Name: Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Öğrenin, rekombinant AAV3 vektörleri üreterek karaciğer kanseri hücrelerine yüksek verimlilikte gen transferi sağlama yöntemini. Bu protokol, gen tedavisi araştırmalarında kritik uygulamalar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Dr teşekkür ederim. R. Jude Samulski cömertçe Hep293TT hücreleri sağlamak için rekombinant AAV3 ve AAV-EGFP plazmid, sırasıyla, ve Dr. Gail Tomlinson tür hediyeler ve Xiao Xiao. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Kamu Sağlık Hizmetleri hibe hibe R01 HL-076.901, R01 HL-097.088, P01 DK-058.327 (Proje 1) (AS) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Rekombinant adeno-ilişkili virüs serotip 3 (rAAV3) Vektörler Ambalaj <ol><li> Web sitesine gidin: " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "ve DNA miktarını hesaplamak. </li><li> Ön-mix FBS ve antibiyotik olmadan orta plazmid pHelper (Adenovirüs yardımcı), pACG2c3 (AAV yardımcı) ve pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vektör). Toplam hacmi on 15 cm 2 tabak için 8750 mcL olmalıdır. </li><li> Adım 1.2 DNA çözüm PEI doğrudan mcL 1.250 (% 0.1 m / v, Polysciences, Kedi # 23966, pH = 4.5) ekleyin. Vortex birkaç saniye için DNA-PEI çözüm. </li><li> 5 dakika oda sıcaklığında (RT) için bir kompleks oluşturacak şekilde inkübe DNA PEI çözüm. </li><li> DNA PEI çözüm 15 cm 2 plaka başına 1 ml ekleyin. </li><li> Taze 25 ml tam orta yerine, 4 saat sonra orta çıkarın +% 10 FBS (C-DMEM). </li><li> Yetmiş iki saat sonrası transfeksiyon, kazıma hücreleri ve 250 ml konik santrifüj tüpüne dökün. </li><li> 3000 rpm'de 4 Spin, ° C 10 dakika. Süpernatant kapalı dökün. </li><li> Yeniden askıya alma, RB TMS Tampon (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0) 5 ml hücre pelletini. Yeni bir 15 ml konik tüp transfer. </li><li> 37, 10 dakika ve çözülme için kuru buz-etanol banyo Dondurulmuş ° C 10 dak. Üç kez tekrarlayın. </li><li> 4.8 M MgCl 2 1 mcL ve 2 mcL Benzonase (25 U / ml, Novagen, Kedi # 70.664-3) ekleyin. Vortex ve inkübe 37 ° C de 40 dk. </li><li> Dakika süreyle 40 ° 4, 4,000 rpm'de C Spin ve süpernatantı toplamak (lizat açıklık). </li><li> , 2 ml,% 15% 25 2 ml, 1.5 ml% 40 ve bir 13 ml Hızlı-Seal santrifüj tüpüne (Beckman, Kedi # 342.413), yukarıdan aşağıya doğru yük iodixanol degrade (OptiPrep, Kedi # 1.114.542) 1.5 mL% 60 iodixanol. Iodixanol degrade üstüne süpernatant (Adım 1.12) yükleyin. RB TMS Buffer tüpler doldurun. </li><li> 16 1 saat süreyle 75.000 rpm Santrifüj ° C Beckman 90Ti rotor. </li><li> % 40 iodixanol fraksiyonu% 40-60 sınırında bir enjektör takarak toplayın. </li><li> % 40 iodixanol fraksiyonu, biri 50 ml konik tüp transferi ve Tampon ile 40 ml makyaj (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8.5). </li><li> Filtrasyon aparatı HiTrap S HP kolon (GE Healthcare, Kedi # 17-1154-01) kullanarak birleştirin. Aşağıdaki tamponu ile sütun yıkayın: 25 ml Buffer (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8.5); Tampon B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.5) 25 ml, 50 ml Tampon bir; Tampon olarak virüs örnek 40 ml, 50 ml Buffer (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8.5); 20 ml Tampon C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8.5); </li><li> 20 ml Apollo Konsantratörleri (Orbital Biosciences) Tampon C toplayın. 3.000 rpm'de santrifüj, 4 ° C 10 dk. </li><li> Flow-through atın ve 4, 3,000 rpm'de 20 ml soğutulmuş PBS ve santrifüj eklemek ° C'de 10 dk. </li><li> Flow-through atın ve soğutulmuş PBS 500 mcL ekleyin. -80 Küçük alikotları donmuş silikon tedavi Eppendorf tüpleri ve mağaza membran ve transfer ° C vektörleri yıkayın. </li></ol> 2. RAAV3 Vektör titreleri Belirlenmesi <ol><li> Buz üzerinde bir Eppendorf tüp virüs saflaştırılmış 10 mcL çözülme. GKD 2 O. 40 mcL ekle </li><li> 0.2 mcL Benzonase (25 U / ml, Novagen, Kedi # 70.664) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat süreyle. </li><li> Başka bir Eppendorf tüp plazmid standart (0.2 ng / ml) 50 mcL alın. </li><li> Her tüp ve 65 ° C'de 30 dakika için 100 mM NaOH 50 mcL ekleyin. </li><li> Hemen en az 5 dakika buz üzerinde soğutun. </li><li> Bio-Dot Filtre Kağıdı (Bio-Rad, Kedi # 1.620.161) göre transfer membran (Millipore, Kedi # INYC00010) kesin. 