Name: Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Öğrenin, E14 fare embriyolarından ganglionik eminensleri mikrodisseksiyon yaparak nöral kök hücre izolasyonu ve nörosfer kültürü oluşturma yöntemini. Bu teknik, sinirbilim araştırmalarında kök hücre genişletmesi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Overstreet Vakfı parasal destek verdi.

1. Diseksiyon için Başlamadan Önce Temel Set Up: <ol><li> Tam MGK orta Uygun hacmi, 09:01 oranında NeuroCult MGK Bazal Orta ve NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler sırasıyla karıştırılarak hazırlanır. </li><li> Orta, 37 ° C su banyosunda ısıtılır. </li><li> Antibiyotik yüksek konsantrasyonda (% 10) Soğuk Hepes-tamponlu asgari temel orta (HEM), diseksiyon ve yıkama amacı için hazırlanmıştır. Alternatif olarak, antibiyotik takviyesi ile MGK bazal orta de bu amaç için kullanılan olabilir. </li><li> 25-30 ml antibiyotik içeren soğuk HEM ​​embriyoların toplanması için 50 mL steril tüpler içine sürülür. </li><li> Birkaç 10cm plastik Petri kutularına Diseksiyon sırasında embriyoların ve beyinleri tutmak için gerekli olan ve aynı zamanda doku disseke tutun. </li><li> Embriyolar (büyük makas, küçük sivri makas, büyük forseps, küçük kavisli bir forseps) veya embriyonik beyin diseksiyon (küçük forseps, kıvrımlı ince forseps, 45 ° açılı ince forseps, küçük makas) kaldırmak için gerekli cerrahi aletler kullanılarak sterilize edilir cam boncuk sterilizatör 250 ° C veya diğer mevcut otoklav yöntemleri. </li><li> Diseksiyon mikroskobu,% 70 alkol ile sildi ve laminer akış veya PC2 kaput içinde kurulur. </li></ol> 2. E14 Fare Beyin ve Mikro-disseksiyon Hasat: <ol><li> Hamile fare evlendirilen bir süre günde bir kurumsal onaylı hayvan protokolü göre 14. gebelik uyuşturulduktan. </li><li> Servikal dislokasyon hayvanın acı ve sıkıntı zarar vermez emin olmak için yapılır. </li><li> Anestezi fare, emici bir kağıt mendil sırtını üzerine koydu ve karın alan sterilize etmek için% 70 etanol ile yıkanır. </li><li> Cilt karın üzerinde büyük bir forseps kullanarak kavradı ve sonra, cilt ve altta yatan fasya, karın boşluğu ve rahim boynuzları ortaya çıkarmak için büyük bir makas ile kesilir. </li><li> Uteri küçük forseps ve makas ile kaldırılır ve 50 ml konik tüp içeren soğuk HEM ​​aktarılır. </li><li> Rahim dokuları Kaputun aktarılır ve daha sonra kan ve saç gibi olası kirleri çıkarmak için bir veya iki kez taze steril soğuk HEM ​​yeterli hacmi ile durulanır. </li><li> Rahim dokuları sonra 10cm Petri kabı soğuk HEM ​​içeren bir transfer edilir. </li><li> Uterus boynuzları küçük kavisli bir forseps ve makas kullanılarak açılır ve soğuk HEM ​​içeren yeni bir 10cm çanak, embriyolar transfer edilir. </li><li> Embriyoların başkanları servikal spinal kord düzeyinde ayrılmış ve başka bir Petri kabı soğuk HEM ​​içeren transfer. </li><li> Petri kabı kafatası beyin kaldırmak için diseksiyon mikroskop altında aktarılır. </li><li> Kafaları başkanlarının dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde kaudal tarafında ince kavisli bir forseps ile yapılmaktadır. Kullanarak mikro-makas, gözleri üzerinde ilk yatay bir kesim yapılmış ve daha sonra başın arkasına doğru alında orta hatta devam etti. Deri ve kafatası kesti ve altta yatan bir beyin hasarı değil emin olun. </li><li> Beyin kafatası kesik bölümünün kenarları kavisli bir forseps kullanarak geriye doğru hareket basarak kaldırılır. Bu prosedür tüm beyinleri kafatası kaldırılıncaya kadar devam eder. </li><li> Beyin dorsal tarafına bir kesim koku ampuller ganglion eminences maruz yarımkürenin arkasına uzanan her yarımkürenin korteks ile gerçekleştirilir microscissors kullanarak yukarı ve ardından bakacak şekilde kavisli bir forseps kullanarak sabit tutulur. </li><li> Bir yandan kavisli bir forseps ve diğer 45 ° açılı forseps kullanarak, korteks kesme flep yayılmış ve ganglion eminences disseke vardır. </li><li> Disseke doku steril bir 10cm Petri kabı yerleştirilir ve tüm beyinleri mikro-disseke kadar bu işlem tekrarlanır. </li><li> Doku parçaları MGK orta 1 ml 1 ml pipet kullanılarak toplanan ve 15 ml santrifüj tüpüne aktarılır. </li><li> Doku sonra iyice ayrışmış, ama nazikçe pipet tüpün dibine basarak ve süspansiyon yukarı ve aşağı pipetleme. Bu