Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Iris olarak adlandırılan hassas ve etiketsiz bir algılama platformu ile antikorların yüzeye immobilize edilmiş antijenlere bağlanmasını nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle çözeltiden hedeflenen proteinleri yakalamak için kimyasal olarak fonksiyonelleştirilmiş tekdüze bir silikon dioksit yüzey üzerinde bir dizi test ve kontrol probu hazırlanarak gerçekleştirilir. İmmobilize edilen problar; antikorlar veya antijenler, DNA veya RNA ya da fonksiyonelleştirilmiş, polimerik veya benzer yüzey kimyalarıyla uyumlu herhangi bir başka makromolekül türü olabilir.

Hazırlanan mikro dizi, ardından araştırmacı tarafından belirtilen koşullar altında bağlanmanın gerçekleşmesini sağlamak için ilgi duyulan proteinleri içeren bir örnekle inkübe edilir. Daha sonra, tüm sensör dizisinin farklı ışık dalga boylarında görüntülemesi yapılır. IRIS sistemi ile her bir piksel için yansıtılan yoğunluklar, özel kodlanmış algoritmalarla işlenir.

Her bir test veya kontrol koşuluna bağlanan biyomalzeme miktarını nicelendirmek amacıyla, bu sistemin interferometrik etiketsiz ölçümlerine dayanarak kompleks bir karışım içindeki antikorların etkili tespitini ve mutlak nicelendirmesini gösteren inkübasyon sonrası sonuçlar elde edilir. Optik girişim ve reçine boşluklu cihazlar üzerine on yılı aşkın araştırma ve geliştirme çalışmalarından yararlanarak, önceki etiketsiz biyosensör sistemlerimizde karşılaştığımız birçok karmaşık sorunu aşabilecek bu yeni yöntemi geliştiriyoruz. Veri toplama basamaklarının doğru normalizasyon gerektirmesi ve kalite kontrol prosedürlerinin takip edilmesi nedeniyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Bu, doğru ve tekrarlanabilir veri alımını sağlamak içindir.

Silisyum dioksit altlıklarını kendi kendine emen copo dmma NAS haritalarıyla kaplamak için, 5 mililitre deiyonize suya 100 miligram polimer ekleyerek polimer çözeltisini hazırlayın. Ardından, nihai amonyum sülfat konsantrasyonu 0,92 molar olacak şekilde 5 mililitre %40 doygun amonyum sülfat ekleyin. İnkübasyonun ardından, çipleri bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca polimer çözeltisine daldırın.

Çipleri deiyonize su ile iyice durulayın, argon veya azot gazı ile kurulayın ve ardından 80 °C'de 15 dakika boyunca pişirin. Polimer kaplı substrat çiplerini, her bir probu seyreltecek prob noktalama prosedürüne kadar iki ila üç ay boyunca vakum desikatörü gibi kuru bir ortamda saklayın. İlk olarak, istenen nihai konsantrasyona ulaşmak için gereken prob stok çözeltisi ve tampon çözelti hacimlerini belirleyin.

Tipik bir deneyde, hesaplanan miktardaki her bir prob stok çözeltisi, istenen miktarda PBS tamponu içeren küçük eppendorf tüplerine eklenerek, fosfat tamponlu salinde 0,5 mg/mL konsantrasyonda antijen veya IgG kullanılır ve çözeltiler karıştırılır. Ardından, spotter için kaynak plaka olarak kullanılacak olan 96 kuyucuklu düşük protein bağlamalı bir plakaya prob çözeltileri pipetlenir. Sonrasında, ızgara başına her bir koşulun tekrar sayısı belirlenerek basılı dizi için spotting parametreleri ayarlanır.

Izgara düzeni, replika ızgara sayısını ve çip üzerindeki istenen damlatma konumunu belirler. Substratı ve kaynak plakayı damlatıcıya yerleştirin, ardından atık ve besleme şişelerini kontrol edin. Baskı işlemini başlatın.

