Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Bu video, tutarlı ramen saçılma sinyalleri ile biyolojik yapılarla ilişkili iki ramen rezonansının diferansiyel görüntülemesini yapmak için bir prosedürü göstermektedir. İlk üç senkronize kısa darbeli lazer, zaman ve uzayda üst üste biner. Üst üste binen darbeler daha sonra mikroskobik nesnelerden tutarlı ramen sinyallerinin üretilmesine izin veren standart bir ters çevrilmiş mikroskoba gönderilir.

Üretilen farklı ramen sinyallerini karşılaştırmak için sinyaller ticari yazılım kullanılarak görüntülere dönüştürülür. Sonuçlar, çift ve tek rezonanslı ramen sinyallerinden elde edilen görüntüler arasındaki farkın, zayıf ramen sinyalleri için gelişmiş hassasiyet sağladığını göstermektedir. Merhaba, ben California Davis Üniversitesi Biyo Fotonik Merkezi'nden Tyler Weeks.

Ben Kaliforniya Davis Üniversitesi Biyo Fotonik Merkezi ve İç Hastalıkları Bölümü'nden Thomas ER. Bugün size, hücrelerin kimyasal olarak spesifik görüntülerini üretmek için çift rezonanslı tutarlı antis stokes ramen saçılımını kullanmak için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, yalnızca tutarlı antis Stokes Ramon spektroskopisi ile doğrudan tespit edilemeyecek kadar zayıf moleküllerden gelen sinyalleri tespit etmek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım: Arabalar ve Dr arabaları sinyalini aynı anda üretmek için, bu senkronize darbeleri elde etmek için üç ayarlanabilir ve senkronize kısa darbeli lazer kaynağı gereklidir. 10 watt çıkış gücüne sahip tek bir kısa darbeli lazerle başlayın. 1064 nanometrelik sabit bir dalga boyu, yedi pikosaniyelik sabit bir darbe uzunluğu ve 76 megahertz'lik sabit bir tekrarlama oranı.

Bir dizi yarım dalga plakası ve polarize ışın ayırıcı küpler kullanılarak, ışın üç parçaya bölünür. Polarize edici bir ışın ayırıcı küp ile birleştirilmiş bir yarım plaka, ışının her bir bileşenindeki güç miktarının, yönünü değiştirmeden ayarlanmasına izin verir. Tipik olarak, iki ışının her biri yaklaşık 4,5 watt'a ayarlanır ve üçüncü ışın kalan bir watt'ı içerir.

İki yüksek güç ışını daha sonra iki bağımsız optik parametrik osilatöre veya OPO'ya yönlendirilir. OPO'lar, yüksek enerjili bir fotonu farklı dalga boylarına sahip iki düşük enerjili fotona dönüştürmek için farklı frekans üretimi kullanır. Bu etkiyi elde etmek için kullanılan kristalin sıcaklığını kontrol ederek, elde edilen fotonların dalga boyları 0.1 nanometre içinde kontrol edilebilir.

Bu sinyalleri frekansı iki katına çıkararak, 1064 nanometre sabit dalga boyuna sahip bir lazer, aynı 1064 nanometre kaynağına sahip iki ayrı OPO'yu pompalayarak 780 nanometre ile 910 nanometre arasında herhangi bir yere ayarlanabilen bir lazer ışınına dönüştürülebilir. Orijinal pompa lazerimizle otomatik olarak senkronize edilen, bağımsız olarak ayarlanabilen iki lazer kaynağı elde edilir. 1064 nanometre pompa lazerinden gelen üçüncü ışın, dielektrik aynaların bir kombinasyonu ile OPO'ların etrafına yönlendirilir, böylece üç ışının tümü daha sonra yeniden birleştirilebilir.

Tutarlı ramen sinyal fotonlarını verimli bir şekilde üretmek için, yeniden birleştirilen darbelerin hem zamansal hem de uzamsal olarak üst üste binmesi gerekir, çünkü OPO'lar, her bir lazer darbesinin kristalden birden çok kez geçmesine izin veren halka boşlukları içerir, OPO'lardan gönderilen ışın ekstra bir mesafe kat eder ve bu da orijinal pompa ışınına göre önemli bir gecikmeye neden olur. Bu mesafe, yolun uzunluğunun ince bir şekilde ayarlanmasını sağlamak için dikroik aynalar kullanılarak yeniden birleştirilmeden önce, bu ışını diğer ikisiyle aynı mesafeyi kat etmeye zorlayan ekstra aynalar eklenerek üçüncü bir ışınla telafi edilmelidir. Her ışın, farklı lazer darbelerinin zamansal örtüşmesinin ayarlanmasına izin veren ayarlanabilir gecikme aşamalarından gönderilir.

Her bir ışının lazer gücünün bağımsız olarak ayarlanmasına izin vermek için her bir ışına başka bir yarım plaka seti ve polarize ışın ayırıcı küpler eklenir. Dikroik aynalar, önce iki OPO'dan gelen ışınları birleştirmek için kullanılır ve daha sonra ışınların uzayda tam olarak örtüşmesini sağlamak için 1064 nanometre ışın bakımı yapılmalıdır. Bu, dikroik aynanın birkaç santimetre içindeki kirişlerin örtüşmesini, dikroik aynadan yaklaşık bir metre uzaktakilerle karşılaştırarak doğrulanabilir.