şekilde tek bir hücre içine yığınları kırık. Pipetleme sütlü gibi bir süspansiyon elde edilir, böylece 3-4 kez yapılır. Daha sonra, süspansiyon 1-2 dakika kadar ayrışmış olmayan kümeleri çökeltileri yerleşmek için izin verilir. </li><li> Hemen hemen tüm hücre süspansiyonu diğer tüpe aktarılır ve daha sonra başka bir 1 ml MGK orta açıklandığı gibi kalan tek bir hücre kümeleri ve ayrışmış eklenir. </li><li> Tüplerin içeriği 700Rpm (110g), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca toplanmış ve santrifüj edilir. </li><li> Süpernatant aşağı gerçek pelet kapalı vakumlu, ve hücrelerin tam MGK orta 1 mL yeniden süspanse. </li><li> Orta hafifçe aşağı yukarı pipetlenir.homojen bir tek hücre süspansiyonu var. </li><li> Hücre süspansiyonu 10 mcL bir hücre sayımı gerçekleştirmek için 90 tripan mavi mcL ile karıştırılır. </li><li> Son olarak, hücreler 2x10 5 hücre / mL 20ng / ml epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş tam MGK orta yoğunlukta kaplanmıştır. 5 ml orta, T25, T75 ve T175 şişeler için 40 ml 20 ml için kullanılır. </li><li> 37 ° C,% 5 ile nemlendirilmiş bir inkübatör CO 2 inkübe Neurospheres 5-7 gün içinde oluşur . 6-7 gün içinde, küreler 150-200 mikron arasında ölçmelidir ve altkültürü (geçit) hazır olacaktır. </li></ol> 3. Embriyonik NSC'lerde Pasajlanması ve genişletilmesi: <ol><li> Neurospheres altkültürü (150-200 mikron çapında) için hazır olduğunuzda, orta askıya küreler, şişeler kaldırılır uygun bir boyut steril doku kültürü tüp yerleştirilir ve 700 rpm (110 g) 5 dakika santrifüj oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Süpernatant atılır ve küreler 1 mL% 0.05 tripsin-EDTA yeniden süspanse. </li><li> Hücre süspansiyonu daha sonra 2-3 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edilir, sonra soya tripsin inhibitörü eşit miktarda tripsin faaliyeti durdurmak için kullanılır. </li><li> Hücre süspansiyonu tripsin tamamen inaktive olduğundan emin olmak için hafifçe aşağı yukarı pipetlenir ve. </li><li> Hücre süspansiyonu, 5 dakika süreyle 700 rpm (110g) santrifüj edilir. Sonra süpernatantı kaldırılır ve hücrelerin tam MGK orta 1 mL yeniden süspanse. </li><li> Hücre süspansiyonu 10 mcL bir hücre sayımı gerçekleştirmek için 90 tripan mavi mcL ile karıştırılır. </li><li> Hücreleri uygun bir boyut doku kültürü şişesi 20ng / ml EGF ile desteklenmiş tam MGK orta 5x10 4 hücre / mL konsantrasyonda kaplanmıştır. 5 ml orta, T25, T75 ve T175 şişeler için 40 ml 20 ml için kullanılır. </li><li> 37 ° C,% 5 ile nemlendirilmiş bir inkübatör CO 2 inkübe İkincil neurospheres 5-7 gün içinde oluşur . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Birincil embriyonik MGK kültürü, hücrelerin çoğunluğunu hipertrofik olacak ve kaplama üzerine doku kültürü yemekleri ekleyin. Hücrelerin çoğunluğu ya ölür ya da 2-3 gün sonra, ayırt ederken, proliferatif hücreler substrat (Şekil 1) ayırmak hücrelerinin küçük kümeler olun. Kültürün ilk 48 saat içinde büyük sfero agrega oluşumu primer küreler için yanlış olmamalıdır. Agrega oluşumu ağırlıklı olarak enkaz ve kültürü olmayan ayrışmış doku kümeleri tutarlar bağlıdır. Gerçek neurospheres faz parlak ve boyutunu artırır (Şekil 2) gibi daha küresel hale. Küçük microspikes sağlıklı ve canlı küre (Şekil 3) dış yüzeyinde görünür. 5-7 gün sonra, küreler yuvarlak olabilir ama sıkıştırılmış değil; ve çapı 150 ila 200 mikron ölçmelidir. Neurospheres (9-10 gün sonra kültür) çok büyük büyümek için izin verilirse, onlar agrega form veya küre merkezinde (video) hücre ölümü nedeniyle koyu renkli olabilir. Büyük neurospheres sonunda in situ (substrat bağlama ve çevre doğru göç) ayırt etmek için başlayabilir. Aynı zamanda büyük neurospheres ayırmak zordur ve bunları altkültürü. <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. İlköğretim E14 MGK kültür kaplama 3 gün sonra. Oklar NSC'lerde prolifere kümeleri göstermektedir. Orijinal büyütme; 20x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 İlköğretim E14 MGK kültür kaplama 7 gün sonra. Orijinal büyütme; 10x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Passage bir E14 neurospheres 5 gün sonra kaplama. Küreler çevresindeki mikro-ani (oklar) dikkat edin. Orijinal Büyütme; 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

