Name: Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Keşfedin, üç senkronize lazer kullanarak zayıf Raman sinyallerinin duyarlılığını artıran DR-CARS görüntüleme yöntemini. Bu teknik, biyolojik yapıların kimyasal olarak spesifik görüntülenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz gelişmekte olan DR-CARS tekniği Iwan Schie ve Sebastian Wachsmann-Hogiu katkıları için teşekkür etmek istiyorum. Tyler Hafta, Lawrence Livermore Ulusal Laboratuvarı Lawrence Akademik Programı tarafından destek kabul eder. Thomas Huser Yardım Hibe programı ile Amerikan Kalp Derneği destek için minnettar olduğunu. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı fon tarafından kısmen desteklenmiştir. Biophotonics, bir NSF Bilim ve Teknoloji Merkezi, Merkezi, Kooperatif Anlaşması No FİZ 0120999 altında, University of California, Davis tarafından yönetilmektedir. Destek UCD Klinik Araştırma Kaynakları (NCRR) Ulusal Merkezi&#39;nden hibe sayısı UL1 RR024146 altında Translasyonel Bilim Merkezi de kabul edilmektedir.

1. ARABALAR ve DR-CARS Sinyalleri Üretimi ARABALAR oluşturmak ve DR-CARS sinyalleri, aynı anda üç ayarlanabilir ve senkronize kısa darbeli lazer kaynakları gereklidir. <ol><li> Biz tek bir 10 W lazer (PicoTrain, HighQ lazer, Inc.) Ile başlar üç senkronize bakliyat elde etmek için. Bu lazer, 1064 nm sabit bir dalga boyu, 7 ps sabit bir darbe uzunluğu ve 76 MHz sabit bir tekrarlama oranı vardır. </li><li> Yarım dalga plakaları bir dizi kullanmak ve ışın demeti splitter polarize üç parçaya ayrılır küpler. Polarize ışın ayırıcı küp ile birlikte yarım-dalga plaka demetinin her bir bileşenin yönünü değiştirmeden bize güç miktarını ayarlamak için izin verir. Tipik olarak, iki ışın ~ 4,5 W her ayarlanır ve üçüncü kiriş kalan 1 W. içerir. </li><li> Iki yüksek güç kirişler daha sonra iki bağımsız optik parametrik osilatörler (OPO, Avante, APE GmbH, Berlin, Almanya) içine yönlendirilir. Farklı dalga boylarında, iki düşük enerjili fotonların bir yüksek enerji foton dönüştürmek OPO kullanımı fark frekansı nesil. Bu etkiyi elde etmek için kullanılan kristal sıcaklığını kontrol ederek, ortaya çıkan fotonların dalga boyları 0,1 nm içinde kontrol edilebilir. By frekans iki katına, bu sinyaller, 1064 nm sabit bir dalga boyuna sahip bir lazer 780 nm ile 910 nm arasında herhangi bir ayarlanabilir bir lazer ışını dönüşebilir. Aynı 1064 nm kaynağı ile iki ayrı OPO pompa, otomatik olarak orijinal pompa lazer senkronize iki bağımsız olarak ayarlanabilir lazer kaynakları edinin. </li><li> 1064 nm pompa lazer üçüncü (en düşük güç) ışını üç kirişler (2 pompa lazer OPOS, 1) sonra recombined böylece dikroik ayna kombinasyonu ile OPO çevresinde yönlendirilir. Tutarlı Raman sinyal fotonlar verimli üretmek için recombined bakliyat hem zamansal ve mekansal çakışmış olması gerekir. OPO her lazer darbe kristal birden çok kez geçmesine izin veren, halka boşluklar içerdiğinden, OPO seyahat yoluyla gönderilen orijinal pompa ışınına göre önemli bir gecikmeye neden fazladan bir mesafe kirişler. Bu mesafe, dikroik aynalar kullanarak recombined önce bu ışın, diğer iki aynı mesafe seyahat kuvvet ek aynalar getirerek üçüncü ışını ile telafi edilmelidir. </li><li> Sağlamak amacıyla her bir ışın prizma retroreflektörler kullanarak, ayarlanabilir gecikme aşamalarında yol yolun uzunluğu ince ayarı, her bir ışın yolu tanıtıldı. </li><li> Yarım dalga plakaları ve polarize ışın ayırıcı küpler başka set, bize bağımsız OPO giriş etkilemeden her ışın güç ayarlamasına olanak sağlamak için her ışın eklenir. </li><li> Dikroik aynalar, ilk iki OPO ve daha sonra 1064 nm ışın ile gelen kirişler birleştirmek için kullanılır. Kirişlerin tam çakışan (yani collinear ve benzer bir sapma var) sağlamak için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu yakın kirişlerin üst üste (bir kaç santimetre içinde) ve uzak (~ 1 m) dikroik ayna karşılaştırarak kontrol edilebilir. </li><li> Darbeli lazerler kullanarak avantajı, her darbe, hala düşük bir ortalama yoğunluğunu korurken tutarlı Raman sinyaller verimli üretimi için izin veren, örnek bir yüksek tepe enerji olabilir ki. Yüksek ortalama yoğunluğu örnek zarar verebilir. Bu nedenle daha fazla pik enerji ödün vermeden ortalama yoğunluğunu kontrol etmek amacıyla, üç birleşik kirişler, bize bu darbeleri tekrarlama oranını ayarlamak için izin veren bir darbe seçici olarak bir elektro-optik modülatör (Pockel hücre, ConOptics) işleyişi aracılığıyla gönderilir Bizim örnek gelmesi ve bu nedenle ortalama bir yoğunluk. </li><li> Kombine lazer ışınları daha sonra yüksek bir NA amacı ile bir inverted mikroskop içine birleştirilir. Amaç, genellikle bizim OPO tunability ve 1064 nm ışın aralığında renk sapmalarını giderilmiştir 1.2 (NA) sayısal bir diyafram ile 60 X su objektif lens. Yüksek NA objektif lens tarafından oluşturulan odaklanan sıkı mikron ölçekte tutarlı Raman sinyallerinin en verimli üretimi için izin verir. </li><li> Kombine kirişler mikroskop objektif arka port aşırı doldurmayın amacıyla genişletilmiştir. Mikroskop objektif geri doldurmayın iyi odaklanarak koşulları elde edebilirsiniz ve bu nedenle bizim mikroskop sistemi iyi mekansal çözünürlükte. </li><li> Mikroskop objektif lens, bize ticari ışın-tarama konfokal mikroskoplar benzer örnek karşısında kirişler, raster tarama görüntüler elde etmek için izin veren bir XYZ piezo sahne üzerine monte edilmiştir. </li></ol> 2. Üç Kısa Pulsed Lazer Kullanımı Çeşitli c birçok ARABALAR sinyallerinin üretimi üç kısa atımlı lazerler sonuçları kullanılması,iki lazer yanı sıra 3-Renk CARS ve her üç lazerler birleşimi DR-FWM sinyalleri ombinations. <ol><li> Sinyallerin dalga boyları birbirine yakın Işıksal yalan. Sinyalleri birbirine yakın olduğunda sabit dalga boyu bant geçiren filtreler ve dikroik aynalar kullanılarak analiz için onları ayırmak için zor olabilir. Bu nedenle bizim sinyalleri de mekansal farklı dalga boylarında sinyal ayırmak için verimli bir monokromatör olarak hizmet veren bir görüntüleme spektrometre (SpectraPro 2300i, Acton Araştırma) geçti. </li><li> Alçaltılmış pozisyonu spektrometre içinde elektronik harekete çevirme ve ayna tüm sinyal aralığında spektroskopik bilgi sağlayan arkadan aydınlatmalı bir derin tükenmesi charge-coupled device (CCD) kamera için sinyal gönderir ve bize çeşitli tutarlı belirlemek ve optimize etmek için izin verir Raman