20 dakika için üç filtre kağıtları ile 10x SSC membran durulayın. </li><li> Yuvası leke SF Apparatus (Bio-Nokta, Kedi # 170-6542) ayarlayın. Bir termos bağlayın ve 10x DGM'nin yuvası leke aparatı 100 mcL ekleyin. </li><li> Adım 2.5 örneklerinin her 20x SSC 100 mcL ve 6x yükleme boya 1 mcL ekleyin. </li><li> Membran üzerine yuvası leke aparatı her örneklerinin 100 mcL yükleyin. </li><li> 10x SSC başka örneklerin her birine 100 mcL ekleyin. </li><li> 2.9 ve 2.10 adımları örnek zarından girene kadar tekrarlayın. </li><li> Slot leke aparatı sökün ve membran çıkarın. Müfettiş Linker SL-1000 UV Çapraz içine koyun. "Enerji", "Turn Optimal çapraz bağ" (Show 1200) ve "Başlat" itin. </li><li> DNA (Fisher, Kedi # NC9753983) 5 dakika boyunca kaynatın 1 somon sperm mL (SS). En az 5 dakika buz üzerinde soğutun. </li><li> 27.5 ml, 15 ml GKD 2 O karıştırma öncesi hibridizasyon solüsyonu hazırlayın 20x 50x Denhardt çözümü SSC, 5 ml, 1.25 ml% 20 SDS, Polya 0.25 ml ve 2.13 Adım SS DNA 1 ml. </li><li> 25 ml, 65 ° C hibridizasyon odasında gece bir kapaklı cam silindir ve inkübe-hibridizasyon öncesi çözüm membran askıya alınması. </li><li> GKD 2 O 10 mcL 50 ng DNA şablonları sulandırınız. Kaynatın, 100 ° C en az 5 dakika boyunca buz üzerinde hemen 5 dakika ve soğuk için. </li><li> 1 dakika 3.000 rpm'de RT santrifüjleyin. 10 mM 3 dNTP 2 mcL (dCTP eksik), (2) Hexanucleotide Mix mcL (Roche, Kedi # 11277081001), 1 mcL Klenow (Roche, Kedi # 11008404001) ve -32 α P-dCTP 5 mcL ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin. </li><li> 2 dakika süreyle 3000 rpm'de G-50 Sütunlar (GE Healthcare, Kedi # 27-5330-01) santrifüjleyin. Adım 2.17 sütuna prob yükleyin. 2 dakika süreyle 3000 rpm'de santrifüj ve flow-through toplamak. </li><li> Radyoaktivite Kont. Prob için 100 ° C 5 dakika ve soğuk 'hemen buz üzerinde en az 5 dakika kaynatın. </li><li> Membran ile ön hibridizasyon çözüm prob (6x10 5 kopya / ml) ekleyin. </li><li> Hibridizasyon odasında 65 ° C'de bir gece inkübe edin. </li><li> Hibridizasyon çözüm atın ve 15 dakika süreyle RT 2x SSC +0.1% SDS membran durulayın. </li><li> Çözüm atın ve 30 dakika süreyle 65 ° C 0.1x SSC +0.1% SDS membran durulama. </li><li> Çözüm atın ve RT kısaca 0.1x SSC membran durulayın. </li><li> -80 ° C'de 6 saat film film ortaya çıkarmak ve geliştirmek. Tipik bir sonuç Şekil 1'de gösterilmiştir. </li></ol> 3. rAAV3 Vektör aracılı İletimi ve İnsan Karaciğer Kanseri Hücrelerinde Transgen İfade <ol><li> 96 plaka her iyi Tohum 1x10 4 hücreleri (HuH7 veya Hep293TT ya). Nemlendirilmiş bir CO 2 inkübatör içinde en az 18 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 96-plaka orta çıkarın. </li><li> FBS ve antibiyotik olmadan orta 50 mcL hücreler iki kez yıkayın ve kaldırmak. </li><li> Orta 5,000 VGS / hücre FBS ve antibiyotik ve rAAV vektörlerin olmadan 50 mcL ekleyin. </li><li> CO 2 inkübatör plakalar 4 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Orta atın. 50 mcL tam orta hücreler iki kez yıkayın ve kaldırmak. </li><li> C-DMEM her bir kuyunun 150 mcL ekleyin ve 72 saat için CO 2 inkübatör plaka inkübe ve floresan mikroskop kullanılarak EGFP ifade görselleştirmek (DMİ 4000B; Leica Microsystems). </li><li> Virüsle enfekte olan hücreleri üç kuyu Görüntüler ImageJ analiz yazılımı (NIH, Bethesda, MD, ABD) tarafından kantitatif analiz edilmektedir. </li><li> Transgen ifade görme alanı başına düşen yeşil floresan toplam alanı (piksel 2) olarak değerlendirilir . Tipik bir sonucu, Şekil 2'de gösterilmiştir. </li><li> Transgen ifade Sitometrisi ile de tespit edilebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Yukarıda belirtilen protokolün ardından, verimli AAV serotip vektör üretebilirsiniz. Tipik verim ~~ 500 mcL ~ 10 11 VGS içeren saflaştırılmış vektör stok / mcL. Vektör stokunun saflık ve Benzonase sindirim olmadan, kantitatif DNA yuvası blot hibridizasyon sinyalleri karşılaştırarak tarafından belirlenir. Saf hücre hatları - hepatoblastom (HB) ve hepatosellüler karsinom (HSK) - rAAV3 vektörler transduce insan karaciğer kanseri verimli. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 rAAV3 vektörlerin titreleri belirlemek için nicel DNA slot-blot analizi. Benzonase (üst satır) ile sindirilir viral hisse senetleri, saflaştırılmış iki kat dilüsyonları 32 P-etiketli EGFP-spesifik DNA probu ile kantitatif DNA yuvası leke incelendi. 1 ng (orta sıra) veya 10 ng (alt sıra) membran yüklenen AAV-EGFP plazmid standartları ile karşılaştırıldığında AAV3 vektör titresi tespit edildi. Numaraları DNA kopyası karşılık. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Rekombinant AAV insan karaciğer kanser hücrelerini vektör aracılı transgen ifadesi. Hep293TT hücreleri, kısa bir süre önce kurulan insan hepatoblastom hücre hattında 4, ya sahte enfekte (sol panel), ya da 2 saat boyunca 37 ° C'de scAAV2-EGFP veya scAAV3 EGFP vektörler 5000 VGS / hücre transduced . Transgen ekspresyonu 72 saat sonrası transdüksiyon floresan mikroskop kullanılarak görüntülendi.

