Name: Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Keşfedin etiketsiz biyomoleküler algılama için IRIS yöntemini; silikon dioksit yüzeylerde antikor-antijen bağlanmasını yüksek verimli optik görüntüleme ile nicelendirir. Bu teknik biyolojik araştırmalarda hassas ve maliyet etkin analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Zoiray Technologies Inc, bir co-sponsoru ve ticarileştirilmesi ortağı verdiği destekten ötürü teşekkür etmek istiyoruz.

1. Yüzey Hazırlığı <ol><li> Coat katmanlı silikon-SiO 2 substratlar kendi kendine adsorblama copoly (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Kopolimer sentezi, kimyasal yapı ve kaplama işlemi yayımlanır: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. DNA Mikroarray Cam Slaytlar Polimerik Adsorbe Kaplamanın Karakterizasyonu. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> Kısaca, polimer 100 mg 5 ml deiyonize (DI) su ekleyerek polimer çözüm hazırlamak ve nihai konsantrasyonu 0.92 M. ulaşmak için 5 ml% 40 doymuş amonyum sülfat ((NH 4) 2SO 4) çözümü eklemek </li><li> Çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca çözüm ve daha sonra Batmak cips DI suyla iyice durulayın. Argon / N 2 gaz ile iyice kurulayın. </li><li> 80 Bake cips ° C 15 dk. </li></ol></li><li> Mağaza polimer kaplı yüzeylerde 3 ay kadar kuru bir ortamda (vakum desikatöre) / cips prob prosedürü lekelenme kadar. </li></ol> 2. Antikorlar, antijenler, ss / dsDNA, RNA, vb: Probe Array hazırlanması <ol><li> Istenilen tampon uygun konsantrasyon prob (ler) seyreltilir. Bu adım önemli ölçüde değişir olabilir, ancak tipik bir deney pH ≈ 7.4 tamponlu salin (PBS), fosfat, 0.5 mg / ml konsantrasyonu (0.1 -1 mg / ml aralık) antijen veya IgG kullanır. </li><li> 96 çözümleri - 384 plaka (veya spotter kullanılan standart kaynak plaka) </li><li> Istenen basılı dizi için parametreleri tespit Kurulum: (durmak kez, yaklaşım hızları vb), kullanılan yüzey ve çözümleri için uygun lekelenme parametreleri belirlemek. Izgara, ızgara düzeni, sayısını çoğaltmak ızgaraları, ve çip üzerinde istenilen konuma lekelenme başına her durumun tekerrür sayısını belirler. Yeri yüzeyleri ve uygun yerlerde kaynak plakası, emin atık ve tedarik şişeleri hazır olmak için kontrol ve baskı vadede başlar. </li><li> Lekelenme immobilizasyonu ve devre dışı bırakma sürecinin devam etmesi için (4-18 saat) yüksek nemli ortamlarda yer substratlar gecede bittikten sonra. </li><li> Yıkama yüzeyler:% 0.1 Tween (PBST), PBS ve nihayet deiyonize (DI) su ile PBS üç ayrı yıkama için üç dakika için aşağıdaki çözümleri yer onları. Deney türüne göre (ıslak vs kuru), Argon gazı ile çip iyice kurulayın ve inkübasyon başlamak veya bir akış odasında çip yerleştirmek ve montajını. </li><li> Çalkalayıcı plaka sırasında 30 dakika boyunca 7.4 'e, düzeltilmiş pH ile etanolamin 50 mM çözüm cips daldırarak kopolimer yüzey üzerinde kalan NHS gruplar devre dışı bırakın. Hidroksilamin veya Tris gibi bir birincil amin içeren bileşik aynı zamanda uzun zamandır hazırlanan bir çözüm proteinleri ile kullanmak için güvenli olarak kullanılabilir. PBS sonra DI su kullanarak devre dışı bırakma çözüm iyice durulayın. </li><li> İsteğe adım (istihdam edilen yüzey kimyası bağlı olarak): BSA, kazein, çözüm ya da 30 dakika boyunca rehidrate süt kullanarak Blok yüzey. Polimer omurgası, non-spesifik protein bağlama önlemek için eylemi olarak bizim kullandığımız mevcut polimerik yüzey kimyası için, bu adımı gerçekleştirmeniz