Name: Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerde yerinde subselüler fraksiyonlama yöntemiyle protein lokalizasyonunu incelemeyi. Bu teknik, immünofloresan mikroskopi ile protein dağılımını görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Anyaporn Sawasdichai ve Nazefah Abdülhamit&#39;in doktora sırasıyla Kraliyet Tayland Hükümeti ve Malezya Hükümeti minnettarız Burslar. Bu çalışma, Wellcome Trust PSJ ve KG için verilen bir proje hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, Bristol Wolfson bio Tesisi Üniversitesi minnettarız.

I. fraksiyonasyon için hazırlanması Bu bölümde, poli-L-Lizin kaplı mikroskop lamelleri ve fraksiyonasyon önce hücre eki hazırlama açıklamaktadır. Hücrelerin Gerekirse geçici eki önce veya sonra ya protein ekspresyon vektörleri ile transfekte olabilir. A. poli-L-Lizin kaplı lamelleri hazırlanması <ol><li> Distile su 1mg/ml poli-L-Lizin bir çözüm hazırlayın. </li><li> Sallanan bir platform üzerinde en az 1 saat için 22 çözüm onları kuluçka poli-L-Lizin Coat temiz lamelleri ° C </li><li> Steril distile su ile kaplı lamelleri iki kez yıkayın ve% 96 etanol ile tek bir yıkama ile takip. </li><li> Hava filtre kağıt parçası üzerinde kaplı lamelleri kuru ve kuru bir konteyner (bir kez kuru onlar yığılmış olabilir) ileride kullanmak üzere saklayın. </li></ol> Lamelleri B. takılması hücreleri Sigara yapışık hücrelere (burada K562 hücreleri kullanır) <ol><li> 6-plaka kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde çok iyi bir poli-L-Lizin kaplı lamel yerleştirin. </li><li> 7x10 5 hücre yoğunluğu Tohum K562 hücre / Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS), PS (penisilin 100units/ml, streptomisin 100mg/ml) ile desteklenebilir. K562 hücrelerinin durumda geçici transfeksiyon hücrelerin ekim önce elektroporasyon (0.4cm elektroporasyon küvetler 250V / 975μF medya 200μl 1x10 7 hücre) kullanılarak yapılabilir. </li><li> 37 ° C% 5 CO 2 hücreleri az 24 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Orta kapalı dökün ve hücreler iki kez yıkayın buz fosfat tamponlu salin (PBS). </li><li> Subselüler fraksiyonasyon protokolü ile izleyin. </li></ol> Yapışık hücrelere (burada Cos-7 hücre) <ol><li> 6 plaka iyi bir kaplanmamış lamel yerleştirin. </li><li> 37 ° C PBS içinde iki kez yıkayın prewarmed </li><li> , 37 tripsin (% 0.03 EDTA,% 0.25 'lik tripsin) PBS içinde sindirerek hücrelerin Ayır ° C'de 2 ila 5 dakika. Bu ağırlıklı olarak bireysel yüzen hücreler gibi hücrelerin aşırı sindirimi ve sindirim en kısa sürede durdurmak için önemlidir. </li><li> /% 10 FBS ve PSG (penisilin 100 ünite / ml, streptomisin 100ug/ml ve L-glutamin 292ug/ml) ile desteklenmiş DMEM 6 plaka ekim 3x10 5 hücre yoğunluğu hücreler tarafından sindirimi durdurur normal lamelleri. Yapışık hücrelere genellikle gerekirse Ancak, poli-L-Lizin kaplı lamelleri kullanılabilir, normal mikroskop lamelleri üzerine takın. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri az 24 saat süreyle inkübe edin. Cos-7 hücreleri durumda geçici transfeksiyon Fugene gerekirse 6 (Roche) ve 37, bir 24 saat daha kurtarmak için sol hücreleri kullanılarak yapılabilir ° C ve% 5 CO 2 . </li><li> Orta dökün ve hücrelerin buz PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Subselüler fraksiyonasyon protokolü ile izleyin. </li></ol> II. Subselüler fraksiyonasyon In situ fraksiyonu Şekil 1'de gösterildiği gibi şematik göre yapılır ve bir yönteme dayalı daha önce 5 açıklanan değişiklikler, daha önce 7 açıklanan ve aşağıda ayrıntılı bir protokol. Bu sıvı çıkarmadan önce lamel çıkarmadan her fraksiyonasyon adım izleyerek yeni bir 6-plaka lamelleri aktarmak için tavsiye edilir. Sadece dört lamelleri görüntüleme için gerekli olmasına rağmen, ek lamelleri, bu paralel olarak yapılacak ise batı blot tam hücre özü ve nükleer matriks kesirler üretmek için gereklidir. <ol><li> Hazırlayın ve hücre iskeletinin tampon (CSK) filtresi: 10mM BORU, 300mm Sakkaroz, 100 mM NaCl, 3mm MgCl 2, 1mm EGTA. CSK tampon fraksiyonasyon gün taze hazırlanmalıdır. </li><li> Gerekirse bir lamel hücreleri doğrudan lamel üzerine hafifçe 200ul TES tampon (% 1 SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH: 7.4) yerleştirerek ve 1 ya da 2 dakika süreyle inkübe blot batı için bütün hücre elde etmek için kullanılabilir 22 ° C Sonra 1M 250ul (NH 4) 2 SO 4 ve diğer batı örnekleri hazır olana kadar buz üzerinde inkübe ekleyerek tüm hücre özü çıkarılır ve proteinleri presipite olabilir. </li><li> 22 ° C eğerek 6 iyi plakalı iki veya üç kez kalan lamelleri, 1 ml buz PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Tüm hücre ve taze bir 6-plaka transfer temsil eden lamel çıkarın. Hücre tespit ve immuno-floresans protokol ile izleyin. </li><li> Kalan kuyulardan PBS yavaşça çıkarın. </li><li> Yavaşça 200ul CSK tampon yerleştirerek, sitoplazmik ve gevşek düzenlenen nükleer proteinlerin Özü + 0.1% (V / V) doğrudan kalan her lamel üzerine Triton X-100 