Yüksek ortalama güçlü lazer ışınlarına maruz kalmak numuneye zarar verebileceğinden, üç birleşik ışın, numuneye gelen darbelerin tekrarlama hızının ve dolayısıyla ortalama gücün ayarlanmasına izin veren bir darbe seçici olarak işlev gören bir elektrikli optik modülatör aracılığıyla gönderilir. Birleştirilmiş lazer ışınları daha sonra yüksek sayısal açıklığa veya na'ya sahip bir objektif lens ile ters çevrilmiş bir mikroskoba birleştirilir. Yüksek NA objektif lensi tarafından üretilen sıkı odaklama, mikroskobik uzunluk ölçeklerinde tutarlı ramen sinyallerinin en verimli şekilde üretilmesine olanak tanır.

Mikroskobun objektif merceği, ticari ışın taraması, konfokal mikroskoplara benzer şekilde numune boyunca ışınların raster taramasıyla görüntülerin elde edilmesini sağlayan bir X, Y, Z pizo aşamasına monte edilmiştir. Şimdi arabaların ve DRFWM sinyallerinin nasıl üretileceğini görelim, numunedeki üç kısa darbeli lazer ışınının etkileşimi, iki lazerin çeşitli kombinasyonlarından arabalar gibi birkaç dört dalga karıştırma sinyalinin üretilmesiyle sonuçlanır, ayrıca üç renkli araba ve DR araba sinyalleri, üç lazerin kombinasyonundan elde edilir. Sinyaller dalga boyunda nispeten yakın olduğunda, analiz için bunları ayırmak zor olabilir.

Bu nedenle sinyaller, farklı dalga boylarında sinyalleri uzamsal olarak ayırmak için monokromatör veya bant geçiren filtre olarak da hizmet veren bir görüntüleme spektrometresine geçirilir. Alçaltılmış konumda spektrometre içinde elektronik olarak çalıştırılan bir flip ayna, sinyali tüm sinyal aralığı boyunca spektroskopik bilgi sağlayan arkadan aydınlatmalı derin tükenme şarjı bağlantılı bir cihaza veya CCD kameraya gönderir ve sinyalin görüntüleneceği sinyali seçmek için çeşitli tutarlı robin sinyallerini tanımlamamıza ve optimize etmemize olanak tanır. CCD kamerada ilgi odağını ortalamak için satıcı tarafından sağlanan kontrol ve veri toplama yazılımını kullanarak derecelendirmeyi spektrometre içinde döndürmeniz yeterlidir.

Ardından, sinyali tek bir foton sayma çığ fotoğrafı DDE veya bir PD'nin bağlı olduğu ikinci bir çıkış portuna yönlendirmek için çevirmeli aynanın konumunu değiştirin. Raster. Objektif lensi tarayın ve ardından veri toplama yazılımı ile her piksel için foton sayım oranını görüntüleyerek bir görüntü oluşturmak için A PD'ye kaydedilen sinyalleri kullanın. İstenen her tutarlı ramen sinyali için bu görüntüleme prosedürünü tekrarlayın, böylece sinyaller işlem sonrası karşılaştırılabilir.

Şimdi net tekrarlanabilir görüntüler elde etmek için bir numunenin nasıl düzgün bir şekilde hazırlanacağını görelim. Numunelerin hazırlanmasında biraz özen gösterilmelidir. Numuneler tipik olarak yaklaşık 150 mikron kalınlığında cam lameller üzerinde hazırlanır.

Bu örtü kaymaları, bu deneylerde kullanılan yüksek NA suya veya yağa daldırma objektif lensleri ile yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin verecek kadar incedir. Tipik bir numunenin hazırlanışını göstermek için, bir mikroskop lamına sabitlenmiş yaklaşık 20 mikron kalınlığında fare kas dokusu bölümleri hazırlıyoruz. Numuneye 20 mikrolitrelik bir damla beş molar döteryumlu glikoz çözeltisi eklenir.

Döteryumlu glikoz çözeltisi, benzersiz ve güçlü bir ramen arka plan imzası sağlar. Numunenin üzerine bir cam kapak astarı yerleştirilir ve hücreler ve kültür için oje ile yerine sabitlenir. Hücreleri hücre kültürü büyüme kaplarından ayırmaya gerek kalmadan görüntülemeye izin veren cam tabanlı kültür kapları kullanılabilir.

Şimdi Dr arabaları için uygun rom ve tepe noktalarını nasıl belirleyeceğimizi görelim. Çift rezonans artırma etkisinden düzgün bir şekilde yararlanmak için, her iki ramen rezonans maddesinin ramen spektrumlarının bilinmesi gerekir. Tipik olarak, bunlar lipitlerle ilişkili 2.845 ters santimetre ve döteryumlu glikoz ile ilişkili CD gerilme modu için 2.121 ters santimetredir.

