Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Bu video protokolünün amacı, nöros küre tahlilini kullanarak embriyonik fare beyninden nöro kök hücreleri izole etmek ve genişletmektir. Prosedür, E 14 fare embriyolarının hasat edilmesini, ardından ganglionik çıkıntıları hasat etmek için beyin mikro diseksiyonunu, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hasat edilen dokunun ayrışmasını ve son olarak Hücrelerin nöros küre kültüründe kaplanmasını içerir. Merhaba ben, ben Florida Üniversitesi Mite Beyin Enstitüsü'ndeki Dr.Brent Frennels'in laboratuvarından Hassan Ali.

Bugün size nöros küre tahlilini kullanarak embriyonik fare beyninden bir nöros küre kültürünün nasıl oluşturulacağını göstereceğim. Nöral kök hücreleri izole etmek ve genişletmek için bu testi laboratuvarımızda rutin olarak kullanıyoruz. Tamam, başlayalım.

Anestezi Zaman Çiftleşmiş hamile fare. Gebeliğin 14. gününde servikal çıkık yapın ve karnı% 70 etanol ile durulayın. Büyük forseps kullanarak cildi karın üzerinden kavrayın ve ardından cildi ve alttaki fasyayı büyük bir makasla kesin.

Karın boşluğunu ve rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için, embriyoları içeren rahim boynuzlarını çıkarın ve bunları soğuk him içeren 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Rahim dokularını PC iki başlığına aktardıktan sonra, etek ucunu 50 ml'lik tüpten çıkarın ve kan ve saç gibi kirleticileri gidermek için dokuları yeterli miktarda taze soğuk kenar ile durulayın, bu şekilde iki ila üç yıkama yapın. Rahim dokularını soğuk etek içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Küçük kavisli forseps ve makas kullanarak rahim boynuzlarını açın ve embriyoları soğuk etek içeren yeni bir tabağa aktarın. Tüm embriyolar toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra embriyoları diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Embriyoların başlarını servikal omurilik seviyesinde ayırın ve soğuk etek içeren başka bir Petri kabına aktarın. Mikro makas kullanarak kafayı ince kavisli forseps ile tutun. Önce burnun üzerinde yatay bir kesim yapın ve ardından alından başın arkasına doğru orta çizgide kesmeye devam edin.

Cildi ve kafatasını kestiğinizden ve alttaki beyne zarar vermediğinizden emin olun. Kavisli forsepsleri kullanarak kesilen bölümün kenarlarını geriye doğru iterek beyni kafatasından çıkarın. Tüm beyinler kafataslarından çıkarılana kadar bu işleme devam edin.

Sırt tarafı yukarı bakacak şekilde kavisli forsepsleri kullanarak beyni sabit tutun ve ardından mikro makas kullanarak koku alma ampullerinden yarım kürenin arkasına kadar her yarım kürenin korteksini kesin. Beyni yerinde tutan ganglionik çıkıntıları ortaya çıkarmak için, tüm ganglionik çıkıntıyı 45 derece açılı forseps ile inceleyin ve başka bir Petri kabına aktarın. Ganglionik üstünlük burada medial ve lateral kısımları ile açıkça gösterilmiştir.

Alternatif olarak, ince forseps kullanarak çevredeki dokuları çıkararak ganglionik çıkıntıları inceleyebilirsiniz. Ayrıca tüm üstünlüğü medial ve lateral yarıya da kesebilirsiniz. Bu bölgelerden herhangi birinden hücre yetiştirmekle ilgileniyorsanız.

Tüm beyinler mikrop diseke edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Doku parçalarını toplamak ve bunları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir mililitre nöral Kök hücre ortamı kullanın. Geride herhangi bir doku bırakmamak için doku kümelerinin 15 mililitrelik tüpe yerleşmesine izin verin.

Süpernatan ortamın bir kısmını çıkarın ve herhangi bir ek dokuyu 15 ml'lik tüpe aktarmak için Petri kabının tabanını yıkayın. Pipet ucunu tüpün altına yerleştirin. Dokuyu parçalamak için süspansiyonu üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde edin.

Daha sonra, süspansiyonun bir dakika boyunca oturmasına izin verin, böylece ilişkili olmayan kümeler çökelti, neredeyse tüm hücre süspansiyonunu başka bir 15 ml'lik tüpe aktarın. Daha sonra kalan kümelere bir mililitre nöro kök hücre ortamı ekleyin ve bunları tek hücrelere ayırın. Tüplerin içindekileri çekin.