ve kuluçka1 dakika boyunca buz. </li><li> Sitoplazmik ve gevşek tutulan nükleer özü çıkarın ve 2. adımda açıklandığı gibi hızlandırabilir. </li><li> 22 lamelleri 1ml buz PBS ile iki kez yıkayın ° C devirme 6 plakalı. </li><li> Sıkıca tutulan nükleer malzeme temsil lamel çıkarın ve hücre tespit ve immuno-floresans protokol ile takip. </li><li> Sonra yavaşça geri kalan kuyulardan PBS kaldırmak + 0.5% (V / V) Triton X-100 doğrudan kalan her lamel üzerine hafifçe 200ul CSK tampon yerleştirerek ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe tarafından sıkıca tutulan proteinler ayıklayın. </li><li> Sıkıca tutulan özü çıkarın ve 2. adımda açıklandığı gibi hızlandırabilir. </li><li> 22 lamelleri 1ml buz PBS ile iki kez yıkayın ° C devirme 6 plakalı. </li><li> Kromatin fraksiyonu temsil eden lamel çıkarın ve hücre fiksasyon ve immüno-floresans protokol ile takip. </li><li> CSK sonra yer 200ul tamponu + 100ug/ml DNaz I 30 dakika kalan lamelleri ve inkübe üzerine 37 ° C yavaşça kalan kuyulardan PBS kaldırmak </li><li> Kromatin özü çıkarın ve 2. adımda açıklandığı gibi hızlandırabilir. </li><li> ° C eğerek 6-plaka 22 lamelleri buz PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Nükleer matriks fraksiyonu temsil lamel çıkarın ve hücre tespit ve immuno-floresans protokol ile takip. </li><li> Gerekirse matriks proteinlerine 2. adımda açıklandığı gibi 200ul TES tampon kullanarak blot batı için ek bir matris lamel çıkarılabilir. </li><li> Western blot örnekleri, 4 masa üstü mikrosantrifüj 13000 rpm'de santrifüje tabi tutulmalıdır ° C ve 40ul SDS yükleme tamponu (62.5mm Tris-HCl, pH 6.8,% 2 SDS (w / v), 50 mM DTT, yeniden süspanse pelet % 10 gliserol, SDS-PAGE ile analiz öncesi% 0.01 Bromophenol Mavi (w / v)). <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. 10mM BORU, 300mm Sakkaroz, 100 mM NaCl, 3mm MgCl 2, 1mm EGTA yerinde Subselüler fraksiyonasyon şematik Sitoiskelet tampon (CSK) oluşur. TES tampon% 1 SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH: 7.4 oluşur. </li></ol> III. Hücre fiksasyon ve immüno-floresan <ol><li> Yavaşça 30 dakika boyunca her 4 lamel ve inkübe ° C için% 4 formaldehit / PBS 1 ml ekleyin. </li><li> Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın </li><li> , 22 ° C'de 10 dakika boyunca her lamel ve inkübe% 0,1 Triton X-100/PBS 400ul ekleyin. </li><li> Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın </li><li> Potansiyel arka plan boyama azaltmak için 20 dakika boyunca 22 ° C'de% 3 Bovine Serum Albumin (BSA) / PBS ve inkübe 400ul ekleyin. </li><li> Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın </li><li> 1 saat süreyle 22 ° C'de inkübe üzerine lamel ve PBS içinde birincil antikor Yeri 100ul. Birincil ve ikincil antikorlar gerekli konsantrasyonu PBS içinde seyreltilmelidir. Bu, kullanılan her bir antikor için optimize edilmesi gerekebilir. </li><li> Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın </li><li> 22 ° C uzakta 1 saat süreyle ışık, PBS ve inkübe ikincil antikor Yeri 200ul. </li><li> Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın </li><li> DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole hidroklorür) içeren Vectashield montaj orta kullanarak cam bir mikroskop lamı üzerine her lamel (hücre aşağı) monte edin. </li><li> Bir kağıt havlu kullanarak lamel dört bir yanından gelen aşırı montaj orta silin ve slayt ışıktan en az 30 dakika için 22 ° C'de inkübe edin. </li><li> Lamel, şeffaf akrilik tırnak cilası kullanarak cam slayt sabitleyin. </li><li> Slaytlar floresan mikroskobu ile görselleştirme önce ışıktan uzak tutun. </li></ol> IV. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Olmayan transfekte COS-7 hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon fraksiyonlara Cos-7 hücreleri formaldehit ile sabit ve DAPI içeren orta montaj ile tedavi takip TRITC için konjuge A / C antikorları kullanarak immunohistokimyasal α-tubulin, α-Histon H1 veya α-Lamin . Görüntüler Leica konfokal mikroskop kullanılarak 10x oküler lens ve 63x objektif lens ile elde edildi. Hücre çekirdeklerinin işaretleyici antikorlar ile boyanarak aynı alanda hücreleri TRITC bir filtre seti kullanılarak görüntülendi DAPI filtre seti kullanılarak görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. GFP-6E2 füzyon proteini nükleer matriks ile ilişkilidir. Insan papilloma virüsü (HPV) tip 6 erimiş yeşil floresan proteininin (GFP) oluşan bir füzyon proteini ifade Cos-7 hücre hücre içi fraksiyonasyonE2 proteininin (GFP-6E2). Transfekte hücreler GFP-6E2 lokalizasyonu GFP floresan üzerinden doğrudan görüntülenmiştir iken Hücre çekirdekleri DAPI boyama ile görüntülendi. Lamin A / C α-Lamin TRITC ve TRITC bir filtre seti konjuge A / C antikorları kullanarak görüntülendi. Birleştirme görüntüler GFP-6E2 protein bazı nükleer matriks (sağ alt panel) ile ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır. Şekil 2'de açıklandığı gibi görüntüler elde edildi.