<ol><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).</li>
<li>Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV3-mediated+transfer+and+expression+of+the+pyruvate+dehydrogenase+E1+alpha+subunit+gene+causes+metabolic+remodeling+and+apoptosis+of+human+liver+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+%26+Metabol%22%5BJournal%5D)">AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells.</a> Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).</li>
<li>Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+growth+factor+receptor+is+a+cellular+coreceptor+for+adeno-associated+virus+serotype+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3.</a> Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).</li>
<li>Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+cancer+cell+line+derived+from+an+aggressive+childhood+liver+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Blood+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor.</a> Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+adeno-associated+virus+2+vectors%3A+point+mutations+in+tyrosines+lead+to+high-efficiency+transduction+at+lower+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).</li>
<li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+the+mouse+retina+by+tyrosine-mutant+AAV+serotype+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors.</a> Mol Ther. 17, 463-471 (2009).</li>
<li>Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+adeno-associated+virus+%28AAV%29-protein+phosphatase-5+helper+viruses+for+efficient+liver+transduction+by+single-stranded+AAV+vectors%3A+therapeutic+expression+of+factor+IX+at+reduced+vector+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses.</a> Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).</li>
<li>Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).</li>
<li>Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+transduction+and+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+stem+cells+transduced+with+tyrosine-modified+recombinant+adeno-associated+virus+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2.</a> Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).</li>
<li>Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+6+capsid+tyrosine-to-phenylalanine+mutations+improve+gene+transfer+to+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle.</a> Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).</li>
<li>Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+and+correction+of+murine+hemophilia+B+using+AAV2+vectors+devoid+of+multiple+surface-exposed+tyrosines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines.</a> Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).</li>
<li>Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+PDH+deficiency+using+AAV8-siRNA+vector-mediated+knockdown+of+pyruvate+dehydrogenase+E1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+%26+Metabol%22%5BJournal%5D)">An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α.</a> Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).</li>
<li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+properties+of+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina.</a> Mol Ther. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Patojen olmayan bir insan parvovirus, adeno-ilişkili virüs (AAV) dayanan rekombinant vektörler geliştirilen ve şu anda bir dizi gen tedavisi klinik çalışmalarda 5 edilmiştir . Önceleri en yaygın olarak kullanılan 10 AAV serotipleri, genel olarak AAV3 vektörlerin transdüksiyon etkinliğini in vitro ve in vivo 1 hem de, özellikle düşük olduğu bildirilmiştir. Ancak, son gözlem AAV3 flow sitometri 2 ile kantitatif tespit son derece iyi vektörler transduce insan karaciğer kanser hücresi hatlarında, ve bu AAV3 bu bağlayıcı ve giriş için ortak bir hücresel reseptör olarak insan hepatosit büyüme faktörü reseptörü (hHGFR) kullanır hücreleri 3, özellikle de güçlü AAV3 genel olarak insan karaciğer hücreleri için selektif doku-tropizm ve insan karaciğer kanseri hücrelerinin öneririz. Ancak, AAV3 vektörler aynı zamanda normal insan hepatositleri verimli 2 transduce, in vivo kanser gen tedavisi uygulama potansiyellerini kullanabilecekleri olumsuz etkiledi olacaktır . Bu olası sorunu aşmak için olası bir strateji gerektirir transkripsiyonel hedef normal hepatositler tarafından değil seçici olarak tümör tarafından üretilen bir gen ürünü tespit ederek, kanser hücrelerinin, ancak. Örneğin, normal hepatositler genellikle çok küçük miktarlarda üretmek önceki çalışmalarda, belirli bir varlığı, ilerleme, ve / veya karaciğer kanserlerinin bazı türleri tekrarını izlemek için işaretleyici olarak kullanılan serum α-fetoprotein (AFP) düzeyleri olduğunu göstermiştir bu proteinin. Nitekim, biz, karaciğer kanser hücrelerini transgen ifade hedef AFP organizatörü içeren AAV3 vektörler kullandık, ama şu anda normal hepatositler 2 ve çalışmalar karaciğer kanseri bir fare xenograft modeli bu yaklaşımın etkinliğini test etmek için çalışmalar devam etmektedir. Ek çalışmalar, 6-14 viral capsids yüzey maruz tirozin kalıntılarının site-directed mutagenesis çeşitli AAV serotip vektörler transdüksiyon etkinliğini önemli ölçüde artar olabileceğini gözlemledim . 6 7 yüzey maruz tyrosines AAV3 korunmuş olduğundan, biz bu kalıntıların site-directed mutagenesis ve tirozin-mutant AAV3 vektörlerin transdüksiyon etkinliğini önemli ölçüde insan karaciğer kanseri hücrelerinin (yayınlanmamış veri) gelişmiş olduğu görülmektedir. Araştırmalar aynı zamanda, insan hepatoblastom ve hepatosellüler karsinom için fare xenograft modelleri tirozin-mutant AAV3 vektörler güvenlik ve etkinliğini değerlendirmek için şu anda devam etmekte olup, başarılı olursa, optimal tirozin-mutant AAV3 serotip vektörleri insan karaciğer hedeflemesi için yararlı olduğu ortaya çıkabilir potansiyel gen tedavisi için kanserleri.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaz</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP kolonu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Somon spermi DNA'sı</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol gradyanı</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>G-50 Kolonları</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant adeno associated virus serotip 3 vektörler karaciğer kanseri hücreleri yüksek verimlilik İletimi