Neurosphere tahlil sadeliği ve tekrarlanabilirlik nedeniyle nöral kök hücreler 1-5 izolasyonu ve genişleme için tercih edilen bir yöntemdir. Bu testte hem de in vitro ve in vivo çalışmalar için kullanılan olabilir farklılaşmamış MSS öncü hücreler, büyük ölçekli üretimi için paha biçilmez bir araçtır. Neurospheres iyi niyetli nöral kök hücreler ve daha sınırlı atalarıdır hem olabileceği vurgulanmalıdır. Bu nedenle, neurosphere oluşturan frekans hesaplanırken, sadece iyi niyetli NSC&#39;lerde ...

* HEM yapmak için, 110L paket 1M Hepes MEM and160ml karıştırın ve distile su kullanılarak 8.75 L hacmi getirmek. 7.4 nihai PH ayarlama ve 4 saklamak ° C

neurosphere testi kullanarak embriyonik fare nöral kök hücre kültürü oluşturulması

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Memelilerde, kök hücreleri farklılaşmamış hücreler, hayvanın ömrü boyunca, farklı doku ve organlarda hücre doğuşu ve yenileme korumak için bir kaynak olarak görür. Bu potansiyel yaşlanma sürecini veya yaralanma ve hastalık sürecinde kaybolur hücreleri değiştirebilirsiniz. Nöral kök hücrelerin varlığı (NSC&#39;lerde) ilk roman serum serbest bir kültür sistemi, neurosphere assay (NSA) ile yetişkin memelilerin merkezi sinir sistemi (MSS) Reynolds ve Weiss (1992) tarafından tarif edilmiştir. Bu testte, aynı zamanda, farklı bölgelerinden embriyonik MSS NSC&#39;lerde izole etmek ve genişletmek için uygulanabilir. Bu in vitro genişletilmiş NSC&#39;lerde multipotent ve MSS üç önemli hücre tiplerinin ortaya çıkmasına neden olabilir. NSA gerçekleştirmek için nispeten basit olmakla birlikte, güvenilir ve tutarlı sonuçlar elde etmek için gerekli Burada gösterilen usul dikkat. Bu video pratik NSA 14-fare beyin dokusu oluşturmak ve embriyonik günden itibaren NSC&#39;lerde genişletmek gösterir ve teknik detaylar bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlar. Bu prosedür, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için MGK orta hasat doku ganglion eminences, disosiyasyon hasat, beyin mikrodiseksiyon E14 fare embriyoları, hasat ve son olarak NSA kültür hücreleri kaplama içerir. Kültür 5-7 gün sonra, ortaya çıkan birincil neurospheres daha sonraki deneyler için NSC&#39;lerde sayısını artırmak için geçişli.

Bu video protokolü, embriyonik gün 14-fare beyninde ganglion eminences nöral kök hücrelerin izolasyonu ve genişleme için neurosphere testinin uygulama göstermektedir.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Memelilerde kök hücreler, yaşam boyunca farklı doku ve organlarda hücre oluşumunu ve yenilenmesini sürdürmek için farklılaşmamış hücre kaynağı görevi görür...

