. Hazırlanan örneğin düz bir şekilde yatması için, örnek şu an dorsal mezensefalonun kanatları, tromber merinin ise kuyruğu temsil ettiği bir kelebeğe benzemelidir.

Ventral mezensefalonu faks analizi veya hücre kültürü deneyleri için daha fazla izole etmek amacıyla dokunun lateral kısımlarını çıkarın. Şimdi GIFM'nin bazı temsili sonuçlarını göstereceğiz. Bu deneyde, E 8.5'te işaretlenmiş WINT one eksprese eden hücreler, wint one direkt hücrelerin gelişim boyunca nöral yapılara nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için görselleştirilmiştir.

Örneğin, E 12.5 evresindeki Wnt1-CreER MG FP embriyoları, öncelikle orta beyin, arka beyin posterior kısmı ve omurilikte GFP floresansı sergiler; yüksek büyütmede, orta beyin vücut duvarı, ekstremite ve kraniofasiyal bölgeyi innerve eden ince nöronal projeksiyonlar görülür. İşaretlenmiş hücreler, immünohistokimya ile hücresel düzeyde de görselleştirilebilir ve analiz edilebilir. E 8.5 evresinde Tamoksifen uygulamasıyla işaretlenmiş bir E 12.5 embriyosunun bu bir mikrometre kalınlığındaki optik kesitinde gösterildiği gibi, kırmızı renkteki nükleer beta-galaktos antikor etiketlemesi ve yeşil renkteki GFP antikor etiketlemesi, ventral orta beyinde gösterilen kader haritası çıkarılmış hücreleri belirtmektedir.

Burada, erişkin beyindeki koşullu MGFP raporerinin doğası gereği birleştirilen hücreler çift pozitiftir. Olgun dokunun yoğunluğu, beynin iç yapılarından yayılan GFP floresansını gölgeleyebilir. Bu nedenle, tüm örneğin incelendiği floresans mikroskobu, erişkinin üst CUI bölgesinde kazanımı değerlendirirken yalnızca zayıf GFP floresansı ortaya koymaktadır.

Yetişkin kesitlerinde düşük büyütmeli mikroskopi ile E 8.5'te işaretlenen tek bir soy hattı, WINT soy hattının superior ve inferior kollikuluslar dahil olmak üzere orta beyin yapılarını oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Dopaminerjik nöronların civarındaki ventral orta beyinden alınan bu yüksek büyütmeli görüntüde, nükleer beta-katin pozitif hücreler ve zengin bir GFP pozitif aksonal pleksus görülebilmektedir; buna karşın E 9.5'teki işaretleme, tüm mount floresan ile orta beynin inferior kollikulusunda kolayca gözlemlenen kapsamlı bir GFP etiketlemesi ile sonuçlanmaktadır. Yetişkin kesitlerinde E 9.5'te işaretlenen WINT soy hattı, düşük büyütmeli mikroskopi ile görüldüğü üzere inferior kollikulusda yoğunlaşmıştır.

Dopaminergik nöronların bulunduğu ventral mezensefalondan alınan bu yüksek büyütmeli görüntüde, nükleer beta gel pozitif hücreler ve zengin bir GFP pozitif aksonal pleksus görülebilmektedir. Böylece, E 8.5 ile E 9.5 arasında işaretlenmiş Wnt1 türevli nöronlar dorsal mezensefalona katkı sağlamaktan kademeli olarak uzaklaşırken, Wnt1 soyu ventral mezensefaloa katkı sağlamaya devam etmektedir.

Sizlere, in vivo ortamda hücre soyalarını işaretlemek ve izlemek için kullanılan genetik uyarılabilir kader haritalama prosedürünü göstermiş olduk. Bu yöntem, hücreleri genetik soylarına göre işaretlememize ve gen ekspresyonu sona erdikten sonra bile zaman içinde onları takip etmemize olanak tanır. Sekiz buçuk günde uygulanan tamoksifen ile, wit 1 domaininin yetişkinlerdeki tüm orta beynin yanı sıra gelişmekte olan orta beyne de katkıda bulunduğunu göstermiş olduk.

Buna karşılık, wit one domain'i kısıtlandığında, dokuz buçukuncu günde tamoksifen uygulanması, embriyogenez sırasında gelişmekte olan orta beyne daha kısıtlı bir katkıye yol açar ve bu durum yetişkin döneme kadar devam eder. Bu prosedür gerçekleştirilirken, sistemin hücreleri mozaik şeklinde işaretlediği ve bu nedenle belirli bir yapıdaki her hücrenin etiketlenmeyebileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Bu durum, muhtemelen kullanılan CRE er hattından veya koşullu raporlayıcı alelden kaynaklanmaktadır.

Önemli bir nokta olarak, hücre işaretlemesi mozaik olsa da mar hücrelerinin örüntüsü ve dağılımı oldukça tekrarlanabilirdir. Tamoksifenin oral gavage yoluyla uygulanmasının, intraperitoneal enjeksiyona kıyasla avantajlı olduğunu; çünkü bu yöntemin intraperitoneal boşluktaki inflamasyonu ve embriyolardaki mekanik hasarı minimize ettiğini saptadık. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.