Tutarlı ramen saçılması, iki lazer arasındaki frekans farkı bir moleküler titreşimin frekansıyla eşleştiğinde elde edilir. Bir OPO'yu 817 nanometreye ayarlayarak, 1064 nanometre lazer ışını ile birleştirildiğinde 2.845 ters santimetre C modunu araştıracak ve diğer OPO'yu 868 nanometreye ayarlayarak, 1064 nanometre ışını ile birleştirildiğinde 2.121 ters santimetreyi araştıracaktır. Spektroskopik modda, arabanın mikroskobu, ilgilenilen üç tutarlı ramen sinyalini, CH germe titreşimini araştıran bir araba sinyalini, CD germe modunu araştıran bir araba sinyalini ve her ikisini de burada gösterilen diyagramda araştıran bir DR araba sinyalini gözlemlememize izin verir, kesikli oklar OPO'lardaki lazerden gelen fotonları gösterir ve katı oklar ortaya çıkan sinyali gösterir.

Katı yatay çizgiler, ramen titreşiminin enerjisini gösterir ve DR arabalarında aynı üç giriş fotonunu aynı anda karıştırmanın iki farklı ramen titreşimini araştırdığına dair görsel bir temsil verir. Her tepe noktası için sinyal gücünün, bu tepe konumlarının etrafında ince adımlarla ayarlanarak optimize edilmesi gerekecektir. Burada her bir zirveyi seçiyoruz ve bir değeri azaltılmış glikoz çözeltisi içinde deniz elgan solucanlarının görüntülerini alıyoruz, ayrı ayrı elde edilen bu üç görüntüye dayalı olarak ek bilgiler çıkarmak oldukça basit bir görüntü işleme gerektiriyor.

İlk olarak, görüntüler normalleştirilmelidir. Normalizasyon için pratik bir yöntem, lipitlerin hidrofobik olduğu gerçeğine dayanır. Bu, yüksek yoğunluklu lipitlerin bulunduğu bölgelerde, glikozdan gelen CD rezonansının, çift rezonans sinyaline çok az katkıda bulunması gerektiği anlamına gelir.

Tersine, saf glikoz çözeltisi bölgelerinde, lipitlerden gelen CH rezonansları da çok az katkıda bulunmalıdır. Bunu akılda tutarak, DR arabasının görüntüsünü ve Döteryumlu glikoz çözeltisinin CD rezonansında elde edilen arabanın görüntüsünü, CL egan'ın solucanının çok dışında olan ve CH rezonansı göstermemesi gereken bir bölgeye normalleştirin. Daha sonra, CH rezonans araba görüntüsündeki solucan içinde lipitler açısından zengin bir bölge tanımlayın ve bunu normalleştirilmiş DR araba görüntüsündeki karşılık gelen bölgeye normalleştirin.

Bu yöntemin düzgün çalışması için, bu bölgenin derinliklerinde döteryumlu glikoz bulunmadığını varsayalım. Lipitler hidrofobik olduğundan ve çözelti ile karışmayacağından bu güvenli bir varsayımdır. Şimdi, normalleştirilmiş CH rezonans araba görüntüsünü normalleştirilmiş DR araba görüntüsünden çıkararak, normalleştirilmiş CD rezonans araba görüntüsünü normalleştirilmiş Dr.FWM görüntüsünden çıkararak, yalnızca güçlendirilmiş CD rezonans sinyali benzer şekilde kalır.

Burada gösterilen sadece güçlendirilmiş ch rezonans sinyali, bir alkin modifikasyonu içeren modifiye edilmiş bir oleik asit için ramen spektrumudur, 2.845 ters santimetrede güçlü CH rezonansları ve 2.121 ters santimetrede alpin rezonansı, yoğun bir şekilde paketlenmiş zirvelerin bölgesi olan parmak izi bölgesinden iyi bir şekilde izole edilmiştir, onları tutarlı ramen görüntüleme için ideal işaretleyiciler haline getirir. Bu, numune içinde üç kısa darbeli lazer üst üste bindiğinde üretilen tipik bir tutarlı ramen sinyalleri spektrumudur. Oklar, enerji diyagramları ile temsil edilen her sinyalden sorumlu süreçleri gösterir.

Bunlar, DR arabaları ve arabaları kullanılarak C Elgin'in solucanlarının görüntülenmesinden elde edilen tipik sonuçlardır. Üst sıra, değeri düşürülmüş bir glikoz çözeltisindeki bir solucanı görüntülemek için az önce gösterilen üç sinyali kullandı. İkinci sırada, görüntüler uygun şekilde normalize edildi ve üçüncü sırada fark görüntüleri üretildi Otomobilin görüntülerinin her birini DR aracının görüntüsünden çıkararak, Size az önce çift rezonanslı tutarlı antis Raman mikroskobuna dayalı Raman farkı görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, ışınların üst üste bindiğinden ve düzgün bir şekilde senkronize edildiğinden emin olmanın önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca, farklı tutarlı sinyaller arasında geçiş yaparken, analizi etkileyeceği için numuneyi çarpmadığınızdan veya hareket ettirmediğinizden emin olun. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.