Bu video protokolünün amacı, nörosfer analizi kullanarak embriyonik fare beyninden nöral kök hücreleri izole etmek ve çoğaltmaktır. Prosedür; E 14 fare embriyolarının toplanmasını, ardından gangliyonik eminenslerin toplanması için beyin mikrodiseksiyonunu, tek hücre süspansiyonu elde etmek için toplanan dokunun dissosiyasyonunu ve son olarak hücrelerin nörosfer kültürüne ekilmesini içerir. Merhaba, ben Florida Üniversitesi Mite Beyin Enstitüsü'ndeki Dr. Brent Frennels'in laboratuvarından Hassan Ali.Bugün size, nörosfer deneyi kullanarak embriyonik fare beyninden nasıl nörosfer kültürü oluşturulacağını göstereceğim. Laboratuvarımızda nöral kök hücreleri izole etmek ve çoğaltmak için bu deneyi rutin olarak kullanıyoruz. Tamam, hadi başlayalım.Zaman ayarlı çiftleştirilmiş gebe bir fareyi anesteziye alın. Gestasyonun 14. gününde servikal dislokasyon uygulayın ve abdomeni %70 etanol ile durulayın. Karın üzerindeki deriyi büyük bir pensle kavrayın, ardından deriyi ve altındaki fasyayı büyük bir makasla kesin.Karın boşluğunu ve uterus boynuzlarını açığa çıkarmak için, embriyoları içeren uterus boynuzlarını çıkarın ve soğuk HEM içeren 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Uterus dokularını PC iki kabinine aktardıktan sonra, 50 ml'lik tüpteki HEM'i uzaklaştırın ve kan ve kıl gibi kontaminantları temizlemek için dokuları yeterli hacimde taze soğuk HEM ile durulayın; bu şekilde iki ila üç yıkama gerçekleştirin. Uterus dokularını soğuk HEM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın.Küçük eğri pens ve makas kullanarak uterus kornularını açın ve embriyoları soğuk hem içeren yeni bir kaba aktarın. Tüm embriyolar toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından embriyoları diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.Embriyoların başlarını servikal spinal kord seviyesinden ayırın ve soğuk hem içeren başka bir Petri kabına aktarın. Mikro makas kullanırken başı ince eğri pensle tutun. Önce burnun üzerinden yatay bir kesi yapın ve ardından alın bölgesinden başın arkasına doğru orta hat boyunca kesmeye devam edin.Deriyi ve kafatasını kestiğinizden, ancak alttaki beyne zarar vermediğinizden emin olun. Kavisli pens yardımıyla kesilen bölümün kenarlarını geriye doğru iterek beyni kafatasından çıkarın. Tüm beyinler kafataslarından çıkarılana kadar bu işleme devam edin.Beyni, dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde kavisli pensle sabit tutun ve ardından mikro makas kullanarak her iki hemisferin korteksini olfaktör bulblardan hemisferin arka kısmına kadar kesin. Ganglionik eminensleri açığa çıkarmak için beyni yerinde tutarak, tüm ganglionik eminensi 45 derecelik açılı pensle diseke edin ve başka bir Petri kabına aktarın. Ganglionik eminens, medial ve lateral kısımlarıyla burada açıkça görülmektedir.Alternatif olarak, ince pensler kullanarak çevre dokuları uzaklaştırıp gangliyonik eminensleri diseke edebilirsiniz. Eğer bu bölgelerin herhangi birinden hücre büyütmekle ilgileniyorsanız, tüm eminensi medial ve lateral olmak üzere iki yarıya da ayırabilirsiniz.Tüm beyinler mikrodiseke edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Doku parçalarını toplamak için bir mililitre nöral kök hücre besiyeri kullanın ve bunları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Herhangi bir doku parçası kalmaması için doku kümelerinin 15 mililitrelik tüpte çökmesini bekleyin.Süpernatan ortamın bir kısmını uzaklaştırın ve geri kalan dokuları 15 ml tüpe aktarmak için Petri kabının tabanını yıkayın. Pipet ucunu tüpün tabanına yaslayın. Tek hücreli süspansiyon elde etmek amacıyla, dokuyu parçalamak için süspansiyonu üç ila dört kez pipetle yukarı aşağı çekin.Ardından, ilişkilendirilmemiş kümelerin çökelmesi için süspansiyonun bir dakika boyunca dinlenmesine izin verin ve hücre süspansiyonunun neredeyse tamamını başka bir 15 ml'lik tüpe aktarın. Daha