<ol><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li>
<li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Groucho%2FTLE%2FR-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+%28CBF%28alpha%29%2FAML%2FPEBP2%28alpha%29%29+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li>
<li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li>
<li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li>
<li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ%3A+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li>
<li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li>
<li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li>
</ol>

Yaygın sorunlar ve öneriler: Hücrelerin tamamı ya da bir çoğunu yıkama sırasında kaybolur. Yıkama adımları sırasında sıvı lamel kaçınarak 6 plaka yan yavaş yavaş ilave edilmelidir. Benzer şekilde, dikkatli bir şekilde devirme levha ile sıvı kaldırıldı olmalıdır ve aşırı sıvı yavaş yavaş pipetleme. Hücre adezyon poli-L-Lizin kaplı lamelleri kullanarak artırılabilir. Genomik DNA&#39;nın tamamen sindirilmiş değildir. Bazı hücre tipleri için DNAz I sindirim adım genomik...

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Kimyasal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Kimyasal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-Lizine</td><td>Kimyasal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8920</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Kimyasal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Kimyasal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Kimyasal</td><td>VWR</td><td>284216N</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Kimyasal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Kimyasal</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Kimyasal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6876</td><td></td></tr><tr><td>DAPI içeren Kapatma Ortamı</td><td>Kimyasal</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Kimyasal</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Histon H1</td><td>Antikorlar</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-8030</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A/C</td><td>Antikorlar</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-20681</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-&amp;alpha;</td><td>Antikorlar</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-32293</td><td></td></tr></tbody></table>