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Olmayan bir patojen insan parvovirus dayanan rekombinant vektörler, adeno-ilişkili virüs 2 (AAV2) geliştirilen ve gen tedavisi klinik çalışmalarda bir dizi şu anda kullanımda olan olmuştur. Daha yakın zamanlarda, bir dizi ek AAV serotiplerinin ayrıca çeşitli küçük ve büyük hayvan modellerinde 1 doku tropizm seçici sergilemek edildiği, izole edilmiştir. En sık kullanılan 10 AAV serotipleri, AAV3 gibi in vivo ve in vitro hücre ve dokulara geçirilmesinde kadar en az verimli . AAV3 bağlama için ortak bir hücresel reseptör olarak insan hepatosit büyüme faktörü reseptörü kullanır, çünkü son derece verimli bir hücre hatları - hepatoblastom (HB) ve hepatoselüler karsinom (HSK) - Ancak, son zamanlarda yayınlanan çalışmalarda, biz AAV3 vektörleri insan karaciğer kanseri transduce belgelediler bu hücrelerin 2,3 ve giriş. Bu makalede, biz bir muhabir geni taşıyan rekombinant AAV3 vektörleri insan karaciğer kanser hücrelerini yüksek verimlilik transdüksiyon ulaşmak için gerekli adımları açıklar. Terapötik bir geni taşıyan rekombinant AAV3 vektörlerin kullanımı sonunda, insanlarda karaciğer kanseri potansiyel gen tedavisi neden olabilir.