yok. </li></ol> 3. Veri Toplama ve Kuluçka Prosedür: Endpoint formatı <ol><li> İstenen tampon ilgi hedef bir çözüm olun. Burada, uygun konsantrasyonu PBS içinde Anti-BSA (eski), 10 ng / ml PBS içinde Anti-BSA çözüm 1-10 ml yapmak bir çözüm olacaktır. Ayrıca, negatif kontrol inkübasyon için tampon (hedef) eşdeğer bir miktarda olduğundan emin olun. </li><li> Daha sonra toplanan tüm veriler normalleştirilmesi için silikon ayna tarama atın. </li><li> Her bir noktada, ilk optik yüksekliği (kütle) belirlemek için önce inkübasyon adım IRIS sistemi ile hazırlanan prob dizi tarayın. Bu yüzey üzerine kitle değişiklikleri doğru analiz için izin verecek, inkübasyondan sonra, bağlama yani. Burada, birkaç parametre mevcut maruz kalma süresi gibi deney, görüş alanı, prospering odaklama, vb çekilecektir </li><li> Çalkalayıcı plaka üzerinde 1 saat için hazırlanan çözüm Batmak çip (ler). Inkübasyon süresi önemli ölçüde ajitasyon düzeyine bağlı olarak değişebilir, konsantrasyonu hedef tespit, akış odasının taşıma özellikleri (gerçek zamanlı algılama modu kullanılıyor ise), hedef prob çifti akrabalıklar, vb. . </li><li> Inkübasyondan sonra) adım 2.5 'te açıklanan yıkama prosedürü tekrarlayın </li><li> IRIS sistemi kullanarak aynı prob dizi Tarama ve ön-inkübasyon karşılaştırma sonrası inkübasyon görüntüler elde. </li><li> Ikincil bir antikor kullanılan bir sandviç analiz formatında örneğin, gerekirse farklı inkübasyon adımlar için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Pro laboratuvarı tarafından geliştirilen bu yazılım kullanarak, her IRIS tarama (yoğunluğu görüntüler dizisi) için toplanan görüntüler Fitprob dizi optik kalınlığı bilgileri içeren bir görüntü Duce. (Kayıtlı) post ve pre-inkübasyon görüntüler çıkarılarak bağlama hızlı bir nitel analiz yapılabilir. Bağlama toplu değişiklikler gözlenmiştir bu noktalarda yoğunluk bir değişiklik olarak görünecektir. Kantitatif analiz için, her bir nokta, nokta nokta ve anulus dış içinde ortalama her piksel için optik kalınlığı bilgileri ve bu iki alan doğrudan bir karşılaştırma yapmak arka plana göre kitle yoğunlukları belirler. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1, temsil eden bir antikor dizi ile tespit katmanlı Si-SiO 2 IRIS substrat bir örnek şematik gösterir . Her antikor topluluğu farklı proteinler hedefleyen farklı bir epitop için özgüllük ile çoğaltmak fark edilir. İki farklı tüm virüsler ve viral bir proteinin, örneğin hedef olarak temsil edilmektedir. Negatif kontrol antikorları tahlil bağlıdır ve non-spesifik ve / veya virüs olabilir. Şekil 2 (HSA) insan serum albumini bağlama gösterir bir dizi benekli HSA ve tavşan IgG (kontrol) lekeler için özel antikorlar. Burada görüldüğü gibi, inkübasyon öncesi ve sonrası görüntüler için optik montaj ve kararlılıkla sonra kalınlıkları, bağlayıcı bir dizi için bir fark görüntü niteliksel bağlayıcı değerlendirmek için oluşturulabilir. Kantitatif analiz, 2.05 ve 0.13 nanometre optik yüksekliğini değiştirmek, bir anti-HSA inkübasyon konsantrasyonu 500 ng / ml, sırasıyla, HSA ve tavşan IgG noktalar gözlendi demek ortaya koymaktadır. Şekil 3, protein konsantrasyonu ve dsDNA oligomer uzunluğu Kürk protein bağlayıcı bağımlılığı bir IRIS ölçümü gösterir. Üst grafik ilk immobilize oligomer prob yükseklikleri ve post-inkübasyon Kürk bağlanma için mutlak optik boy ölçümleri gösterir. Kürk artan konsantrasyonlarda (50, 100, 200 nM) DNA probları artan bağlayıcı sonuçlandı. Oligomerlerinin uzunluğu da daha bağlayıcı uzun dizileri ile Kürk bağlanma etkiler. Burada, hata çubukları, ortalama bir standart sapmasını temsil eder. Alt arsa dsDNA iplikçik başına bağlayıcı hesaplanan Kürk protein dimer gösterir. Dimer bağlama, non-spesifik bağlayıcı bir üst düzey düşündüren 200 nM Kürk protein konsantrasyonu önemli ölçüde artış oldu. