Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Bu video protokolünün amacı, nörosfer analizi kullanarak embriyonik fare beyninden nöral kök hücreleri izole etmek ve genişletmektir. Prosedür; E 14 fare embriyolarının toplanması, ardından gangliyonik eminenslerin toplanması için beyin mikrodiseksiyona tabi tutulması, tek hücre süspansiyonu elde etmek için toplanan dokunun disosyasyonu ve son olarak hücrelerin nörosfer kültürüne ekilmesini içermektedir. Merhaba, ben Florida Üniversitesi Mite Beyin Enstitüsü'ndeki Dr. Brent Frennels laboratuvarından Hassan Ali.

Bugün size, nörosfer deneyi kullanarak embriyonik fare beyninden nörosfer kültürü nasıl oluşturulacağını göstereceğim. Laboratuvarımızda nöral kök hücreleri izole etmek ve çoğaltmak için bu deneyi rutin olarak kullanıyoruz. Pekala, hadi başlayalım.

Zamanlaması belirlenmiş gebe bir fareyi anestezi altına alın. Gebeliğin 14. gününde servikal dislokasyon uygulayın ve karnı %70 ethanol ile durulayın. Karın üzerindeki deriyi büyük bir pensetle tutun, ardından deriyi ve altındaki fasyayı büyük bir makasla kesin.

Karın boşluğunu ve uterus boynuzlarını açığa çıkarmak için, embriyoları içeren uterus boynuzlarını çıkarın ve soğuk hem içeren 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Uterus dokularını PC iki kabinine aktardıktan sonra, 50 ml'lik tüpteki hemi uzaklaştırın ve kan ile kıl gibi kontaminantları temizlemek için dokuları yeterli hacimde taze soğuk hem ile durulayın; bu şekilde iki ila üç yıkama gerçekleştirin. Uterus dokularını soğuk hem içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Küçük eğri pens ve makas kullanarak uterus kornularını açın ve embriyoları soğuk hem içeren yeni bir kaba aktarın. Tüm embriyolar toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından embriyoları diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Embriyoların başlarını servikal omurilik seviyesinden ayırın ve soğuk hem içeren başka bir Petri kabına aktarın. Başı, mikro makas kullanarak ince eğri pensle tutun. Önce burnun üzerinden yatay bir kesi yapın ve ardından alın bölgesinden başın arkasına doğru orta hat boyunca kesmeye devam edin.

Deri ve kafatası boyunca kesim yapıldığından ve alttaki beyne zarar verilmediğinden emin olun. Kavisli pens kullanarak, kesilen bölümün kenarlarını geriye doğru iterek beyni kafatasından çıkarın. Tüm beyinler kafataslarından çıkarılana kadar bu prosedüre devam edin.

Beyni, dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde kavisli pensle sabit tutun ve ardından mikro makaslar kullanarak her bir hemisferin korteksini, olfaktor bulbüllerden hemisferin arka kısmına kadar kesin. Ganglionik eminensleri açığa çıkarmak için beyni yerinde tutun, tüm ganglionik eminensi 45 derecelik açılı pensle diseke edin ve başka bir Petri kabına aktarın. Ganglionik eminens, medial ve lateral kısımlarıyla burada açıkça gösterilmiştir.

Alternatif olarak, ince pensler kullanarak çevre dokuları temizleyip gangliyonik eminensleri diseke edebilirsiniz. Eğer bu bölgelerin herhangi birinden hücre büyütmek istiyorsanız, eminensin tamamını medial ve lateral yarıya da ayırabilirsiniz.

Tüm beyinler mikrodiseksiyonla ayrılana kadar bu prosedürü tekrarlayın. Doku parçalarını toplamak için bir mililitre nöral kök hücre medyumu kullanın ve bunları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Herhangi bir doku kalıntısı bırakmamak için doku kümelerinin 15 mililitrelik tüpün dibine çökmesini bekleyin.

Süpernatant medyumun bir kısmını uzaklaştırın ve Petri kabının tabanındaki ek dokuları 15 ml'lik tüpe aktarmak için yıkayın. Pipet ucunu tüpün tabanına yaslayın. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için dokuyu parçalamak amacıyla süspansiyonu üç ila dört kez aşağı yukarı pipetleyin.