Ardından süspansiyonu 700 RPM veya 110 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri bir mililitre tam nöro kök hücre ortamında yeniden süspanse edin. 10 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve 90 mikrolitre trian mavisi ile iyice karıştırın.

Daha sonra bu süspansiyondan 10 mikrolitre alın ve bir hemo sitometreye aktarın. Hücre sayımı gerçekleştirin. Bir T 80 şişesini plakalamak için toplam 20 ml tam nöral kök hücre ortamını 50 ml'lik bir konik ikiye aktarın.

Daha sonra hücre süspansiyonunu karıştırın ve mililitre başına 200.000 hücre veya T 80 şişesi başına 4 milyon hücre toplam yoğunluğu için uygun miktarda hücre ekleyin. EGF'yi mililitre başına 20 nanogramlık bir son konsantrasyonda ekleyin. Tam nöral kök hücre ortamındaki hücreleri büyüme faktörü ile karıştırın ve hücre süspansiyonunu bir T 80 şişesine aktarın.

Şişeyi etiketleyin ve doku kümeleri olmadan tek bir hücre süspansiyonuna sahip olduğunuzdan emin olmak için mikroskop altındaki hücrelere bakın. Şişeyi beş ila yedi gün boyunca% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre aktarın. Beş ila yedi gün sonra, şişeyi mikroskop altında değerlendirin.

Bu zamana kadar, nöroküreler oluşmuştur ve çapı 150 ila 200 mikron arasında olmalıdır ve alt kültür olmaya hazırdır. Şişenin içeriğini uygun boyutta bir steril doku kültürü tüpünde toplayın, tüpü santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Küreleri bir orta mililitre ön ısıtma tripsin içinde yeniden süspanse edin ve tüpü iki dakika boyunca 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin.

Daha sonra eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin ve tripsin aktivitesini durdurmak için iyice ama hafifçe karıştırın Tekrar santrifüjleyin ve snat'ı çıkarın. Daha sonra hücreleri bir mililitre tam nöral kök hücre ortamında yeniden süspanse edin ve daha önce belirtildiği gibi bir hücre sayımı yapın. Bir T 1 75 şişeyi plakalamak için, toplam 40 ml tam nöral kök hücre ortamını 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra hücreleri karıştırın ve M başına 50.000 hücre veya T 1 75 şişesi başına 2 milyon hücre toplam yoğunluğu için uygun miktarda hücre ekleyin. Daha sonra EGF'yi mil başına 20 nanogramlık bir son konsantrasyonda ekleyin. Tam nöral kök hücre ortamındaki hücreleri büyüme faktörü ile karıştırın ve hücre süspansiyonunu bir T 1 75 şişesine aktarın.

Şişeyi etiketleyin ve beş ila yedi gün boyunca bir inkübatöre aktarın. Bu, birincil E 14 Nöral kök hücre kültürünün bir örneğidir. Kaplamadan üç gün sonra, oklar çoğalan nöral kök hücre kümelerini gösterir.

Alt tabakaya bağlı ve farklılaşmış hücreleri de görebilirsiniz. Bu, kaplamadan yedi gün sonra birincil E 14 nöros kök hücre kültürünün bir örneğidir. Gördüğünüz gibi, çeşitli boyutlarda küreler var.

Farklılaşmış hücreler de vardır. Enkaz miktarı, birincil yetişkin nöros küresinden çok daha düşüktür. Kültür. Ayrıca, küreler sıkıştırılmamıştır ve çevre çevresinde kürelerin sağlıklı ve canlı olduğunu gösteren mikro sivri uçlar vardır.

Kürenin çok büyümesine izin verilmemelidir, çünkü merkezdeki hücre ölümü nedeniyle renkleri koyulaşabilir. Büyük küreler de alt tabakaya yapışabilir ve farklılaşabilir. Bu, kaplamadan beş gün sonra Passage one E 14 nörokürelerine bir örnektir.

Burada yine kürelerin çevresindeki mikro Sivri Uçları görebilirsiniz. Size az önce nasıl yapılacağını gösterdik Burada açıklanan prosedürlerin aynısını izleyerek E 14 fare ganglionik üstünlüklerinden nörosferler yetiştirilir. Ayrıca korteks ve mezensefalon gibi beynin diğer nedenlerinden de nöroküreler yetiştirebilirsiniz.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve nöros küre kültürlerinizde iyi şanslar.