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, normalde çoğullanır moda IRIS sistemi ile belirli virüs ve virüs bileşenleri tespit etmek için bir deney kullanılan bir örnek prob dizi şematik . <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 benekli HSA insan serum albumini-spesifik antikorların bağlanması için Post-inkübasyon fark görüntü 500 ng / ml konsantrasyonda bu etiket sistemi ile toplanır. Biyomateryal kitle yoğunluğu her nokta için bir nokta içinde ortalama optik kalınlığı bilgileri ve daha sonra bu arka plan temsil eden nokta civarında bir annulus ortalama ile karşılaştırarak belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 oligomer uzunluğu, oligomer içinde fikir birliği dizisi yeri ve Kürk protein konsantrasyonu bilinen bir uzlaşı sırası ile benekli çift iplikli oligomerler Kürk protein etkileşimleri için veri bağlama Arsa. Mutlak her benekli dizisi (üst) bağlı Kürk protein miktarı hakkında bilgi oligomer (alt) her türüne bağlı Kürk dimerleri sayısını tahmin etmek için kullanılabilir.

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

IRIS platformu mikroarray formatında yüksek verim bağlama veri toplamak için kullanmak için basit ve hızlı bir sistem. Kovalent bir yüzey üzerine farklı fonksiyonel bir protein ya da DNA probları hareketsizleştirir, hedef antijenleri / biyobelirteçleri / etc. immunoassay olduğu gibi, çözüm yakalanabilir. IRIS sistemi ile bir bitiş noktası ya da gerçek zamanlı biçimde prob koşullarında bu etkileşimlerin ölçümü, her etkileşim için tahsil edilecek son derece hassas ve kantitatif bilgi sağlar. Burada ayrıntılı temsilcisi deney, türleri, bu teknik ile incelenebilir etkileşimleri örneklerden sadece biridir. Transkripsiyon faktörleri, viral antijenleri, ve tüm virüsler Algılama, daha önce gösterilmiş ve IRIS kolayca işleyebilir analizler türleri sadece birkaç örnek temsil etmektedir.

<ol><li> 500 nm termal yetiştirilen silikon dioksit, Silikon Vadisi Mikroelektronik, özel sipariş ile Silikon gofret <li> Amonyum sülfat tozu, Sigma-Aldrich kedi. # A5132 <li> Fosfat tamponlu salin (PBS) 10X hazır konsantresi, Fisher Scientific kedi. # BP665-1 <li> Insan serum albumini (Anti-HSA) Antikor, Sigma-Aldrich kedi. # A0433 <li> İnsan serum albumini (HSA), Sigma-Aldrich kedi. # A9511 <li> Argon veya azot gazı (ultra-yüksek saflıktaki), Airgas kedi. # AR UHP300 veya # NI UHP300 <li> Petri kapları, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific kedi. # 0875713A <li> Scienceware ® vakum desikatörde, Sigma-Aldrich kedi. # Z119016 <li> Mikrosantrifüj tüpler, Fisher Scientific kedi. # 05-408-120 <li> 96-kuyucuğu, düşük hücre bağlama, Nalgene Nunc Uluslararası kedi. # 145.399 <li> BioOdyssey Hattat MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Etanolamin, Sigma-Aldrich # 398.136 <li> Hidroksilamin, Thermo Scientific kedi. # 26.103 <li> Çok amaçlı rotator, Thermo Scientific (Barnstead Uluslararası), model # 2314, kedi. # 2314Q <li> Retiga 2000R kamera, QImaging kedi. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> AcuLED ışık kaynağı, Perkin Elmer, özel sipariş <li> Optik bileşenleri (lensler, hedefleri, diyafram, raylar, mesaj, vb), Thorlabs </ol>