Benekleme işlemi tamamlandıktan sonra, inkübasyonu takiben immobilizasyon ve deaktivasyon sürecinin ilerlemesi için substratı gece boyunca yüksek nemli bir ortama yerleştirin. Substratları, önce çipi 0,1%tween içeren PBS içinde üç dakika boyunca, üç ayrı kez yerleştirerek ajitasyonla yıkayın. Bunu, PBS içinde ve ardından deiyonize suda üçer dakikalık üç inkübasyonla takip edin.

Kuru ölçüm yapılacaksa, çipi argon gazı ile iyice kurulayın. Çipleri, pH değeri 7,4'e ayarlanmış 50 millimolar etanol amin çözeltisine daldırarak sarsıcılı plaka üzerinde 30 dakika boyunca bekletip kopolimer yüzeyindeki kalan NHS gruplarını etkisiz hale getirin. İnkubasyon prosedürüne başlamadan önce etanol amini PBS ve ardından deiyonize su kullanarak iyice durulayın.

Bu gösterim için uygun konsantrasyonda hedef protein PBS çözeltisini hazırlayın. Mililitre başına 500 nanogram anti-human serum albumin kullanılmıştır; negatif kontrol inkübasyonu için hedef protein içermeyen eşit hacimde tampon çözelti ekleyin. İris sistemi; bir aydınlatma kaynağı, sensör prob dizisini uygun şekilde aydınlatmak için optik bileşenler, yansıtılan ışık yoğunluklarını kaydetmek için bir kamera ve ölçümler için numunenin yerleştirildiği bir sahne gibi birkaç temel unsurdan oluşur.

Tarama işlemini gerçekleştirmeden önce, daha sonra toplanacak tüm verileri normalize etmek için çıplak ve temiz bir silikon çipin silikon ayna taramasıyla başlayın. Deney için parametreleri ayarlayarak iris sistemini hazırlayın. Bu işlem, kameranın kaydettiği ışık yoğunluklarının histogramının ölçülmesini ve optimal yoğunluklar için pozlama süresinin ayarlanmasını içerir.

Normalizasyon taramasının ardından, hazırlanan prob dizisini iris sistemine yükleyin ve kurulumu daha önce yaptığınız gibi gerçekleştirerek odağı, substrat yüzeyini doğru şekilde görüntüleyecek şekilde ayarlayın. Yansıtılan ışık yoğunlukları için kaydedilen histogramları inceleyerek numune tablasının düz olduğundan emin olun. Son olarak, verileri kaydetmek için bir dosya adı seçin.

Diziyi taramak için yazılımı başlatın; bu işlem, yüzeyi farklı dalga boylarında defalarca aydınlatır ve toplanan görüntülerin ortalamasını alır. Başlangıçtaki optik yükseklik referans noktası belirlenerek, ilk taramanın ardından gerçekleşen inkübasyon sonrası yüzeydeki kütle değişimlerinin uygun şekilde analiz edilmesi sağlanır; ardından çipi, hazırlanan inkübasyon çözeltisi içinde bir saat boyunca bir çalkalama tablası üzerinde bekletin. İnkübasyon süresi, vejetasyon seviyesine, tespit edilen hedefin konsantrasyonuna ve hedef-prob çiftinin afinitelerine bağlı olarak önemli ölçüde değişiklik gösterebilir.

İnkübasyonun ardından, yıkama prosedürünü daha önce gerçekleştirildiği şekilde tekrarlayın. İnkübasyon öncesi karşılaştırma için inkübasyon sonrası görüntüleri elde etmek amacıyla, aynı pro dizisini iris sistemini kullanarak tarayın. Gerektiğinde bu işlem, farklı inkübasyon basamakları için tekrarlanabilir.