Ardından, ilişkilendirilmemiş topakların çökmesi için süspansiyonun bir dakika boyunca dinlenmesini sağlayın ve hücre süspansiyonunun neredeyse tamamını başka bir 15 ml'lik tüpe aktarın. Sonra, kalan topaklara bir mililitre nöral kök hücre besiyeri ekleyin ve bunları tekil hücrelere ayırın. Tüplerin içeriğini çekin.

Ardından, süspansiyonu 700 RPM veya 110 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre complete neuro stem cell medium içinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonundan 10 µL alın ve 90 µL tripan mavisi ile iyice karıştırın.

Ardından bu süspansiyondan 10 µL alarak bir hemositometreye aktarın. Hücre sayımı gerçekleştirin. Bir adet T 80 flask ekimi yapmak için 50 ml'lik konik tüpe toplam 20 ml tam nöral kök hücre medyumu aktarın.

Ardından hücre süspansiyonunu karıştırın ve mililitre başına toplam 200.000 hücre veya T 80 flask başına 4 milyon hücre olacak şekilde uygun miktarda hücre ekleyin. Final konsantrasyonu 20 nanogram/mL olacak şekilde EGF ekleyin. Büyüme faktörü içeren tam nöral kök hücre ortamındaki hücreleri karıştırın ve hücre süspansiyonunu T 80 flasklara aktarın.

Erleni etiketleyin ve doku kümeleri olmayan tek hücreli bir süspansiyona sahip olduğunuzdan emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Erleni 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren bir inkübatöre beş ila yedi gün boyunca yerleştirin. Beş ila yedi gün sonra, erleni mikroskop altında değerlendirin.

Bu aşamada, nörosferler oluşmuş olmalı, çapları 150 ila 200 mikron arasında olmalıdır ve alt kültüre alınmaya hazır hale gelmişlerdir. Balonun içeriğini uygun boyutta steril bir doku kültürü tüpüne toplayın, tüpü santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Sferleri bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin içinde yeniden süspanse edin ve tüpü iki dakika boyunca 37 derece sıcaklıktaki su banyosuna yerleştirin.

Ardından, tripsin aktivitesini durdurmak için eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin ve iyice ancak nazikçe karıştırın. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Daha sonra hücreleri bir mililitre komple nöral kök hücre ortamında yeniden süspande edin ve daha önce belirtildiği gibi hücre sayımı yapın. Bir adet T 175 flask ekimi yapmak için, toplam 40 ml komple nöral kök hücre ortamını 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.

Ardından hücreleri karıştırın ve M başına toplam 50.000 hücre veya T 1 75 flask başına 2 milyon hücre olacak şekilde uygun miktarda hücre ekleyin. Sonrasında, 20 nanogram per mil final konsantrasyonunda EGF ekleyin. Büyüme faktörü içeren komple nöral kök hücre ortamındaki hücreleri karıştırın ve hücre süspansiyonunu bir T 1 75 flask'a aktarın.

Balonu etiketleyin ve beş ila yedi gün boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Bu, primer E 14 nöral kök hücre kültürüne bir örnektir. Ekimden üç gün sonra, oklar çoğalan nöral kök hücre kümelerini göstermektedir.

Ayrıca substrata tutunmuş ve diferansiye olmuş hücreler de görebilirsiniz. Bu, ekimden yedi gün sonraki primer E 14 nöral kök hücre kültürüne bir örnektir. Gördüğünüz üzere, çeşitli boyutlarda küreler bulunmaktadır.

Ayrıca farklılaşmış hücreler de mevcuttur. Debris miktarı, primer yetişkin nörosfer kültürlerine göre çok daha düşüktür. Ayrıca, sferler sıkışmamıştır ve çevrelerinde, sferlerin sağlıklı ve canlı olduğunu gösteren mikro çıkıntılar bulunmaktadır.

Merkezdeki hücre ölümü nedeniyle renkleri koyulaşabileceğinden, kürelerin çok fazla büyümesine izin verilmemelidir. Büyük küreler ayrıca substrata tutunabilir ve farklılaşabilir. Bu, ekimden beş gün sonraki birinci pasaj E 14 nörosferlerine bir örnektir.

Burada, kürelerin çevresindeki mikro çıkıntıları tekrar görebilirsiniz. E 14 fare gangliyonik eminenslerinden, burada açıklanan prosedürlerin aynısını takip ederek nörosferlerin nasıl büyütüleceğini size göstermiş olduk. Nörosferleri korteks ve mezensefalon gibi beynin diğer bölgelerinden de büyütebilirsiniz.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve nörosfer kültürlerinizde başarılar dileriz.