biyomoleküler algılama istihdam İnterferometrik yansıtma görüntüleme sensörü (iris)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biyomoleküler etkileşimlerin hassas ölçüm temel biyoloji ve mikrobiyoloji, çevre / tarım / biodefense izleme, nanobioteknoloji, ve daha fazlası gibi birçok alanda ve sanayi kullanımı vardır. Teşhis uygulamaları, izleme (tespit), varlığı, yokluğu, veya hasta numunelerinin bulunan hedef proteomik veya genomik biyobelirteçleri anormal ifade tedavi yaklaşımları ya da tedavi etkinliğini belirlemek için kullanılan olabilir. Araştırma arenası, moleküler yakınlık ve özelliklerle ilgili bilgi sistemleri tam olarak soruşturma altında tanımlamak için yararlıdır. Moleküler konsantrasyonları ya da yakınlık belirlemek için kullanılan mevcut sistemlerinin çoğu etiket kullanımı güveniyor. Bu sistemlerin örnekleri enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA), polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri, jel elektroforezi deneyleri ve kütle spektrometresi (MS) gibi immunoassay içerir. Genellikle, bu etiketler, floresan radyolojik, ya da doğada kolorimetrik ve doğrudan ya da dolaylı olarak ilgi moleküler hedef bağlıdırlar. Etiket kullanımı yaygın olarak kabul görmüş ve bazı faydaları da vardır olmasına rağmen, bu etkileşimlerin ölçmek için yeni bir etiket içermeyen yöntemler geliştirilmesi teşvik sakıncaları vardır. Bu sakıncaları tahlil maliyet artış, reaktif ömrü ve kullanılabilirlik, depolama ve güvenlik kaygıları gibi pratik yönleriyle, etiketleme harcanan zaman ve çaba, ve etiketleme işlemleri veya etiket kendilerini nedeniyle farklı reaktifler arasında değişkenlik içerir. Bir bilimsel araştırma temelinde, bu etiket kullanımı da, protein işlevselliği / yapıştırılan etiketlere ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak doğrudan ölçmek için yetersizlik varlığı nedeniyle yapısı üzerindeki etkileri ile endişeler gibi zorluklar tanıtabilirsiniz. Burada sunulan çalışmalar mikroarray mükellef yeni bir etiket ücretsiz bir optik biyosensör kullanımı, İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensör tespit proteinler, DNA, antijenik malzeme, tüm patojenler (virionlar) ve diğer biyolojik materyalin (IRIS) olarak adlandırılır. IRIS sistemi farklı biyomoleküler etkileşimleri [1-3] için yüksek duyarlılık, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik kanıtlanmıştır. Faydaları multipleks görüntüleme kapasitesi, gerçek zamanlı ve uç nokta ölçüm yetenekleri ve düşük reaktif tüketimi ve tahlil kez bir azalma gibi diğer yüksek verimlilik özellikleri içerir. Ayrıca, IRIS platformu, kullanımı kolay, ucuz ekipman gerektirir ve birçok çağdaş yüzey kimyası yaklaşımları ile uyumlu hale silikon tabanlı katı faz tayini bileşenleri kullanır. Burada, kuluçka ve bir bitiş noktası formatında sonuçlarının analizi için bağlayıcı hedef ölçüm probu dizilerin hazırlanması IRIS sisteminin kullanımı sunuyoruz. Model sistem Kalkış Desteği (HSA) HSA-benekli yüzeylerde insan serum albumini için spesifik hedef antikor yakalamak olacaktır.

SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein, vb.)<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyler LED aydınlatma dayanan basit bir interferometrik tekniği, minimal optik bileşenleri ve bir kamera kullanılarak elde edilebilir. İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS) formatlarını mikroarray ucuz, kullanımı kolay, ve uysal.