sinyalleri. </li><li> Resim yapmak istediğiniz sinyali seçmek için biz sadece sonra değişim satıcı tarafından sağlanan kontrol ve merkezi veri toplama yazılımı (WinSpec, Princeton Instruments), CCD kamera faiz tepe kullanarak, ızgara spektrometre içinde döndürün ve bu sinyal tek bir foton sayma çığ foto-diyot (AKB) bağlı olan ikinci bir çıkış portuna yönlendirmek için flip ayna yerleştirin. </li><li> Objektif lens sonra raster taranır ve AKB kaydedilen sinyalleri veri toplama yazılımı (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Almanya) ile her bir piksel için foton sayısı oranı göstererek bir görüntü oluşturmak için kullanılır. </li><li> Biz bize post-processing sırasında sinyalleri karşılaştırmak için izin istenen her tutarlı Raman sinyal için bu görüntüleme işlemi tekrarlayın. </li></ol> 3. Numune Hazırlama Net, tekrarlanabilir görüntüler elde etmek için bazı bakım numune hazırlama alınmalıdır. <ol><li> Örnekler genellikle ~ 150 mikron kalınlığında cam lamelleri hazırlanmıştır. Bu lamelleri tipik olarak kullanılan 1.2 NA hedefleri ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin verecek kadar ince. </li><li> Dielektrik cisimlerden Optik yakalama lazer ışığı küçük şeffaf nesneler aracılığıyla Kırınan zaman oluşabilir. Sıkıca odaklanmış, yüksek pik güç kullanımı, kısa darbeli lazer ışınları, bulanık ya da kirli görüntüler boyunca küçük hücreleri veya bakteri sürükleyebilirsiniz. Bunu önlemek için ilk spin kaplama poli-L-lisin ince bir tabaka halinde uygulanarak cam lamel yüzeyinde örnek hareketsiz için gerekli olabilir. </li><li> Cam alt kültür kaplarına kültür hücreleri için hücre kültürü büyüme yemeklerinden hücreleri ayırmak için gerek kalmadan görüntüleme için izin verdiği kullanılabilir. </li><li> Bu katkı gösteri için öncelikle bir formaldehit sabit C. depozito elegans nematod solucanı bir cam kapak slip. </li><li> Sonra bir 20 mcL damlacık solucan 5 M döteryumlanmış glukoz çözeltisi ekleyin. Döteryumlanmış glukoz çözeltisi, benzersiz ve güçlü Raman bir arka plan imza sağlar. </li></ol> 4. Örnek Çözümlemeler Düzgün bir şekilde iki kat rezonans geliştirme etkisi yararlanmak için Raman hem Raman-rezonans maddelerin bilinmesi gerekir. <ol><li> Bir kez numune ilgili spontan Raman spektrumu elde etmek ve tanımlamak için uygun doruklarına konfokal Raman mikroskobu kullanılarak analiz edilmektedir lamel hazırlanmıştır. </li><li> 2845 cm -1 ve 2121 cm -1 sırasıyla, döteryumlanmış glukoz ile ilişkili, genellikle lipidler ile ilişkili CH streç modu, ve CD streç modu spektral yerleri belirlemek DR-CARS gerçekleştirmek için. </li><li> Tutarlı Raman saçılması bir moleküler titreşim frekansı iki lazer arasındaki frekans farkı eşleştiğinde elde edilir. By ayar bir OPO 817 nm ve 868 nm 1064 nm ışını ile kombine edildiğinde, 2121 cm -1 zirve prob diğer OPO ayar 1064 nm lazer ışını ile kombine edildiğinde, 2845 cm -1 CH modunda prob olacak . </li><li> Raster tarama, şimdi üç ilgi tutarlı Raman sinyalleri izleyebilirsiniz CARS mikroskop örnek. A CARS titreşim uzanan CH problama sinyal, CARS CD streç modu ve hem de problama DR-CARS sinyal problama sinyali. </li><li> Bölüm 2.3 'de açıklandığı gibi, her tepe seçin ve yukarıda açıklandığı gibi bir görüntü çekmek. </li></ol> 5. Görüntü İşleme Bu üç resim dayalı ek bilgi ayıklanıyor şimdi bazı oldukça basit bir görüntü işleme gerektirir. <ol><li> İlk görüntüler normalize edilmelidir. Her bir sinyal üretim sürecine katılan her lazer yoğunluğu için muhasebe teorisi normalleşme sağlanabilir. Ancak uygulamada bu her zaman düzgün olmayan spektral tepki nedeniyle ağırlıklı olarak, iş değildirdikroik aynalar, dedektörler ve ızgaralar. </li><li> Normalleşmesi için pratik bir yöntem saf lipidler sinyal hakim bölgelerde, CD rezonans sinyali herhangi bir katkıda bulunmaz gerektiği gerçeğine dayanır. Aynı şekilde, saf glukoz çözeltisi bölgelerde CH rezonans sinyali herhangi bir katkıda olmamalıdır. Bunu akılda tutarak, C. dışında bir bölgeye döteryumlanmış glukoz çözeltisi CD rezonans elde DR-CARS görüntü ve CARS görüntü normale elegans solucan hiçbir CH rezonans göstermelidir. </li><li> Sonra lipidler açısından zengin olan CH-rezonans CARS görüntü solucan içinde bir bölge belirlemek ve normalize DR-CARS görüntü içinde ilgili bölge normalleştirmek. Bu yöntem düzgün çalışması için biz bu bölgede derin döteryumlanmış glikoz mevcut olduğunu varsayalım. Hidrofobik lipidler ve çözümü ile karıştırmayın, çünkü bu güvenli bir varsayım. </li><li> Şimdi, normalize DR-CARS görüntü normalize CH-rezonans CARS görüntü çıkarılarak, sadece CD-rezonans sinyal amplifiye sol. </li><li> Benzer şekilde normalize DR-FWM görüntü normalize CD-rezonans CARS görüntü çıkarılarak sadece amplifiye CH-rezonans sinyali ile bırakılır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Yukarıda da açıklandığı gibi DR-CARS mikroskopi sistemi diyagramı . <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: C. Beyaz ışık görüntü döteryumlanmış glukoz çözeltisi elegans solucan bir cam lamel hazırlanmış ve görüntüleme için hazır. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: bir alkin değişiklik (karbon üçlü bağı karbon grubu) içeren modifiye oleik asit (doymamış yağ asidi) Raman spektrumu 2845 cm -1 ve 2100 cm alkin rezonans güçlü CH rezonanslar -1 her ikisi de tutarlı Raman görüntüleme için ideal belirteçleri, parmak izi bölgesi (yoğun paketlenmiş doruklarına bölge) izole edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: Tipik örnek içinde çakışan üç kısa darbeli lazerler zaman tutarlı Raman sinyallerinin spektrum oklar enerji diyagramları ile temsil gibi, her bir sinyal için sorumlu süreç (ler) işaret etmektedir . Burada gösterilen diyagramlar kesik oklar ortaya çıkan sinyali gösteren fotonlar lazer ve OPO ve katı oklar göstermektedir. Katı yatay çizgiler Raman titreşim enerjisini gösterir ve DR-CARS, probları aynı anda iki farklı Raman titreşimler aynı 3 giriş fotonlar karıştırma, görsel bir temsil vermek. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5: Tipik görüntüleme C. sonuçları DR-CARS ve CARS kullanarak elegans solucanlar üst satırındaki döteryumlanmış glikoz bir çözüm görüntü bir solucan Şekil 4'te belirtilen üç sinyal kullanılır. İkinci satırda görüntüleri uygun şekilde normalize edildi ve üçüncü sıra farkı görüntüler DR-CARS görüntü her CARS görüntüler çıkarılarak tarafından üretildi.

