MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Bu prosedürün genel amacı, hem hayvanda hem de izole edilmiş hücrelerde membran onarım kapasitesini değerlendirmektir. İzole edilen iskelet kası lifleri toplanır ve FM 1 43 boyası içeren besiyerleri ile çevrelenir. Daha sonra, boyanın hücreye girmesine izin vermek için hücre zarının bir kısmını ışınlamak ve zarar vermek için bir UV lazer kullanılır.

İzole edilmiş hücreler, hücrenin plazma zarına ve sitozolüne lokalize olacak olan GFP MG 53'ü eksprese eden plazma DNA'sı ile transfekte edilir. Bir mikro elektrotun ucu daha sonra hasara neden olmak için C iki C 12 zarına yerleştirilir. Sonuç olarak, GFP MG 53'ün yaralanma bölgesine translokasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, mikro elektrot penetrasyonu ve kas lifi izolasyonu tekniklerine hakim olmak için gerekli uygulamalar nedeniyle kritik öneme sahiptir. Prosedürü gösteren, laboratuvar yöneticimiz Dr.Lin, doktora sonrası araştırmacı Dr.Wazu, yüksek lisans öğrencisi Matt Orange ve bölümümüzde araştırma görevlisi doçent olan Dr.Shaza olacaktır. Başlamak için, deney sırasında hayvanlardan atık toplamak için koşu bandının altına bir tepsi veya mavi bir laboratuvar pedi yerleştirin.

Ardından, koşu bandı yüzeyinin açısını ayarlayın. Bazı koşu bantlarında eğimi ayarlamak için entegre bir aparat bulunurken, diğerleri koşu bandının başka yollarla yükseltilmesini gerektirir. Genellikle düz bir yüzey veya yokuş aşağı veya yokuş yukarı yedi ila 15 derece arasında bir açı kullanılır.

Fareleri, elektrik şebekesi kapalı ve kayış tahrik motoru açıkken koşu bandına yerleştirerek, ancak alışma süresinden sonra 15 dakika boyunca hareket etmeyerek alıştırın, motivasyonel elektrik şebekesini açın. Koşu bandını dakikada yaklaşık beş metrelik bir başlangıç hızıyla başlatın. Her dakika dakikada bir ila iki metre artan hızlarla, hayvana beş dakikalık bir ısınma süresi tanıyın.

Test sırasında uyumluluğu artırmak için bu ısınma süresini üç ila 10 gün boyunca her gün tekrarlayın. Akut yorgunluk egzersizi yapmak. Maksimum hıza ulaşılana kadar koşu bandının hızını zamanla artırın ve yorgunluk belirtilerini izleyin.

Bir hayvan, koşu bandındaki zamanın yarısından fazlasını veya ızgarada art arda beş saniye geçirdiğinde bitkin olarak kabul edilir. Yorgun fareyi çıkarın ve toplam çalışma süresini kaydedin. Dayanıklılık eğitimi.

Çalışan protokoller aynı ısınma prosedürüyle başlar. Bununla birlikte, maksimum hız genellikle daha düşüktür ve çalışma süreleri oldukça uzun olabilir. Fareleri testten sonra ev kafeslerine geri koyun ve koşu bandını %70 etanol ile temizleyin.

Daha fazla analiz için fleksör digitorum brevis kasının yüzeysel tabakasını ayaktan izole edin. İlk olarak, tabanın derisini orta çizgiden kesin ve altındaki kasa zarar vermemeye dikkat edin. Ardından yatay kesimler yapın ve cildi çıkarın.

Kalkaneus kemiğine bağlı FDB kasının düz beyaz tendonunu tanımlayın. Bağlanma bölgesine yakın tendonu ayırmak ve ardından kesmek için forseps kullanın. Herhangi bir bağ dokusunu keserken tendonu yavaşça yukarı çekin.

Distal tendonların tek tek basamaklara dallandığı yeri bulun. Tendonları daha derin kas tabakasına bağlandıkları yerden kesin ve FDB'yi çıkarın. FDB kas demetini bir mililitre kollajenaz çözeltisine yerleştirin, 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.

Tüpü yatay olarak 37 santigrat derece orbital çalkalayıcıya bantlayın ve 200 dakika boyunca 65 RPM'de sallayın. Yeterli sindirim, korkulu görünüm ve soluk renk ile işaretlenir. Sindirilmiş demetin geçmesine izin vermek için bir mililitrelik pipet ucunun ucunu kesin.

Demeti yaklaşık 600 mikrolitre 2.5 içeren bir santrifüj tüpüne kolayca aktarın. Kalsiyum tiro. Demetteki gevşek lifleri sallamak için tüpü yavaşça çevirin.