Örneğin, ikincil bir antikorun kullanıldığı bir sandviç assay formatında, optik kalınlık oluşumunu içeren probun bir görüntüsünü üretmek için ticari olarak geliştirilmiş yazılımlar kullanarak her bir iris taraması için toplanan görüntüleri sığdırın. Bağlanmanın hızlı bir kalitatif analizi, inkübasyon sonrası ve öncesi görüntüler birbirinden çıkarılarak gerçekleştirilebilir. Bağlanma, kütle değişimlerinin gözlemlendiği noktalarda yoğunluk değişimi olarak görünecektir.

Kantitatif analiz için, her bir spot içindeki piksellerin ve spotun dışındaki bir halkadaki piksellerin optik kalınlık bilgilerinin ortalamasını alarak, her bir spotun arka plana kıyasla kütle yoğunluklarını belirleyin. Ardından, burada gösterilen bu iki alanın doğrudan karşılaştırmasını yapın. Örnek olarak, temsili bir antikor dizisi ile damgalanmış, katmanlı silikon ve silikon dioksit iris substratının şeması verilmiştir.

Her bir antikor topluluğu, farklı bir proteine hedef alan ve farklı bir epitop için özgünlük gösteren tekrarlar halinde damlatılmıştır. Örnek olarak iki farklı bütün virüs ve bir viral protein sunulmuştur. Hedefler. Negatif kontrol antikorları analize bağlıdır ve spesifik olmayabilir ve/veya virüse özgü olabilir.

Burada, burada görüldüğü üzere, insan serum albüminine özgü antikorların, HSA ve tavşan IgG kontrol noktalarından oluşan bir diziye bağlanmasına ilişkin kalitatif sonuçlara bir örnek verilmiştir. İnkübasyon öncesi ve sonrası görüntüler için optik kalınlık belirlenip uydurulduktan sonra, bağlanmayı hızla değerlendirmek amacıyla bağlanma dizisi için bir fark görüntüsü oluşturulabilir. Daha kantitatif bir analiz ise, 500 nanogram/mL'lik bir anti-HSA inkübasyon konsantrasyonu için HSA ve tavşan IgG noktalarında sırasıyla 2,05 ve 0,13 nanometre ortalama optik yükseklik değişimi gözlemlendiğini ortaya koymaktadır.

Bu sütun grafiği, iris ölçümlerinin sağlayabileceği kantitatif verilere dair bir örneği temsil etmektedir. Bu örnekte, protein bağlama bağımlılığının protein konsantrasyonuna ve çift sarmallı tüm ligaman uzunluğuna göre değişimi sunulmuştur. Bu sütun grafiği, başlangıçtaki immobilize edilmiş tüm ligaman prop yükseklikleri ve bağlama için inkübasyon sonrası mutlak optik yükseklik ölçümlerini göstermektedir.

Fur protein konsantrasyonlarının 5, 100 ve 200 nanomolar değerlerine artırılması, DNA problarına bağlanmanın artmasıyla sonuçlanmıştır. Burada, çift sarmallı DNAA ligandı başına hesaplanan fur protein dimeri bağlanması gösterilmektedir. Dimer bağlanması, 200 nanomolar fur protein konsantrasyonunda önemli ölçüde artış göstermiştir; bu durum, yüksek düzeyde spesifik olmayan tüm ligand etkileşimlerine veya birden fazla dimerin agregasyonu gibi farklı bir fur protein bağlanma mekanizmasına işaret etmektedir.

Bu prosedürü uygularken, uygun oksit kalınlığına sahip temiz ve tekdüze altlıklarla başlamayı ve numuneleri cımbızla dikkatlice tutarak temiz tutmayı hatırlamak önemlidir. Ayrıca, uygun şekilde saklanmış ve fonksiyonel olduğu bilinen reaktiflerin kullanılması kritik önem taşır. Bu videoyu izledikten sonra, silikon dioksit yüzeyinde fonksiyonel prob dizilerinin hazırlanması yoluyla biyomoleküler etkileşimlerin etiketsiz formatta nasıl ölçüleceğinin yanı sıra, interferometrik yansıma görüntüleme sensörü veya iris kullanılarak veri toplama ve analizi konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.