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
<li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+%28CARS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li>
<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
<li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+%28DR-FWM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li>
<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

Raman spektroskopisi ve Raman tabanlı görüntüleme biyolojik bilimler alanında güçlü gelişmekte olan araçlardır. Şu anda, bu in vivo ve in vitro çalışma Lipidlerin işleme ve depolama hücre metabolizması ve metabolik bozukluklar için özellikle doğrudur. En biyo-makromoleküller hücreleri ve organizmalardan elde edilen Raman genellikle yağlar, proteinler, nükleik asitler, şekerler katkıları konvolüsyon böylece benzer, çoğunlukla karbon bazlı moleküler bağlar çok sayıda içeren, vb Lipidler nispeten kolaydır çünkü yoğun damlacıkları veya bilayers formu kendi eğilim ve alifatik CH bağlarının çok sayıda uzun zincirler içerdiğinden, bu karmaşık spektrumları izole etmek. Ancak, karmaşık hücresel ortamı içinde, özel proteinler, amino asitler, RNA veya DNA izole etmek için yeteneği çok sınırlıdır. Ilgi, bu moleküllerin aşağıda sadece mcM konsantrasyonlarda, bu özellikle doğrudur. Burada, yeni sunulan DR-CARS fark görüntüleme tekniği kullanan zayıf Raman rezonanslar prob yeteneği kimyasal mikro ve görüntüleme için bir potansiyel olarak güçlü bir yaklaşım sağlar. Kuşkusuz, bu protokolün en karmaşık kısmı lazer sistemi ile uyum ve senkronizasyon. Sıfırdan başlarken, bakliyat senkronizasyon, yani, bakliyat, bir darbe autocorrelator kolaylaştırılabilir alan farklı yollar rağmen zaman çakışan sağlamak. Bir kere mekansal ve zamansal örtüşmesi durumunda, elde CARS ve DR-CARS sinyalleri kolayca algılanabilir olmalıdır. Ancak, ilk hizalama zayıf sinyaller sonucu, sık sık ham budur. Bu sistem iyi hizalamak için en iyi uygulama, başlangıçta zayıf sinyaller oluşturmak ve daha sonra yavaşça her yol boyunca verdiği aynalar ve gecikme aşamaları kullanarak temporal örtüşme ayarlayarak sinyal gücünü artırmak için. , Oda ışığında için çok etkili bir baffle olarak temiz oda ışıkları ile işletim sistemi ile elde edilebilir spektrometre / monokromatör eylemleri kapalı ve perde veya lens tüp çeşitli diğer ışık kaynaklarının (örneğin bilgisayar monitörleri tarafından tanıtılan arka plan en aza indirmek için rağmen gösterge ışıkları, LED, vb.) Bizim özellikle kurulum, tek foton sayma çığ foto-diyot (AKB) dedektörleri ve algılama 5 için zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC) donanım kullanır . Bu bize son derece zayıf sinyalleri algılamak için nispeten düşük gürültü ama birçok grup benzer ölçümleri yapmak avantajlı değişken kazanç ile foto çoğaltıcı tüpler (PMT) bulduk sağlar. PMT avantajı değişken kazanç sunuyoruz ve dedektör Hatların çok daha büyük bir algılama alanı vardır. Ayrıca, kurulum ışını tarama ulaşmak için objektif çevirmek için piezo aşamaları kullanır. Bunun avantajı, yüksek bir doğruluk derecesi ile Önceden taranmış bir görüntüyü içinde herhangi bir noktaya dönmek ve spontan Raman dahil ek ölçümler almak yeteneğine sahip olmasıdır. Diğer gruplar tarama ayna meclisleri, ya da böyle çok daha hızlı görüntüleme sunar ama tam bir görüntü içinde keyfi yerlere dönmek için yeteneği sınırlı Olympus FluoView sistemi, hatta tüm konfokal tarama birimleri kullanılarak başarılı olmuştur. Raman rezonans da, bazı optimizasyon isteyebilir kritik bir adımdır maç lazerler Tuning. Raman doruklarına DR-CARS ve CARS elde edilen maksimum spektral tepe yoğunluğu bilinen olabilir, ancak mutlaka kendiliğinden Raman tepe maksimum karşılık gelmiyor. Bu göreceli CARS spontan Raman spektrumları bozan olmayan bir rezonans arka plan sinyal ve CARS, giden dört-dalga karıştırma tarafından üretilen sinyallerin içsel girişime nedeniyle. CARS sinyalinin tepe spektral konumu hesaplanır, ancak daha pratik bir yaklaşım Raman rezonans beklenen konuma çapında birçok küçük spektral adımda OPOS ayarlamak için olabilir. Bu sürecin net bir maksimum verim gerekir. Aslında, hem rezonanslar DR-FWM büyük hassasiyet için maksimum ayarlanmış olmalıdır. DR-CARS yaklaşımın son bir potansiyel sorunu da ele alınacak, yani DR-CARS sinyal Raman aktif yükseltme molekülünün homojen bir dağılım bağlıdır. Çoğu biyolojik nesneler için, bu iyi, bol ve neredeyse her yerde hazır ve nazır geniş su OH rezonans olabilir. Su Ancak, lipid modları güçlendirmek için su rezonans kullanılarak elde edilen sinyallerin bir bozulma önde gelen lipid damlacıkları gibi bir hücre ile hidrofobik bölgeler, dışında. Bizim örneğimizde, kolayca algılanabilir ve bol miktarda biyolojik örnek bir sinyal oluşturmak için döteryumlanmış glikoz solüsyonu kullanılabilir. Benzer şekilde, su Dötöro veya biyolojik Buffe döteryumlanmışrs, d-Hepes olarak kullanılabilir. Bizim örneğimizde, C. içinde lipid damlacıkları elegans solucan, her zaman sistem odaklı lazer nokta içinde, döteryumlanmış glukoz çözeltisi ve lipidler hem de içeren kadar küçük. Ancak bu, genellikle doğru değildir. Belirli bir örnek adipositler, kendi sitoplazma içinde oldukça geniş lipid damlacıkları oluşturmak olacaktır. Bu demektir ki, DR-CARS tekniği ile yapılan herhangi bir deney sonuçları doğrulamak için, dikkatli bir hazırlık ve kontrol deneyleri gerektirir.

