Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Bu video protokolünün amacı, nörosfer analizi kullanarak embriyonik fare beyninden nöral kök hücreleri izole etmek ve çoğaltmaktır. Prosedür; E 14 fare embriyolarının toplanmasını, ardından gangliyonik eminenslerin toplanması için beyin mikrodiseksiyonunu, tek hücre süspansiyonu elde etmek için toplanan dokunun dissosiyasyonunu ve son olarak hücrelerin nörosfer kültürüne ekilmesini içerir. Merhaba, ben Florida Üniversitesi Mite Beyin Enstitüsü'ndeki Dr. Brent Frennels'in laboratuvarından Hassan Ali.

Bugün size, nörosfer deneyi kullanarak embriyonik fare beyninden nasıl nörosfer kültürü oluşturulacağını göstereceğim. Laboratuvarımızda nöral kök hücreleri izole etmek ve çoğaltmak için bu deneyi rutin olarak kullanıyoruz. Tamam, hadi başlayalım.

Zaman ayarlı çiftleştirilmiş gebe bir fareyi anesteziye alın. Gestasyonun 14. gününde servikal dislokasyon uygulayın ve abdomeni %70 etanol ile durulayın. Karın üzerindeki deriyi büyük bir pensle kavrayın, ardından deriyi ve altındaki fasyayı büyük bir makasla kesin.

Karın boşluğunu ve uterus boynuzlarını açığa çıkarmak için, embriyoları içeren uterus boynuzlarını çıkarın ve soğuk HEM içeren 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Uterus dokularını PC iki kabinine aktardıktan sonra, 50 ml'lik tüpteki HEM'i uzaklaştırın ve kan ve kıl gibi kontaminantları temizlemek için dokuları yeterli hacimde taze soğuk HEM ile durulayın; bu şekilde iki ila üç yıkama gerçekleştirin. Uterus dokularını soğuk HEM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Küçük eğri pens ve makas kullanarak uterus kornularını açın ve embriyoları soğuk hem içeren yeni bir kaba aktarın. Tüm embriyolar toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından embriyoları diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Embriyoların başlarını servikal spinal kord seviyesinden ayırın ve soğuk hem içeren başka bir Petri kabına aktarın. Mikro makas kullanırken başı ince eğri pensle tutun. Önce burnun üzerinden yatay bir kesi yapın ve ardından alın bölgesinden başın arkasına doğru orta hat boyunca kesmeye devam edin.

Deriyi ve kafatasını kestiğinizden, ancak alttaki beyne zarar vermediğinizden emin olun. Kavisli pens yardımıyla kesilen bölümün kenarlarını geriye doğru iterek beyni kafatasından çıkarın. Tüm beyinler kafataslarından çıkarılana kadar bu işleme devam edin.

Beyni, dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde kavisli pensle sabit tutun ve ardından mikro makas kullanarak her iki hemisferin korteksini olfaktör bulblardan hemisferin arka kısmına kadar kesin. Ganglionik eminensleri açığa çıkarmak için beyni yerinde tutarak, tüm ganglionik eminensi 45 derecelik açılı pensle diseke edin ve başka bir Petri kabına aktarın. Ganglionik eminens, medial ve lateral kısımlarıyla burada açıkça görülmektedir.

Alternatif olarak, ince pensler kullanarak çevre dokuları uzaklaştırıp gangliyonik eminensleri diseke edebilirsiniz. Eğer bu bölgelerin herhangi birinden hücre büyütmekle ilgileniyorsanız, tüm eminensi medial ve lateral olmak üzere iki yarıya da ayırabilirsiniz.

Tüm beyinler mikrodiseke edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Doku parçalarını toplamak için bir mililitre nöral kök hücre besiyeri kullanın ve bunları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Herhangi bir doku parçası kalmaması için doku kümelerinin 15 mililitrelik tüpte çökmesini bekleyin.

Süpernatan ortamın bir kısmını uzaklaştırın ve geri kalan dokuları 15 ml tüpe aktarmak için Petri kabının tabanını yıkayın. Pipet ucunu tüpün tabanına yaslayın. Tek hücreli süspansiyon elde etmek amacıyla, dokuyu parçalamak için süspansiyonu üç ila dört kez pipetle yukarı aşağı çekin.