Bu makalede, insan karaciğer kanser hücrelerini hedef için en verimli bir vektör olarak adeno-ilişkili virüs serotip 3 (AAV3) tanımlanması için.

Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi

Patojenik olmayan bir insan parvovirüsü olan adeno-ilişkili virüs 2 (AAV2) tabanlı rekombinant vektörler geliştirilmiştir ve şu anda bir ... içinde kullanılmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, insan karaciğer kanseri hücrelerini verimli bir şekilde transduse edebilen aktif adeno-ilişkili virüs serotip üç vektörleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle üç farklı plazmidin eş zamanlı olarak 2 9 3 hücrelerine transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, 2 9 3 hücrelerinde birleşen AAV üç viryonlarının saflaştırılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, saflaştırılmış AAV üç vektör stokunun titrasyonunu belirlemektir. Prosedürün son adımı, saflaştırılmış AAV üç vektörleri kullanarak insan karaciğer kanseri hücrelerini transduse etmektir. Sonuç olarak, floresan mikroskobu aracılığıyla insan karaciğer kanseri hücrelerinde yüksek düzeyde eksprese edilen EGFP proteinini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, insan karaciğer kanseri hücrelerinde yüksek gen transferi ve ekspresyon verimliliği sağlamasıdır. Bu yöntem, AAV3 vektörlerinin üretimine dair içgörü sağlayabilmenin yanı sıra, daha yaygın olarak kullanılan AAV2 vektörleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sıkıcı olabilen çok sayıda adımın dahil olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır; prosedür, laboratuvarımızdan bir biyolog tarafından gösterilecektir.Protokolün bu bölümündeki deneysel manipülasyonlar, bu prosedüre başlanmadan 48 saat önce bir doku kültürü davlumbazı içinde gerçekleştirilir. Transfeksiyon gününde hücrelerin %70 ila %80 konfluens düzeyine ulaşması için 10 adet 15 santimetrelik doku kültürü plağına insan embriyonik böbrek hücre hattı 2, 9 3 ekleyin. Web sitesini kullanın www.Transfeksiyon için kullanılacak plazmid DNA miktarını hesaplamak için ge shae. com/calc adresini kullanın. Plazmid DNA'nın doğru hacimleri hesaplandıktan sonra, transfeksiyona geçerek FBS ve antibiyotik içermeyen uygun hacimde hücre kültür ortamını steril bir 15 mililitrelik tüpe pipetleyin.Ardından, gerekli hacimlerde P helper, PACG two, C3 ve PDSA AAV C-B-E-G-F-P'yi besiyerine pipetleyin. 10 15 cm'lik plaklar için toplam hacim 8.750 µL olmalıdır. Plazmit DNA içeren besiyerine 1.250 µL PEI pipetleyin; DNA-PEI çözeltisini birkaç saniye vortexleyin, ardından DNA-PEI komplekslerinin oluşması için DNA-PEI çözeltisini oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. HEC 2 9 3 hücrelerinin bulunduğu 10 15 cm'lik plakları doku kültürü inkübatöründen çıkarın.Ardından, plakların her birine bir mikrolitre D-N-A-P-E-I çözeltisi pipetleyin. Plakları, bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında dört ila altı saat boyunca inkübe edin. Dört ila altı saat sonra, plaklardaki besiyerini dikkatlice aspire edin.Ardından, her bir plakaya %10 FBS içeren 25 mililitre komple besiyeri pipetleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında yaklaşık 72 saat inkübe edin. 72 saat geçtikten sonra plakaları inkübatörden çıkarın ve doku kültürü kabinine geri götürün.Ardından, plaktaki besiyerini aspire etmeden, hücre tabakasını plağın tabanından hücre kültürü besiyerine sıyırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri içeren besiyerini 250 mililitrelik konik bir santrifüj tüpüne boşaltın. Bu prosedürü transfekte edilen plakların her biri için tekrarlayarak, her plağın içeriğini aynı 250 mililitrelik konik santrifüj tüpüne boşaltın.Hücreleri ve besiyerini içeren tüpü soğutulmuş bir santrifüjde döndürün. 4 °C'de 10 dakika boyunca 3000 rpm hızda santrifüj edin. Santrifüj işleminin ardından süpernatanı atın, ardından peletin üzerine beş mililitre RB TMS tamponu ekleyin ve yeniden süspande edin. Hücre solüsyonunu temiz bir 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın.15 mililitrelik tüpü, 10 dakika boyunca dondurmak için kuru buz etanol banyosuna yerleştirin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra tüpü çıkarın ve 10 dakika boyunca 37 °C'ye yerleştirin. Çözmek için bu dondurma-çözme döngüsünü iki kez daha tekrarlayın.Tüpü birkaç saniye boyunca vorteksleyin. Son çözündürme periyodundan sonraki her çözündürme işleminden sonra, hücre solüsyonuna bir mikrolitre 4.8 molar magnezyum klorür ve iki mikrolitre 25 units per microliter Benon nase ekleyin ve karıştırmak için vorteksleyin.Ardından, inkübasyonun ardından 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin. Tüpü 4 °C'ye soğutulmuş bir santrifüje yerleştirin ve 4.000 rpm hızında 40 dakika boyunca döndürün; santrifüjleme süresinin sonuna doğru, virüsün saflaştırılması için kullanılacak IAL gradyanını hazırlayın. Bunun için 13 ml'lik sızdırmaz bir santrifüj tüpüne 2 ml %15, 2 ml %25, 1,5 ml %40 ve 1,5 ml %60 IAL pipetleyin.Santrifüjleme işleminden sonra, hücre peletini dağıtmamaya dikkat ederek santrifüj tüpündeki S süpernatantını pipetle çekin, süpernatantı IAL gradyanının üzerine ekleyin ve ardından tüpü tamamen dolduracak kadar RB TMS tamponu ekleyin. Rotorun düzgün şekilde dengelendiğinden emin olarak tüpü bir Beckman 90 TI rotoruna yerleştirin. 