<table><tbody><tr><td>60X su daldırma objektifi</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>Invert Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>Pockels Hücresi</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>Picotrain pompa Lazeri</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>Optik Parametrik Osilatör</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>1.5 Cam lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25cm&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Yarım dalga plakaları</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>Polarize Işın Bölücü Küpler</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 veya PBS053</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometre/Monokromatör</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS: 100B</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche Foto Diyot</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Piezo Sahne</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>Bu, bir XY sahnesi ve bir Z objektif tutucusunun kombinasyonudur</td></tr><tr><td>Dikroik Aynalar</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>Bu belirli dikroikler kritik değildir, uygun transmisyon/refleksiyon özelliklerine sahip herhangi bir set yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Dikroik Ayna</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>Farklı yakın kızılötesi lazer ışınlarını birleştirmek için</td></tr><tr><td>TCSPC kartı</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>Symphotime Görüntüleme Yazılımı</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Çifte rezonans tutarlı anti-stokes raman saçılımı (cars) biyolojik yapıların diferansiyel görüntüleme

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Tutarlı Raman görüntüleme teknikleri nedeniyle yüksek molekül özgüllüğü 1 etiket optik görüntüleme sağlamak için söz, son on yılda faaliyet dramatik bir artış gördük . Ancak, bu tekniklerin duyarlılık, Mili molar moleküler konsantrasyonları 1,2 gerektiren, floresan daha zayıf büyüklükte çok sayıda siparişi. Burada, biz, güçlü ya da bol Raman sikliklerin elde edilen sinyal yükseltme Raman-aktif moleküllerin zayıf ya da düşük konsantrasyonlarda tespit etkinleştirebilirsiniz bir teknik açıklar. Biyolojik örnek kısa atımlı lazerler etkileşim numuneye ilişkin benzersiz kimyasal bilgi taşıyan her biri tutarlı bir Raman saçılma sinyalleri, çeşitli üretir. Tipik olarak, bu sinyaller, örneğin Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS), sadece biri diğerleri atılır bir görüntü oluşturmak için kullanılır. Ancak, 3-renk CARS ve dört dalga karıştırma (FWM) dahil olmak üzere bu diğer sinyalleri, toplanan ve CARS sinyal karşılaştırıldığında, aksi halde zor bilgi algılamak için 3 çıkarılan olabilir. Örneğin, iki kat rezonans ARABALAR (DR-CARS) iki rezonans sinyalleri 4 arasında yapıcı bir girişim sonucu . Biz göstermek DR-CARS lipidler 2845 cm -1 CH gerilmesi titreşim ve bir döteryumlanmış molekül (örneğin döteryumlanmış şekerler, yağ asitleri, vb) 2120 cm -1 CD germe titreşim sinyalleri üretmek için gerekli olan üç lazerler ince ayarının nasıl Raman rezonanslar aynı anda iki prob kullanılabilir. Bu koşullar altında, her rezonans, de üretilen problama DR-CARS kombine bir sinyal CARS sinyalleri ek olarak. DR-CARS sinyal ve zayıf sinyal duyarlılığı artırmak için kullanılan bol bir molekülün titreşim yükseltme sinyali arasındaki fark tespit nasıl göstermektedir. Biz bu yaklaşımı biraz daha güçlü bir çözücü Raman sinyal kullanarak örneğin seyreltik çözünen zayıf Raman sinyal artırabilirsiniz böyle iki sinyalleri farklı moleküllerden oluşturulan uygulamalar bile uzattığını gösteriyor.

Üç tek dalga boyu kısa darbeli lazerler bir arada tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve iki kat rezonans ARABALAR (DR-CARS) oluşturmak için kullanılır. Bu sinyaller arasındaki fark, aksi takdirde tutarlı Raman sinyalleri algılamak için zor zayıf Raman sikliklerin görüntüleme sağlayan gelişmiş hassasiyet sağlar.

Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Tutarlı Raman görüntüleme teknikleri, etiketsiz optik görüntülemeyi mümkün kılma potansiyelleri nedeniyle son on yılda faaliyetlerinde ciddi bir artış görmüştür...