Ardından, 30 mikrolitrelik bir pipet ucunun ucunu, çap kas demetinden sadece biraz daha küçük olacak şekilde kesin. Demeti pipetin içine çekmek için bu ucu kullanın ve ardından tekrar çözeltiye itin. Liflerin çoğu demetten ayrılana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Tüpü hafifçe çevirerek ayrılan lifleri karıştırın. İstenilen miktarı çıkarın ve cam tabanlı bir delta T tabağa bırakın. Kalan lifleri kullanım ve ek çalışmalar için yaklaşık altı saat boyunca dört santigrat derecede saklayın.

Yemeğin beş dakika boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin. Bu, liflerin tabağın cam tabanına yapışmasını sağlar. Cam alt çanağı UV lazerle donatılmış konfokal bir mikroskoba yerleştirin.

Normal bir çizgilenme deseninin ve düz çubuk benzeri bir şeklin varlığını kontrol etmek için faz mikroskobu altında lifleri 100 x büyütmeden daha yüksek bir oranda gözlemleyin. FM 1 43 veya FM 4 64 stiro perine kalıplarını 2.5 mikromolar nihai konsantrasyona kadar çözeltiye ekleyin. Hasara neden olmak için fiberi görüş alanının sol üst köşesinden sağ alt köşeye doğru 45 derecelik bir açıyla yönlendirin.

Plazma zarının beşe beş piksellik bir alanını ışınlayın. Beş saniye boyunca maksimum güce ayarlanmış bir UV lazer kullanarak, ışınlanmış bölge, beşe beş kutunun yarısı olan plazma zarını bölmeli, geri kalanı ise elyafın dışında olmalı, her biri beş dakikaya kadar beş saniyelik aralıklarla elyafa boya girişinin görüntülerini yakalamalıdır. Floresan boya sonunda elyafın içine endositoz olacağından ve herhangi bir veri analizini karmaşıklaştıracağından, tabak başına sadece üç lif ışınlanabilir.

Üç lif kullanıldıktan sonra yeni bir yemek hazırlanmalıdır. Analiz yazılımı kullanarak, lifler arasında karşılaştırma yapmak için yaklaşık 200 mikron karelik bir alanda floresan yoğunluğundaki değişimi hesaplayın. Her kare için aşağıdaki hesaplama yapılmalıdır: delta F, F sıfıra bölünür, burada F sıfır, ilk yakalanan karedeki ilgilenilen bölgenin ortalama floresansıdır ve delta F, sonraki her karedeki floresan değişimidir.

GFP MG 53'ü eksprese eden plazmit DNA ile hücreleri transfekte etmek için standart yöntemleri kullanın. Ardından mikro pipetleri hazırlayın. Bir mikro pipet üzerine bir Pyrex kılcal damar yerleştirin.

Önceden ayarlanmış programla çekin ve çekin. Mikro pipeti üç eksenli bir mikro manipülatör kültürüne takın. Ortam, delta T kabından çıkarılır ve 2.5 milimolar kalsiyum tiro tamponu ile değiştirilir.

Transfekte edilmiş hücreleri içeren tabağı, 40 x 1.3 NA yağa daldırma objektifine sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop üzerine yerleştirin. Mikro pipeti hücre zarına yerleştirerek ve ardından mikro pipeti hücreden hızlı bir şekilde geri çekerek akut canlı hücre hasarına neden olun. Troponin kaynaklı membran bozulması için kare başına 1.54 saniyelik aralıklarla ardışık canlı hücre görüntüleri toplayın.

PERFU %0.005 troponin, görüntülenen hücrenin hemen üzerinde dakikada yaklaşık bir mililitre oranında. Koşu bandı, koşu kapasitesindeki azalmayı ölçmek için kullanılabilir. Burada görülen MG 53 nakavt fareleri, iskelet kasının hasar görmesi nedeniyle çalışma kapasitesini azaltmıştır.

UV lazerin neden olduğu hasarın boyutu, görülen elyafın membran onarım kapasitesine bağlıdır. İşte normal bir farede yaralanmadan önce bir lif. Bu görüntü 200 saniye sonra çekildi ve hafif bir yaralanmayı gösteriyor.

Membran onarım kapasitesi bozulmuş MG 53 nakavt farelerinden türetilen bir kas lifi, görülen yaralanmadan sonra daha belirgin boya girişi gösterecektir. İşte hasarsız bir GFP MG 53 transfekte edilmiş C iki C 12 myo tüpü örneği. Bu görüntüdeki ok, hasar bölgelerine doğru hareket eden veziküller içeren GFP MG 53'ü işaret ediyor.

Bu örnekte, plazma zarına zarar vermek için saponin kullanılmıştır. Yaralanmadan sonra GFP MG 53'ün sitozolden hücre zarına translokasyonuna dikkat edin. Bu prosedürü denerken, iyi kas liflerini düz saral zarları ve net çizgi desenleri ile izole etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, kasın ve kültürün, hücrelerin zar onarım kapasitesini nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.