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Biyomoleküler etkileşimlerin hassas ölçümü; temel biyoloji ve mikrobiyoloji gibi birçok alan ve endüstride kullanım alanı bulmaktadır, ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Iris olarak adlandırılan hassas ve etiketsiz bir algılama platformu ile antikorların yüzeye immobilize edilmiş antijenlere bağlanmasını nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle çözeltiden hedeflenen proteinleri yakalamak için kimyasal olarak fonksiyonelleştirilmiş tekdüze bir silikon dioksit yüzey üzerinde bir dizi test ve kontrol probu hazırlanarak gerçekleştirilir. İmmobilize edilen problar; antikorlar veya antijenler, DNA veya RNA ya da fonksiyonelleştirilmiş, polimerik veya benzer yüzey kimyalarıyla uyumlu herhangi bir başka makromolekül türü olabilir.Hazırlanan mikro dizi, ardından araştırmacı tarafından belirtilen koşullar altında bağlanmanın gerçekleşmesini sağlamak için ilgi duyulan proteinleri içeren bir örnekle inkübe edilir. Daha sonra, tüm sensör dizisinin farklı ışık dalga boylarında görüntülemesi yapılır. IRIS sistemi ile her bir piksel için yansıtılan yoğunluklar, özel kodlanmış algoritmalarla işlenir.Her bir test veya kontrol koşuluna bağlanan biyomalzeme miktarını nicelendirmek amacıyla, bu sistemin interferometrik etiketsiz ölçümlerine dayanarak kompleks bir karışım içindeki antikorların etkili tespitini ve mutlak nicelendirmesini gösteren inkübasyon sonrası sonuçlar elde edilir. Optik girişim ve reçine boşluklu cihazlar üzerine on yılı aşkın araştırma ve geliştirme çalışmalarından yararlanarak, önceki etiketsiz biyosensör sistemlerimizde karşılaştığımız birçok karmaşık sorunu aşabilecek bu yeni yöntemi geliştiriyoruz. Veri toplama basamaklarının doğru normalizasyon gerektirmesi ve kalite kontrol prosedürlerinin takip edilmesi nedeniyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Bu, doğru ve tekrarlanabilir veri alımını sağlamak içindir.Silisyum dioksit altlıklarını kendi kendine emen copo dmma NAS haritalarıyla kaplamak için, 5 mililitre deiyonize suya 100 miligram polimer ekleyerek polimer çözeltisini hazırlayın. Ardından, nihai amonyum sülfat konsantrasyonu 0,92 molar olacak şekilde 5 mililitre %40 doygun amonyum sülfat ekleyin. İnkübasyonun ardından, çipleri bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca polimer çözeltisine daldırın.Çipleri deiyonize su ile iyice durulayın, argon veya azot gazı ile kurulayın ve ardından 80 °C'de 15 dakika boyunca pişirin. Polimer kaplı substrat çiplerini, her bir probu seyreltecek prob noktalama prosedürüne kadar iki ila üç ay boyunca vakum desikatörü gibi kuru bir ortamda saklayın. İlk olarak, istenen nihai konsantrasyona ulaşmak için gereken prob stok çözeltisi ve tampon çözelti hacimlerini belirleyin.Tipik bir deneyde, hesaplanan miktardaki her bir prob stok çözeltisi, istenen miktarda PBS tamponu içeren küçük eppendorf tüplerine eklenerek, fosfat tamponlu salinde 0,5 mg/mL konsantrasyonda antijen veya IgG kullanılır ve çözeltiler karıştırılır. Ardından, spotter için kaynak plaka olarak kullanılacak olan 96 kuyucuklu düşük protein bağlamalı bir plakaya prob çözeltileri pipetlenir. Sonrasında, ızgara başına her bir koşulun tekrar sayısı belirlenerek basılı dizi için spotting parametreleri ayarlanır.Izgara düzeni, replika ızgara sayısını ve çip üzerindeki istenen damlatma konumunu belirler. Substratı ve kaynak plakayı damlatıcıya yerleştirin, ardından atık ve besleme şişelerini kontrol edin. Baskı işlemini başlatın.Benekleme işlemi tamamlandıktan sonra, inkübasyonu