Bu video, koherent ramen saçılma sinyallerine sahip biyolojik yapılarla ilişkili iki ramen rezonansının diferansiyel görüntülemesinin gerçekleştirilmesine yönelik bir prosedürü göstermektedir. İlk olarak, senkronize edilmiş üç kısa darbeli lazer zaman ve mekanda üst üste bindirilir. Üst üste bindirilen darbeler daha sonra, mikroskobik nesnelerden koherent ramen sinyallerinin üretilmesine olanak tanıyan standart bir ters mikroskoba gönderilir.Üretilen farklı Raman sinyallerini karşılaştırmak amacıyla, sinyaller ticari bir yazılım kullanılarak görüntülere dönüştürülür. Sonuçlar, çift rezonanslı ve tek rezonanslı Raman sinyallerinden elde edilen görüntüler arasındaki farkın, zayıf Raman sinyalleri için artırılmış hassasiyet sağladığını göstermektedir. Merhaba, ben California Üniversitesi Davis'teki Biyofotonik Merkezi'nden Tyler Weeks.Ben California Davis Üniversitesi Biyo Fotonik Merkezi ve İç Hastalıkları Bölümü'nden Thomas ER. Bugün size, hücrelerin kimyasal olarak spesifik görüntülerini üretmek için çift rezonanslı koherent antis Stokes Raman saçılması kullanma prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, yalnızca koherent antis Stokes Raman spektroskopisi ile doğrudan tespit edilemeyecek kadar zayıf olan moleküllerden gelen sinyalleri saptamak için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. CARS ve Dr CARS sinyallerini eş zamanlı olarak üretmek için üç adet ayarlanabilir ve senkronize kısa darbeli lazer kaynağı gereklidir. Bu senkronize darbeleri elde etmek için, 10 watt çıkış gücüne sahip tek bir kısa darbeli lazer ile başlayın. Sabit dalga boyu 1064 nanometre, sabit darbe süresi yedi pikosaniye ve sabit tekrarlama oranı 76 megahertz'dir.Bir dizi yarım dalga plakası ve polarize ışın ayırıcı küpler kullanılarak, ışın üç parçaya ayrılır. Bir yarım dalga plakası ile polarize ışın ayırıcı kübün kombinasyonu, ışının yönünü değiştirmeden her bir bileşendeki güç miktarının ayarlanmasına olanak tanır. Tipik olarak, iki ışın yaklaşık olarak her biri 4,5 watt olacak şekilde ayarlanır ve üçüncü ışın geri kalan bir watt'ı içerir.Ardından iki yüksek güçlü ışın, iki bağımsız optik parametrik osilatöre veya OPO'ya yönlendirilir. OPO'lar, yüksek enerjili bir fotonu farklı dalga boylarına sahip iki düşük enerjili fotona dönüştürmek için farklı frekans üretimi kullanır. Bu etkiyi elde etmek için kullanılan kristalin sıcaklığı kontrol edilerek, ortaya çıkan fotonların dalga boyları 0.1 nanometre hassasiyetle kontrol edilebilir.Bu sinyallerin frekansının iki katına çıkarılmasıyla, 1064 nanometre sabit dalga boyuna sahip bir lazer, aynı 1064 nanometre kaynağıyla iki ayrı OPO'nun pompalanması sayesinde 780 nanometre ile 910 nanometre arasında herhangi bir değere ayarlanabilen bir lazer ışınına dönüştürülebilir. Orijinal pompa lazerimizle otomatik olarak senkronize olan, birbirinden bağımsız olarak ayarlanabilen iki lazer kaynağı elde edilir. 1064 nanometre pompa lazerinden gelen üçüncü ışın, dielektrik aynalar yardımıyla OPO'ların etrafından yönlendirilerek üç ışının da daha sonra yeniden birleştirilmesi sağlanır.Tutarlı ramen sinyal fotonlarını verimli bir şekilde üretmek için, birleştirilen darbelerin hem zamansal hem de mekansal olarak üst üste gelmesi gerekir; çünkü OPO'lar, her lazer darbesinin kristalden birden fazla kez geçmesine izin veren halka boşluklar içerir ve OPO'lar üzerinden gönderilen ışın, orijinal pompa ışınına kıyasla önemli bir gecikmeye neden olan ekstra bir mesafe kat eder. Bu mesafe, yol uzunluğunun hassas ayarının sağlanması amacıyla dikroik aynalar kullanılarak yeniden birleştirilmeden önce, bu ışını diğer iki ışınla aynı mesafeyi kat etmeye zorlayan ek aynaların yerleştirildiği üçüncü bir ışın ile telafi edilmelidir. Her bir ışın, farklı lazer darbelerinin zamansal örtüşmesinin ayarlanmasına olanak tanıyan ayarlanabilir geciktirme kademeleri üzerinden gönderilir.Her bir ışının lazer gücünün bağımsız olarak ayarlanabilmesi için her bir ışına birer set yarım dalga plakası ve polarizasyon ışın ayırıcı küpler eklenir. Önce iki OPO'dan gelen ışınları, ardından 1064 nanometre ışını birleştirmek için dikroik aynalar kullanılır; ışınların uzayda tam olarak üst üste gelmesini sağlamaya özen gösterilmelidir. Bu durum, ışınların dikroik aynanın birkaç santimetre yakınındaki örtüşmesi ile dikroik aynadan