sonra, kalan kümelere bir mililitre nöral kök hücre besiyeri ekleyin ve bunları tekil hücrelere ayrıştırın. Tüplerin içeriklerini çekin.Ardından süspansiyonu 700 RPM veya 110 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre komple nöral kök hücre besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonundan 10 µL alın ve 90 µL tripan mavisi ile iyice karıştırın.Ardından, bu süspansiyondan 10 µL alarak bir hemositometreye aktarın. Hücre sayımı yapın. Bir adet T 80 flask ekimi yapmak için, 50 ml'lik konik tüpe toplam 20 ml komplet nöral kök hücre besiyeri aktarın.Ardından hücre süspansiyonunu karıştırın ve mililitre başına toplam 200.000 hücre veya T 80 flask başına 4 milyon hücre olacak şekilde uygun miktarda hücre ekleyin. Final konsantrasyonu 20 nanogram/mL olacak şekilde EGF ekleyin. Büyüme faktörü içeren komple nöral kök hücre ortamındaki hücreleri karıştırın ve hücre süspansiyonunu T 80 flasklara aktarın.Balonu etiketleyin ve doku kümeleri olmayan tek hücreli bir süspansiyona sahip olduğunuzdan emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Balonu, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren bir inkübatöre beş ila yedi gün süreyle yerleştirin. Beş ila yedi gün sonra, balonu mikroskop altında değerlendirin.Bu süre zarfında nörosferler oluşmuş olmalı, çapları 150 ile 200 mikron arasında olmalı ve alt kültüre alınmaya hazır hale gelmelidir. Flask içeriğini uygun boyutta steril bir doku kültürü tüpüne toplayın, tüpü santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Sferleri bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin içinde yeniden süspande edin ve tüpü iki dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirin.Ardından, tripsin aktivitesini durdurmak için eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin ve iyi ancak nazikçe karıştırın. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. Daha sonra hücreleri bir mL komple nöral kök hücre ortamında yeniden süspande edin ve daha önce belirtildiği gibi hücre sayımı yapın. Bir adet T 175 flask ekimi yapmak için, toplam 40 mL komple nöral kök hücre ortamını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.Ardından hücreleri karıştırın ve toplam yoğunluğu M flask başına 50,000 hücre veya T 1 75 flask başına 2 milyon hücre olacak şekilde uygun miktarda hücre ekleyin. Daha sonra, 20 nanograms per mil son konsantrasyonda EGF ekleyin. Tam nöral kök hücre ortamındaki hücreleri büyüme faktörü ile karıştırın ve hücre süspansiyonunu bir T 1 75 flask içerisine aktarın.Balonu etiketleyin ve beş ila yedi gün boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Bu, primer E 14 nöral kök hücre kültürüne bir örnektir. Ekimden üç gün sonra oklar, çoğalan nöral kök hücre kümelerini göstermektedir.Ayrıca substrata tutunmuş ve farklılaşmış hücreleri de görebilirsiniz. Bu, ekimden yedi gün sonraki primer E 14 nöral kök hücre kültürüne bir örnektir. Gördüğünüz gibi, çeşitli boyutlarda küreler mevcuttur.Ayrıca farklılaşmış hücreler de bulunmaktadır. Kalıntı miktarı, birincil yetişkin nörosfer kültürlerine göre çok daha düşüktür. Ayrıca, küreler sıkışmamıştır ve çevrelerinde, kürelerin sağlıklı ve canlı olduğunu gösteren mikro çıkıntılar bulunmaktadır.Merkezin hücre ölümü nedeniyle renklerinin koyulaşabileceği için kürelerin çok fazla büyümesine izin verilmemelidir. Büyük küreler ayrıca substrata tutunabilir ve diferansiye olabilir. Bu, ekimden beş gün sonraki birinci pasaj E 14 nörosferlerine bir örnektir.Burada, kürelerin çevresindeki mikro çıkıntıları tekrar görebilirsiniz. Burada açıklanan prosedürlerin aynısını izleyerek, E 14 fare gangliyonik eminenslerinden nörosferlerin nasıl büyütüleceğini size göstermiş olduk. Ayrıca korteks ve mezensefalon gibi beynin diğer bölgelerinden de nörosferler büyütebilirsiniz.İzlediğiniz için teşekkür ederiz, nörosfer kültürlerinizde başarılar dileriz.