16 °C'de, dakikada 75.000 devir hızında bir saat boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işleminin ardından, 18 gauge iğne takılmış beş mililitrelik bir şırıngayı idal gradyanındaki %40 ile %60 sınırına yerleştirerek %40'lık IAL fraksiyonunu toplayın. Şırıngayı dikkatlice aspire ederek %40'lık idal fraksiyonunu toplayın.%40'lık IAL fraksiyonunu şırıngadan 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Ardından tüpü, tampon a ile 40 mililitrelik nihai hacme tamamlayın. Filtrasyon düzeneğini, üretici talimatlarına uygun olarak bir high trap Q HP kolonu kullanarak kurun.Ardından kolonu şu çözeltilerle yıkayın: 25 mililitre tampon A, 25 mililitre tampon B, 50 mililitre tampon A, tampon A içerisinde hazırlanmış 40 mililitre idal virüs örneği, 50 mililitre tampon A ve son olarak 20 mililitre tampon C. Tampon C'yi 20 mililitrelik bir Apollo konsantratöründe toplayın. Daha sonra örneği, dört °C'ye ayarlanmış soğutmalı bir santrifüjde 10 dakika boyunca 3000 rpm hızında santrifüjleyin; santrifüj işleminden sonra akış sıvısını atın.Ardından Apollo konsantratörüne 20 mililitre soğutulmuş PBS ekleyin ve santrifüjlemeden sonra, soğutulmuş bir santrifüjde dört derece santigrat sıcaklıkta 10 dakika boyunca 3000 devir/dakika hızda tekrar santrifüjleyin. Akış sıvısını tekrar boşaltın, virüsü membrandan yeniden süspande etmek için membranın üzerine 500 mikrolitre soğutulmuş PBS pipetleyin. Daha sonra viral vektörü silikon işlemeli endotüp lere 10 mikrolitrelik alikotlar halinde pipetleyin ve kullanıma kadar eksi 80 derece santigrat sıcaklıkta saklayın; saflaştırılmış virüsün 10 mikrolitrelik alikotlarından birini buz üzerinde çözdürün.Virüsü seyreltmek için tüpe 40 µL çift distile su pipetleyin. Ardından 0.2 µL 25 units/µL Ben Nase ekleyin ve karışımı 37 °C'de bir saat inkübe edin. Bu sırada, temiz bir eend orph tüpüne 50 µL 0.2 ng/µL plazmid standardı pipetleyin.İnkübasyonu takiben, virüsü içeren tüpe 50 µL 100 mM sodyum hidroksit ekleyin. Bens aase karışımını ve plazmit standardını içeren tüpe ekleyin. Her iki tüpü 65 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.30 dakika geçtikten sonra, her iki tüpü derhal en az beş dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Ardından, transfer membranından bir parçayı, bio dot filtre kağıdıyla aynı boyutta olacak şekilde kesin. Transfer membranını ve üç parça bio filtre kağıdını sığ bir tepsiye yerleştirin.Tepsiyi 10 kat SSC ile doldurun ve membran ıslandığı sırada 20 dakika boyunca bekletin. Slot blok SF aparatını üreticinin talimatlarına göre kurun. Aparatı bir vakum flaskına bağlayın, ardından virüs örneği dilüsyonu ve plazmid standardı ile yüklenecek her bir slota 100 microliters 10 kat SSC pipetleyin.Tüpleri, 4 °C'ye ayarlanmış soğutmalı santrifüjde 13.000 rpm'de bir dakika boyunca çevirdikten sonra çıkarın. Ardından, her tüpe 100 µL 20x SSC ve 1 µL 6x yükleme boyası ekleyin. Daha sonra her tüpe 100 µL daha 10x SSC pipetleyin ve her örneğin 100 µL'sini yan yana kuyucuklara yükleyin.Her bir örneğin toplam hacmi slot bloğu düzeneğine yüklenene ve 10 kat SSC'den 100 µL veya daha az hacimde eklemeler tamamlanana kadar dilüsyon ve yükleme prosedürünü tekrarlayın. Tüm örnekler membrandan geçtikten sonra, slot bloğu düzeneğini sökün ve membranı pensetle çıkarın. Membranı kenarlarından tutmaya özen gösterin ve membranı inspector linker SL 1000 UV crosslinker cihazının haznesine yerleştirin.Ardından, enerji optimalli çapraz bağlama seçeneğini belirleyin; çapraz bağlama işlemi yaklaşık 30 saniye sürmelidir. Şimdi, 1 mL somon spermi DNA'sını beş dakika boyunca kaynatarak hibridizasyon için hazırlayın. Beş dakikalık kaynatma işleminin ardından, somon spermi DNA'sı derhal buz üzerinde en az beş dakika boyunca soğutulmalıdır.Ardından, yazılı protokole uygun olarak ön hibridizasyon çözeltisini hazırlayın. Salmon sperm DNA'sı içeren 25 mililitre ön hibridizasyon çözeltisini bir hibridizasyon tüpüne pipetleyin. Çapraz bağlanan membranı dikkatlice hibridizasyon tüpüne aktarın ve ardından ön hibridizasyon çözeltisinin membranı tamamen kapladığından emin olarak tüpün kapağını kapatın.Yatay pozisyondayken, bir hibridizasyon odasında 65 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bir ependorf tüpüne 50 ng DNA kalıbı pipetleyip seyreltmek için 10 µL çift distile su ekleyerek prob hazırlığına başlayın, seyreltilmiş DNA'yı beş dakika boyunca kaynatın ve ardından hemen buz üzerinde en az beş dakika soğutun. Seyreltilmiş DNA kalıbını oda sıcaklığında bir dakika boyunca 13.000 rpm'de santrifüjleyin.Ardından