yaklaşık bir metre uzaklıktaki örtüşmesinin karşılaştırılmasıyla doğrulanabilir.Yüksek ortalama güce sahip lazer ışınlarına maruz kalmak numuneye zarar verebileceği için, birleştirilen üç ışın, darbe seçici (pulse picker) olarak işlev gören bir elektrikli optik modülatörden geçirilir; bu modülatör, numuneye ulaşan darbelerin tekrarlanma hızının ve dolayısıyla ortalama gücün ayarlanmasına olanak tanır. Birleştirilmiş lazer ışınları daha sonra, yüksek sayısal açıklığa (numerical aperture veya na) sahip bir objektif lensli ters mikroskoba kenetlenir. Yüksek NA'lı objektif lensin sağladığı sık odaklama, mikroskobik uzunluk ölçeklerinde koherent raman sinyallerinin en verimli şekilde üretilmesini sağlar.Mikroskobun objektif lensi, ticari demet taramalı konfokal mikroskoplara benzer şekilde demetlerin numune üzerinde raster tarama yapılarak görüntülerin elde edilmesini sağlayan bir X, Y, Z pizo tablası üzerine monte edilmiştir. Şimdi CARS ve D-R-F-W-M sinyallerinin nasıl oluşturulduğuna bakalım; üç kısa darbeli lazer demetinin numunedeki etkileşimi, iki lazerin çeşitli kombinasyonlarından kaynaklanan CARS gibi birçok dört dalga karıştırma sinyalinin yanı sıra, her üç lazerin kombinasyonundan kaynaklanan üç renkli CARS ve DR CARS sinyallerinin oluşmasıyla sonuçlanır. Sinyaller dalga boyu açısından birbirine nispeten yakın olduğunda, onları analiz için ayırmak zor olabilir.Bu nedenle sinyaller, farklı dalga boylarındaki sinyalleri mekansal olarak ayırmak için bir monokromatör veya bant geçiren filtre görevi gören bir görüntüleme spektrometresine aktarılır. Spektrometre içerisindeki, indirilmiş konumdaki elektronik olarak tahrik edilen bir çevirme aynası, sinyali tüm sinyal aralığında spektroskopik bilgi sağlayan ve görüntülemek için seçilecek çeşitli koherent robin sinyallerini tanımlamamıza ve optimize etmemize olanak tanıyan arka aydınlatmalı derin boşaltımlı şarj coupled cihazına veya CCD kameraya gönderir. İlgilenilen piki CCD kameranın merkezine getirmek için, üretici tarafından sağlanan kontrol ve veri toplama yazılımını kullanarak spektrometre içindeki ızgarayı döndürmeniz yeterlidir.Ardından, sinyali tek foton sayım avalanche foto DDE veya bir PD'nin bağlı olduğu ikinci bir çıkış portuna yönlendirmek için çevirme aynasının konumunu değiştirin. Objektif lensi raster şeklinde tarayın ve ardından veri toplama yazılımıyla her piksel için foton sayım hızını görüntüleyerek bir görüntü oluşturmak için A PD'de kaydedilen sinyalleri kullanın. Sinyallerin veri işleme aşamasında karşılaştırılabilmesi için bu görüntüleme prosedürünü istenen her bir koherent ramen sinyali için tekrarlayın.Şimdi, net ve tekrarlanabilir görüntüler elde etmek için bir örneğin nasıl uygun şekilde hazırlanacağını görelim. Örneklerin hazırlanmasında bazı önlemler alınmalıdır. Örnekler tipik olarak yaklaşık 150 micron kalınlığındaki cam lameller üzerinde hazırlanır.Bu lamel camlar, bu deneylerde kullanılan yüksek NA'lı su veya yağ immersiyon objektif lensleri ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmaya izin verecek kadar incedir. Tipik bir numune hazırlığını göstermek için, mikroskop lamına sabitlenmiş yaklaşık 20 mikron kalınlığında fare kas dokusu kesitleri hazırlıyoruz. Numuneye 20 µL beş molar döteryumlanmış glikoz çözeltisi damlası eklenir.Döteryumlanmış glukoz çözeltisi, benzersiz ve güçlü bir Raman arka plan imzası sağlar. Örneklerin üzerine bir cam lamella yerleştirilir ve hücreler ile kültürler için oje ile sabitlenir. Hücrelerin, hücre kültürü yetiştirme kaplarından ayrılmasına gerek kalmadan görüntüleme yapılmasına olanak tanıyan cam tabanlı kültür kapları kullanılabilir.Şimdi Dr car'lar için uygun Raman ve piklerin nasıl belirleneceğini görelim. Çift rezonanslı güçlendirme etkisinden uygun şekilde yararlanabilmek için, her iki Raman rezonanslı maddenin Raman spektrumları bilinmelidir. Bunlar tipik olarak, lipidlerle ilişkili 2.845 cm⁻¹ ve döteryumlanmış glikozla ilişkili CD gerilme modu için 2.121 cm⁻¹'dir.