takiben immobilizasyon ve deaktivasyon sürecinin ilerlemesi için substratı gece boyunca yüksek nemli bir ortama yerleştirin. Substratları, önce çipi 0,1%tween içeren PBS içinde üç dakika boyunca, üç ayrı kez yerleştirerek ajitasyonla yıkayın. Bunu, PBS içinde ve ardından deiyonize suda üçer dakikalık üç inkübasyonla takip edin.Kuru ölçüm yapılacaksa, çipi argon gazı ile iyice kurulayın. Çipleri, pH değeri 7,4'e ayarlanmış 50 millimolar etanol amin çözeltisine daldırarak sarsıcılı plaka üzerinde 30 dakika boyunca bekletip kopolimer yüzeyindeki kalan NHS gruplarını etkisiz hale getirin. İnkubasyon prosedürüne başlamadan önce etanol amini PBS ve ardından deiyonize su kullanarak iyice durulayın.Bu gösterim için uygun konsantrasyonda hedef protein PBS çözeltisini hazırlayın. Mililitre başına 500 nanogram anti-human serum albumin kullanılmıştır; negatif kontrol inkübasyonu için hedef protein içermeyen eşit hacimde tampon çözelti ekleyin. İris sistemi; bir aydınlatma kaynağı, sensör prob dizisini uygun şekilde aydınlatmak için optik bileşenler, yansıtılan ışık yoğunluklarını kaydetmek için bir kamera ve ölçümler için numunenin yerleştirildiği bir sahne gibi birkaç temel unsurdan oluşur.Tarama işlemini gerçekleştirmeden önce, daha sonra toplanacak tüm verileri normalize etmek için çıplak ve temiz bir silikon çipin silikon ayna taramasıyla başlayın. Deney için parametreleri ayarlayarak iris sistemini hazırlayın. Bu işlem, kameranın kaydettiği ışık yoğunluklarının histogramının ölçülmesini ve optimal yoğunluklar için pozlama süresinin ayarlanmasını içerir.Normalizasyon taramasının ardından, hazırlanan prob dizisini iris sistemine yükleyin ve kurulumu daha önce yaptığınız gibi gerçekleştirerek odağı, substrat yüzeyini doğru şekilde görüntüleyecek şekilde ayarlayın. Yansıtılan ışık yoğunlukları için kaydedilen histogramları inceleyerek numune tablasının düz olduğundan emin olun. Son olarak, verileri kaydetmek için bir dosya adı seçin.Diziyi taramak için yazılımı başlatın; bu işlem, yüzeyi farklı dalga boylarında defalarca aydınlatır ve toplanan görüntülerin ortalamasını alır. Başlangıçtaki optik yükseklik referans noktası belirlenerek, ilk taramanın ardından gerçekleşen inkübasyon sonrası yüzeydeki kütle değişimlerinin uygun şekilde analiz edilmesi sağlanır; ardından çipi, hazırlanan inkübasyon çözeltisi içinde bir saat boyunca bir çalkalama tablası üzerinde bekletin. İnkübasyon süresi, vejetasyon seviyesine, tespit edilen hedefin konsantrasyonuna ve hedef-prob çiftinin afinitelerine bağlı olarak önemli ölçüde değişiklik gösterebilir.İnkübasyonun ardından, yıkama prosedürünü daha önce gerçekleştirildiği şekilde tekrarlayın. İnkübasyon öncesi karşılaştırma için inkübasyon sonrası görüntüleri elde etmek amacıyla, aynı pro dizisini iris sistemini kullanarak tarayın. Gerektiğinde bu işlem, farklı inkübasyon basamakları için tekrarlanabilir.Örneğin, ikincil bir antikorun kullanıldığı bir sandviç assay formatında, optik kalınlık oluşumunu içeren probun bir görüntüsünü üretmek için ticari olarak geliştirilmiş yazılımlar kullanarak her bir iris taraması için toplanan görüntüleri sığdırın. Bağlanmanın hızlı bir kalitatif analizi, inkübasyon sonrası ve öncesi görüntüler birbirinden çıkarılarak gerçekleştirilebilir. Bağlanma, kütle değişimlerinin gözlemlendiği noktalarda yoğunluk değişimi olarak görünecektir.Kantitatif analiz için, her bir spot içindeki piksellerin ve spotun dışındaki bir halkadaki piksellerin optik kalınlık bilgilerinin ortalamasını alarak, her bir spotun arka plana kıyasla kütle