Ardından, ilişkilendirilmemiş kümelerin çökelmesi için süspansiyonun bir dakika boyunca dinlenmesine izin verin ve hücre süspansiyonunun neredeyse tamamını başka bir 15 ml'lik tüpe aktarın. Daha sonra, kalan kümelere bir mililitre nöral kök hücre besiyeri ekleyin ve bunları tekil hücrelere ayrıştırın. Tüplerin içeriklerini çekin.

Ardından süspansiyonu 700 RPM veya 110 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre komple nöral kök hücre besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonundan 10 µL alın ve 90 µL tripan mavisi ile iyice karıştırın.

Ardından, bu süspansiyondan 10 µL alarak bir hemositometreye aktarın. Hücre sayımı yapın. Bir adet T 80 flask ekimi yapmak için, 50 ml'lik konik tüpe toplam 20 ml komplet nöral kök hücre besiyeri aktarın.

Ardından hücre süspansiyonunu karıştırın ve mililitre başına toplam 200.000 hücre veya T 80 flask başına 4 milyon hücre olacak şekilde uygun miktarda hücre ekleyin. Final konsantrasyonu 20 nanogram/mL olacak şekilde EGF ekleyin. Büyüme faktörü içeren komple nöral kök hücre ortamındaki hücreleri karıştırın ve hücre süspansiyonunu T 80 flasklara aktarın.

Balonu etiketleyin ve doku kümeleri olmayan tek hücreli bir süspansiyona sahip olduğunuzdan emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Balonu, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren bir inkübatöre beş ila yedi gün süreyle yerleştirin. Beş ila yedi gün sonra, balonu mikroskop altında değerlendirin.

Bu süre zarfında nörosferler oluşmuş olmalı, çapları 150 ile 200 mikron arasında olmalı ve alt kültüre alınmaya hazır hale gelmelidir. Flask içeriğini uygun boyutta steril bir doku kültürü tüpüne toplayın, tüpü santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Sferleri bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin içinde yeniden süspande edin ve tüpü iki dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirin.

Ardından, tripsin aktivitesini durdurmak için eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin ve iyi ancak nazikçe karıştırın. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. Daha sonra hücreleri bir mL komple nöral kök hücre ortamında yeniden süspande edin ve daha önce belirtildiği gibi hücre sayımı yapın. Bir adet T 175 flask ekimi yapmak için, toplam 40 mL komple nöral kök hücre ortamını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

Ardından hücreleri karıştırın ve toplam yoğunluğu M flask başına 50,000 hücre veya T 1 75 flask başına 2 milyon hücre olacak şekilde uygun miktarda hücre ekleyin. Daha sonra, 20 nanograms per mil son konsantrasyonda EGF ekleyin. Tam nöral kök hücre ortamındaki hücreleri büyüme faktörü ile karıştırın ve hücre süspansiyonunu bir T 1 75 flask içerisine aktarın.

Balonu etiketleyin ve beş ila yedi gün boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Bu, primer E 14 nöral kök hücre kültürüne bir örnektir. Ekimden üç gün sonra oklar, çoğalan nöral kök hücre kümelerini göstermektedir.

Ayrıca substrata tutunmuş ve farklılaşmış hücreleri de görebilirsiniz. Bu, ekimden yedi gün sonraki primer E 14 nöral kök hücre kültürüne bir örnektir. Gördüğünüz gibi, çeşitli boyutlarda küreler mevcuttur.

Ayrıca farklılaşmış hücreler de bulunmaktadır. Kalıntı miktarı, birincil yetişkin nörosfer kültürlerine göre çok daha düşüktür. Ayrıca, küreler sıkışmamıştır ve çevrelerinde, kürelerin sağlıklı ve canlı olduğunu gösteren mikro çıkıntılar bulunmaktadır.

Merkezin hücre ölümü nedeniyle renklerinin koyulaşabileceği için kürelerin çok fazla büyümesine izin verilmemelidir. Büyük küreler ayrıca substrata tutunabilir ve diferansiye olabilir. Bu, ekimden beş gün sonraki birinci pasaj E 14 nörosferlerine bir örnektir.

Burada, kürelerin çevresindeki mikro çıkıntıları tekrar görebilirsiniz. Burada açıklanan prosedürlerin aynısını izleyerek, E 14 fare gangliyonik eminenslerinden nörosferlerin nasıl büyütüleceğini size göstermiş olduk. Ayrıca korteks ve mezensefalon gibi beynin diğer bölgelerinden de nörosferler büyütebilirsiniz.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz, nörosfer kültürlerinizde başarılar dileriz.