İki lazer arasındaki frekans farkı bir moleküler titreşimin frekansıyla eşleştiğinde koherent Raman saçılması gerçekleşir. Bir OPO'nun 817 nanometreye ayarlanması, 1064 nanometre lazer ışını ile birleştirildiğinde 2.845 cm⁻¹ C modunu probe etmesini sağlar; diğer OPO'nun 868 nanometreye ayarlanması ise 1064 nanometre ışın ile birleştirildiğinde 2.121 cm⁻¹ değerini probe etmesini sağlar. Spektroskopik modda, CAR mikroskobu, ilgi çeken üç koherent Raman sinyalini gözlemlememize olanak tanır: CH germe titreşimini probe eden bir CAR sinyali, CD germe modunu probe eden bir CAR sinyali ve burada gösterilen diyagramda her ikisini de probe eden bir DR CAR sinyali; kesikli oklar OPO'lardaki lazerden gelen fotonları, düz oklar ise ortaya çıkan sinyali göstermektedir.Katı yatay çizgiler, raman titreşiminin enerjisini belirtir ve DR araçlarında aynı üç giriş fotonunun karıştırılmasının aynı anda iki farklı raman titreşimini incelediğine dair görsel bir temsil sunar. Her bir pik için sinyal gücünün, bu pik konumlarının çevresinde ince adımlarla ayarlanarak optimize edilmesi gerekecektir. Burada her bir piki seçiyoruz ve derate edilmiş glukoz çözeltisindeki deniz solucanlarının görüntülerini alıyoruz; bu üç ayrı elde edilmiş görüntüye dayanarak ek bilgiler çıkarmak, oldukça basit bazı görüntü işleme süreçleri gerektirmektedir.Öncelikle, görüntüler normalize edilmelidir. Normalizasyon için kullanılan pratik bir yöntem, lipidlerin hidrofobik olması gerçeğine dayanır. Bu, lipid yoğunluğunun yüksek olduğu bölgelerde, glikozdan gelen CD rezonansının çift rezonans sinyaline çok az katkıda bulunacağı anlamına gelir.Aksine, saf glikoz çözeltisi bölgelerinde, lipidlerden gelen CH rezonanslarının da çok az katkıda bulunması gerekir. Bunu göz önünde bulundurarak, DR kanalının görüntüsünü ve döteryumlanmış glikoz çözeltisinin CD rezonansında elde edilen kanal görüntüsünü, CH rezonansı göstermemesi gereken, CL egan solucanının çok dışındaki bir bölgeye göre normalize edin. Ardından, CH rezonanslı kanal görüntüsündeki solucan içerisinde lipidlerce zengin bir bölge belirleyin ve burayı, normalize edilmiş DR kanal görüntüsündeki karşılık gelen bölgeye göre normalize edin.Bu yöntemin düzgün çalışması için, bu bölgenin derinliklerinde döteryumlanmış glikozun bulunmadığı varsayılır. Lipidler hidrofobik olduğu ve solüsyonla karışmayacağı için bu güvenli bir varsayımdır. Artık, normalize edilmiş CH rezonans car görüntüsü normalize edilmiş DR car görüntüsünden çıkarılarak, sadece amplifiye edilmiş CD rezonans sinyali kalır; benzer şekilde, normalize edilmiş CD rezonans car görüntüsü normalize edilmiş Dr.FWM görüntüsünden çıkarılır.Burada yalnızca yükseltilmiş CH rezonans sinyali gösterilmiştir; bu, alkin modifikasyonu içeren modifiye bir oleik asit için Raman spektrumudur. 2.845 cm⁻¹'deki güçlü CH rezonansları ve 2.121 cm⁻¹'deki alkin rezonansı, yoğun piklerin bulunduğu parmak izi bölgesinden iyi şekilde ayrılmıştır; bu da onları koheren Raman görüntüleme için ideal belirteçler haline getirir. Bu, üç kısa darbeli lazerin numune içinde örtüştürülmesiyle üretilen koheren Raman sinyallerinin tipik bir spektrumudur. Oklar, enerji diyagramları ile temsil edilen ve her bir sinyalden sorumlu olan süreçleri göstermektedir.Bunlar, C. elegans solucanlarının DR CARS ve CARS kullanılarak görüntülenmesinden elde edilen tipik sonuçlardır. Üst satırda, düşük yoğunluklu glukoz çözeltisindeki bir solucanı görüntülemek için az önce gösterilen üç sinyal kullanılmıştır. İkinci satırda görüntüler uygun şekilde normalize edilmiş ve üçüncü satırda ise CARS görüntülerinin her biri DR CARS görüntüsünden çıkarılarak fark görüntüleri oluşturulmuştur. Böylece, çift rezonanslı koherent antis Raman mikroskobisine dayalı Raman fark görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken, ışınların uygun şekilde üst üste binmiş ve senkronize edilmiş olduğundan emin olmanın önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca, farklı koherent sinyaller arasında geçiş yaparken, analizi etkileyeceği için numuneye çarpmamaya veya numuneyi hareket ettirmemeye dikkat edin. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: McCullagh, EA, et al. Beyin Dilimlerinde Miyelinasyonu Görüntülemek için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması. J. Vis. Uzm. (2022)Video, kemirgen beyin dokusundaki nöronal mimariyi görselleştirmek için floresan ve Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) görüntülemeyi göstermektedir. Nissl boyama, ribozomal RNA'ya bağlanarak hücre gövdelerini etiketlerken, CARS görüntüleme, lazerle indüklenen sinyaller yoluyla lipit açısından zengin miyelini hedefler.