kurumun radyoaktivite güvenlik kılavuzlarına uygun olarak çalışın. DCTP içermeyen 10 millimolar DN TPS'den iki mikrolitre ve iki mikrolitre heksa nükleotid ekleyerek radyoaktif probu hazırlayın. Bir mikrolitre AU ile beş mikrolitre 32 P-D-C-T-P'yi karıştırın ve 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından işlemi tamamlayın.G 50 kolonlarını dakikada 3000 devirde iki dakika boyunca santrifüj ederek hazırlayın. Ardından probu kolona yükleyin ve numunenizi dakikada 3000 devirde iki dakika boyunca santrifüj ederek akış sıvısını toplayın. Bu noktada, probun mililitre başına dakika başına sayım değerini belirlemek için akış sıvısının radyoaktivitesi standart prosedürler kullanılarak ölçülür.Ardından, probu beş dakika boyunca kaynatın. Bunun ardından, probu derhal beş dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Prob, membran çıkarılmadan hibridizasyon için kullanılmaya hazırdır.Probun mL başına beş sayım/dakika konsantrasyonunun altı katı miktarını, hibridizasyon tüpündeki pre-hibridizasyon solüsyonuna doğrudan pipetleyin. Hibridizasyon haznesini 65 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hibridizasyon solüsyonunu kurumsal radyoaktivite protokollerine uygun olarak atın, tüpe 25 mL 2X SSC + 0,1% SDS pipetleyin ve membranı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yıkayın.Çözeltiyi atın ve tüpe 25 mililitre 0.1 kat SSC artı %0.1 SDS pipetleyin. Membranı 65 °C'de 30 dakika boyunca yıkayın. Bu yıkamanın ardından çözeltiyi atın ve membranı oda sıcaklığındaki 25 mililitre 0.1 kat SSC ile kısaca durulayın.Membranı streç filmle sarın ve karanlık odada çalışarak bir pozlama kasetine yerleştirin. Membranın üzerine bir film parçası yerleştirin ve ışıktan korumak için kaseti kapatın. Pozlama kasetini altı saat boyunca -80 °C dondurucuya yerleştirin.Altı saat sonra. Filmi geliştirin ve viral bantların yoğunluğunu plazmit standartlarından gelen bantlarla karşılaştırarak viral stokların titresi belirleyin. Titre belirlendikten sonra, virüs hücreleri transduse etmek için kullanılabilir; öncelikle 1x10⁴ Hep 2 93 TT hücresi ekleyin.Bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğunda hücreleri, 37 °C'de %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde en az 18 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her kuyucuktaki medyumu aspire edin ve her birine dikkatlice 50 µL antibiyotiksiz ve FBS'siz medyum pipetleyin. Bu medyumu aspire edin ve hücreleri yıkamak için işlemi tekrarlayın.Rekombinant a a v vektörlerini, FBS ve antibiyotik içermeyen besiyerinde hücre başına 5.000 VGS nihai konsantrasyonuna seyreltin. Bu solüsyondan 50 µL veya negatif kontrol olarak FBS içermeyen besiyerinden 50 µL'yi 96 kuyucuklu plakadaki kuyucuklara ekleyin ve 37 °C, %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, virüs içeren besiyerini uzaklaştırın ve her kuyucuk için 50 µL komple besiyeri kullanarak hücreleri daha önce yaptığınız gibi iki kez yıkayın.Son yıkama işlemi sonrası sıvıyı boşaltın, her kuyucuğa 150 µL komple besiyeri ekleyin ve plakayı 37 °C'de %5 CO2 içeren bir inkübatörde 72 saat boyunca inkübe edin. Son olarak, EGFP ekspresyonunu floresan mikroskopi kullanarak gözlemleyin. Floresan yoğunluğu, Image J yazılımı ile nicelleştirilebilir ve trans gen ekspresyonu, görüş alanı başına toplam yeşil floresan alanı olarak değerlendirilebilir.RAV3 vektörlerinin titrasyonunu belirlemek için kullanılan kantitatif bir DNA slot blok örneği burada gösterilmiştir. Bu membran, P 32 etiketli EGFP'ye özgü DNA probu ile analiz edilmiştir. Bloğun üst sırası, Ben Nase ile sindirilmiş saflaştırılmış viral stokların iki katlı dilüsyonlarını içermektedir.Orta ve alt sıralar, sırasıyla bir nanogram veya 10 nanogram plazmidden dilüe edilen A-A-V-E-G-F-P standartlarından oluşmaktadır. Viral stokların titresi, plazmid standartları ile karşılaştırılarak belirlenir. Blot üzerinde gösterilen sayılar, plazmid DNA kopya sayısına karşılık gelmektedir.Bu, rekombinant bir AAV vektör aracılı transgen ekspresyon örneğidir. İnsan hepatoblastoma hücre hattındaki hücreler, transdüksiyondan 72 saat sonra floresan mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. İlk görüntü, yalancı enfeksiyonun sonuçlarını göstermektedir.İkinci görüntü, tüm AAV2 EGFP vektörleri ile hücre başına 5,000 VGS dozunda, 37 °C'de iki saat boyunca transduksiyonu gerçekleştirilmiş HEP 2 93 TT hücrelerini göstermektedir. Son görüntü, aynı koşullar altında hücre başına 5,000 VGS dozunda RAAV3 EEG FP ile yapılan transduksiyonu göstermektedir. RAAV3'ün, bu hücre tipini transdukte etmede RAAV2'ye kıyasla çok daha verimli olduğu görülmektedir.Bu yöntem, insan karaciğer kanseri hücrelerinin nasıl hedefleneceği gibi gen tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, V üç'ün terapötik geni özellikle insan karaciğer kanserinde yüksek düzeyde eksprese etme yeteneği nedeniyle, insan karaciğer kanseri tedavisine kadar uzanmaktadır.