yapışkan ve sigara yapışık memeli hücre yerinde subselüler fraksiyonu

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein fonksiyonu yakından protein lokalizasyonuna birleştirilmiştir. Yerinde Subselüler fraksiyonasyon bazı proteinler belirli bir konuma veya hücre içi bölmesi ile sınırlı olmasına rağmen, birçok protein, belirli bir Subselüler etki alanı veya yapısı ile sıkı sıkıya ilişkili bir alt nüfusa sahip, serbest döviz serbestçe difüzyon nüfus olarak mevcuttur. görselleştirme sağlar protein bölümlendirme ve aynı zamanda protein belirli yapılara lokalize alt-topluluklarda ortaya çıkarabilir. Örneğin, çözünür sitoplazmik proteinleri ve gevşek tutulan nükleer proteinlerin çıkarılması kromatin ile bazı transkripsiyon faktörleri istikrarlı bir ilişki ortaya çıkarabilir. DNA sonraki sindirim topluca nükleer iskele veya nükleer matriks denir protein ve RNA ağı ile birlikte, bazı durumlarda ortaya çıkarabilir. Burada, yapışık ve yapışmaz memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde fraksiyonasyon sırasında gerekli adımları açıklar . Protein görselleştirme spesifik antikorların ya da floresan füzyon proteinleri ve floresan mikroskopi kullanılarak elde edilebilir. Antikorlar ve / veya özel bölme ya da yapılar için belirteç olarak hareket floresan boyalar protein yerelleştirme ayrıntılı olarak eşlenen izin yerinde fraksiyonasyon da batı her fraksiyon protein miktarları karşılaştırmak için blot ile kombine edilebilir. Bu basit biyokimyasal yaklaşım, aksi tespit edilmemiş kalacaktı dernekler ortaya çıkarabilir.

, Memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde Subselüler fraksiyonasyon protein localisation görselleştirme sağlar .

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein fonksiyonu, protein lokalizasyonu ile yakından ilişkilidir. Bazı proteinler belirli bir konum veya hücre altı kompartıman ile sınırlı olsa da, ...

Bu prosedürün genel amacı, protein lokalizasyonunu incelemek amacıyla memeli hücrelerini in situ U şeklinde deterjanla etkilenen ve etkilenmeyen fraksiyonlara ayırmaktır. Bu işlem, öncelikle hücrelerin mikroskop lamellerine tutturulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, sitoplazmik ve çekirdekte gevşek bağlarla tutunmuş proteinlerin uzaklaştırılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, sıkıca tutunan nükleer proteinlerin uzaklaştırılmasıdır. Prosedürün son adımı ise, lamel üzerinde nükleer matrisi ve ayrışmış proteinleri bırakarak kromatin fraksiyonunu uzaklaştırmaktır. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla proteinlerin hücresel alt lokalizasyonunu ve kolokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Bristol Üniversitesi Biyokimya Okulu'ndaki Kevin Gaston laboratuvarından Anya Ho Hai. Bugün size hücre altı fraksiyonlama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, transkripsiyon faktörlerinin lokalizasyonlarını incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Hem yapışmayan hem de yapışkan memeli hücrelerinin lamellere tutturulma prosedürlerini göstererek başlayacağız. Burada yapışmayan hücreler K 5 6 2 hücreleri, yapışkan hücreler ise Across 7 hücreleridi

in-situ-subcellular-fractionation-adherent-non-adherent-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, lösemik hücrelerden hücresel ve nükleer fraksiyonlar oluşturmak için bir yöntem olan lösemik hücrelerden hücre altı fraksiyonların hazırlanmasını açıklar. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlar, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Lösemik Hücrelerden Hücre Altı Fraksiyonların Hazırlanması: Lösemik Hücrelerden Hücresel ve Nükleer Fraksiyonlar Üretmek İçin Bir Yöntem

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Burada, insan taze ve donmuş bağırsak biyopsisi sitoplazmik ve nükleer proteinlerin hücre altı ayrılması için basit bir hücresel ayırma gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Taze ve donmuş Gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma

Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

Bu protokol, primer kronik lenfositik lösemi hücrelerinden nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların optimizasyonu ve daha sonra verimli bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu örnekler protein lokalizasyonunun yanı sıra hücre stimülasyonu ve ilaç tedavisi üzerine nükleer ve sitoplazmik bölmeler arasında gerçekleşen protein ticaretindeki değişiklikleri belirlemek için kullanılır.

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

Bu protokol, fare beyninden son derece saf sinaptozomlar, sinaptik veziküller ve diğer sinaptik fraksiyonları elde etmek için sağlam ve ayrıntılı bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein lokalizasyonunun ve fonksiyonunun kompartmanlı çözünürlükle biyokimyasal analizi de dahil olmak üzere sinaptik süreçlerin değerlendirilmesini sağlar.

Sinaptik Bileşenlerin Murin Beyinden İzolasyonu için Hücre Altı Fraksiyonasyonu

Bu yöntem, in situ hücresel kriyotomografi ve korelasyon ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için elektron mikroskobu (EM) ızgaralarının hazırlanması için erişilebilir ve esnek bir protokol sağlar.

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.

Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin, memeli hücrelerde yerinde subselüler fraksiyonlama yöntemiyle protein lokalizasyonunu incelemeyi. Bu teknik, immünofloresan mikroskopi ile protein dağılımını görselleştirmeyi sağlar.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Daha fazla video keşfet