Fare Beyin Dokusundaki Miyelinli Nöronları Görselleştirmek için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi

Tutarlı anti-Stokes Raman saçılımı (OTOMOBİL) mikroskopi yerinde ve çözünme uygulanan farmasötik tablet yüzeyinin gerçek zamanlı görselleştirme sağlamak için bir iç akış yoluyla erime kurulumu ile birleştirilir. Bu özel inşa kurulumu kullanarak, bu hat üzerinde UV absorpsiyon spektroskopisi kullanılarak kaydedilen ilaç çözünme profilleri ile ARABALAR videoları ilişkilendirmek mümkündür.

Çözünme sırasında tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Mikroskopi visualizes İlaç Tabletler

molekül bağlarının doğasında titreşim dayalı Tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) mikroskopi etiket ücretsiz kimyasal seçici canlı hücre görüntüleme izin verir. safir lazer ve bir OPO lazer: Bu çalışma femtosaniye Ti dayalı standart bir multiphoton lazer tarama mikroskobu tamamlayıcı mikroskopi tekniği uygulanmasını sunar.

Sapphire ve OPO Lazer Bazlı Standart Lazer Tarama Mikroskobu: Bir Ti bir Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Sisteminin Uygulanması

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskobu güçlü, tahribatsız ve etiketsiz bir görüntüleme tekniğidir. Ortaya çıkan bir uygulama, protein ve lipit Raman geçişlerinde iki renkli SRS görüntülemenin psödo-hematoksilin ve eozin görüntüleri üretmek için kullanıldığı uyarılmış Raman histolojisidir. Burada, doku teşhisi için gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme için bir protokol gösteriyoruz.

Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi

Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

Bu makale, aynı mikroskop platformuna entegre edilmiş uyarılmış Raman saçılmasının (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılmasının (CARS) çözünürlüğünü, hassasiyetini ve görüntüleme kontrastlarını doğrudan karşılaştırmaktadır. Sonuçlar, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu, SRS'nin daha iyi kontrastlar ve spektral çözünürlük sağladığını ve her iki yöntemin de benzer hassasiyete sahip olduğunu göstermektedir.

Kimyasal Görüntüleme için Hiperspektral Uyarılmış Raman Saçılması ve Tutarlı Anti-Stokes Raman Saçılma Mikroskobunun Doğrudan Karşılaştırılması

Geniş bant uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskobu ile kimyasal görüntüler elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Diferansiyel çok kanallı kilitleme tespiti ile çalışan bir SRS mikroskobuna dayanan protokol, numune hazırlamayı, SRS cihazının ayarlanmasını ve kimyasal olarak heterojen numunelerin farklı bileşenlerini çözmek için kemometriyi açıklar.

Geniş Bant Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobuna Dayalı Multipleks Kimyasal Görüntüleme

Miyelinasyonu görselleştirmek, sinir sistemini inceleyen birçok araştırmacı için önemli bir hedeftir. CARS, miyelin gibi özel yapıları aydınlatan beyin gibi doku içindeki lipitleri doğal olarak görüntüleyebilen immünofloresan ile uyumlu bir tekniktir.

Beyin Dilimlerinde Miyelinasyon Görüntüleme için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Keşfedin, üç senkronize lazer kullanarak zayıf Raman sinyallerinin duyarlılığını artıran DR-CARS görüntüleme yöntemini. Bu teknik, biyolojik yapıların kimyasal olarak spesifik görüntülenmesini sağlar.

Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Daha fazla video keşfet