establishing-embryonic-mouse-neural-stem-cell-culture-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Bu video protokolü iyi niyetli nöral kök hücreler nöral prekürsör hücrelerin koloni oluşturan nöral hücre çalışması ile oluşan karışık bir nüfus nasıl ayrımcılık ve numaralandırmak göstermektedir.

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

Bu video protokolü akış sitometrisi teknolojisi kullanılarak fiziksel (boyutu ve iç boyu) ve floresan özelliklerine bağlı olarak kök sinir hücrelerini yenilenebilir bir kaynaktan (NSC'lerde) den nöronal progenitör hücre üretimi ve daha sonra saflaştırma için yeni bir yöntem gösterilmektedir.

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Video, fare beyninin subkallozal bölgesinden nöral kök hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi sürecini göstermektedir. Dokuların diseksiyonunu, enzimatik dissosiyasyonu ve olgun nöral hücrelere dönüşmek için farklılaşma faktörleriyle kültürlenmesini içerir.

Fare Subkallozal Bölgesinden Erişkin Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve üç sinir soy içine ayırt edebilirsiniz hücrelere bakın. Burada, klonal koşullarda neurosphere oluşumu ve farklılaşmayı kullanarak belirli bir hücre popülasyonu MGK sıklığını belirlemek için bir protokol açıklar.

Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma

Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Bu makalede, ayrıntılı olarak, postnatal fare nöral kök hücrelerinden nörosfer kültürlerin üretimi için bir protokol ana fare nörojenik nişler türetilmiştir açıklar. Nörosferler öncühücre sayılarının tahmin ine izin beyin dokusundan nöral kök hücreleri tanımlamak için kullanılır. Ayrıca, bu 3D yapılar farklıkoşullarda kaplanmış olabilir, nöronlar neden, oligodendrositler ve astrositler, hücre kaderini çalışma sağlayan.

Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Öğrenin, E14 fare embriyolarından ganglionik eminensleri mikrodisseksiyon yaparak nöral kök hücre izolasyonu ve nörosfer kültürü oluşturma yöntemini. Bu teknik, sinirbilim araştırmalarında kök hücre genişletmesi için kullanılır.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Daha fazla video keşfet