high-efficiency-transduction-liver-cancer-cells-recombinant-adeno

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz, moleküler DNA aile karıştırma yoluyla sentetik Adeno ilişkili viral (AAV) gen tedavisi vektörleri mühendisi ve gelişmeye temel tekniği göstermek. Ayrıca, biz seçimi ve kültür veya farelerde hedef hücreler üzerinde gelişmiş özellikleri ile bireysel kimerik capsids analizi için genel kurallar ve temsili örnekler sunuyor.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Kaynak: Hiller, T., et al. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp., (2016)Bu video, insanlaştırılmış bir sıçan karaciğer iskeletinde adeno-ilişkili virüs aracılı gen iletimini göstermektedir. Vektör, floresan bir raporlayıcıyı ve gen susturucu RNA'yı kodlayan bir transgeni, reseptör aracılı endositoz yoluyla karaciğer hücrelerine iletir. Bu model, perfüze edilmiş 3D bir karaciğer doku sisteminde...

Adeno-ilişkili Virüs Vektörleri Kullanarak Hümanize Sıçan Karaciğerinin Transdüksiyonu

Kaynak: Hiller, T. et. al. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, reselülerize edilmiş bir sıçan karaciğer modelinde viral gen transferini değerlendirmek için yapılan immünohistokimyasal boyamayı göstermektedir. Antikor tespiti ve nükleer boyama ile ko-lokalizasyonuyla doğrulanan raporlayıcı ekspresyonu, hücrelerdeki başarılı viral transduksiyonu göstermektedir.

İmmünohistokimyasal Boyama Kullanılarak Resellülerize Sıçan Karaciğerinde Viral Transdüksiyonun Doğrulanması

Video, hepatosellüler karsinom için terapötik bir yaklaşım olarak hepatik arteriyel enjeksiyon yoluyla onkolitik virüslerin lokorejyonel olarak verilmesini göstermektedir. Bu virüsler seçici olarak tümör hücrelerinde çoğalır, hücre lizizini indükler ve tümör hücresi ile ilişkili antijenleri serbest bırakır. Bu süreç, immünojenik hücre ölümünü tetikleyerek bir anti-tümör tepkisine neden olur.

Hepatik Arter Yoluyla Onkolitik Virüslerle Karaciğer Tümörlerinin Hedeflenmesi

Onkolitik viroterapiler, hepatosellüler karsinom (HCC) tedavisinde yeni terapötikler olarak geliştirilme aşamasındadır.  Burada, onkolitik virüsün hepatik arteriyel uygulaması yoluyla HCC'nin lokorejyonel tedavisi için bir yöntem tanımlanmıştır.

Sıçanlarda Ortotopik HCC Lokorejyonel Tedavisi için oncolytic virüs transarteryel İdaresi

Decellularized bir sıçan karaciğerinin hücreselleştirilmiş hücre dışı matrisi, bir virüsün veya viral vektörün dağılımını ve transgen ekspresyonunu incelemek için insanlaştırılmış, üç boyutlu bir ex vivo model olarak kullanılabilir.

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

Kolorektal kanser (KRK) organoidlerinin portal ven enjeksiyonu stroma bakımından zengin karaciğer metastazı oluşturur. CRC hepatik metastazının bu fare modeli, tümör-stroma etkileşimlerini incelemek ve adeno ilişkili virüs aracılı gen terapileri gibi yeni stroma yönelimli terapötikler geliştirmek için yararlı bir araçtır.

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Burada, yetişkin farelerde adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak uygulamak için fare lateral kuyruk veni enjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırıyoruz. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tahlillerin protokollerini açıklıyoruz.

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Bu protokol, AAV8 ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonunun, karaciğerde portal ven enjeksiyonu ile aynı gen yıkım etkinliğini nasıl sağladığını açıklar ve çok daha düşük perioperatif ve postoperatif mortalite ve komplikasyonlar ile daha basit bir prosedürü temsil eder.

Adeno-ilişkili virüs serotip 8 (AAV8) ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonu yoluyla karaciğerde etkili gen yıkımı

Öğrenin, rekombinant AAV3 vektörleri üreterek karaciğer kanseri hücrelerine yüksek verimlilikte gen transferi sağlama yöntemini. Bu protokol, gen tedavisi araştırmalarında kritik uygulamalar sunar.

Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi

Daha fazla video keşfet