yoğunluklarını belirleyin. Ardından, burada gösterilen bu iki alanın doğrudan karşılaştırmasını yapın. Örnek olarak, temsili bir antikor dizisi ile damgalanmış, katmanlı silikon ve silikon dioksit iris substratının şeması verilmiştir.Her bir antikor topluluğu, farklı bir proteine hedef alan ve farklı bir epitop için özgünlük gösteren tekrarlar halinde damlatılmıştır. Örnek olarak iki farklı bütün virüs ve bir viral protein sunulmuştur. Hedefler. Negatif kontrol antikorları analize bağlıdır ve spesifik olmayabilir ve/veya virüse özgü olabilir.Burada, burada görüldüğü üzere, insan serum albüminine özgü antikorların, HSA ve tavşan IgG kontrol noktalarından oluşan bir diziye bağlanmasına ilişkin kalitatif sonuçlara bir örnek verilmiştir. İnkübasyon öncesi ve sonrası görüntüler için optik kalınlık belirlenip uydurulduktan sonra, bağlanmayı hızla değerlendirmek amacıyla bağlanma dizisi için bir fark görüntüsü oluşturulabilir. Daha kantitatif bir analiz ise, 500 nanogram/mL'lik bir anti-HSA inkübasyon konsantrasyonu için HSA ve tavşan IgG noktalarında sırasıyla 2,05 ve 0,13 nanometre ortalama optik yükseklik değişimi gözlemlendiğini ortaya koymaktadır.Bu sütun grafiği, iris ölçümlerinin sağlayabileceği kantitatif verilere dair bir örneği temsil etmektedir. Bu örnekte, protein bağlama bağımlılığının protein konsantrasyonuna ve çift sarmallı tüm ligaman uzunluğuna göre değişimi sunulmuştur. Bu sütun grafiği, başlangıçtaki immobilize edilmiş tüm ligaman prop yükseklikleri ve bağlama için inkübasyon sonrası mutlak optik yükseklik ölçümlerini göstermektedir.Fur protein konsantrasyonlarının 5, 100 ve 200 nanomolar değerlerine artırılması, DNA problarına bağlanmanın artmasıyla sonuçlanmıştır. Burada, çift sarmallı DNAA ligandı başına hesaplanan fur protein dimeri bağlanması gösterilmektedir. Dimer bağlanması, 200 nanomolar fur protein konsantrasyonunda önemli ölçüde artış göstermiştir; bu durum, yüksek düzeyde spesifik olmayan tüm ligand etkileşimlerine veya birden fazla dimerin agregasyonu gibi farklı bir fur protein bağlanma mekanizmasına işaret etmektedir.Bu prosedürü uygularken, uygun oksit kalınlığına sahip temiz ve tekdüze altlıklarla başlamayı ve numuneleri cımbızla dikkatlice tutarak temiz tutmayı hatırlamak önemlidir. Ayrıca, uygun şekilde saklanmış ve fonksiyonel olduğu bilinen reaktiflerin kullanılması kritik önem taşır. Bu videoyu izledikten sonra, silikon dioksit yüzeyinde fonksiyonel prob dizilerinin hazırlanması yoluyla biyomoleküler etkileşimlerin etiketsiz formatta nasıl ölçüleceğinin yanı sıra, interferometrik yansıma görüntüleme sensörü veya iris kullanılarak veri toplama ve analizi konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Bu videoda, ligandlar ve hedef analitler arasındaki moleküller arası etkileşimleri gerçek zamanlı olarak tespit etmek için biyokatman interferometrisi (BLI) teknolojisini gösteriyoruz. BLI, çözelti içindeki analitlerle etkileşime girerken bir biyosensör yüzeyi üzerindeki hareketsizleştirilmiş ligandlardan oluşan bir tabakadan yansıyan beyaz ışığın girişim modelindeki değişiklikleri ölçer.

Ligand ve Analit Arasındaki Etkileşimleri Tespit Etmek için Biyokatman İnterferometri Teknolojisi

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Keşfedin etiketsiz biyomoleküler algılama için IRIS yöntemini; silikon dioksit yüzeylerde antikor-antijen bağlanmasını yüksek verimli optik görüntüleme ile nicelendirir. Bu teknik biyolojik araştırmalarda hassas ve maliyet etkin analiz sağlar.

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Daha fazla video keşfet