Name: MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin MG53-aracılı hücre zarı tamiri yöntemlerini in vivo ve in vitro sistemlerde görselleştirmeyi. Bu teknikler, iskelet kası liflerinde membran onarım kapasitesini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Kas Yaralanma kapsamı Fare Modeller Revealing Koşu Koşu Bandı <ol><li> Çalışan protokol sırasında kullanmak için koşu bandı yüzey açısı oluşturulması. Genel olarak, düz bir seviye veya 7 ° ve 15 ° derece arasında bir açı yokuş aşağı veya yokuş kullanılır. Bazı koşu bandı, diğerleri koşu bandı başka yollarla yükselebilir ihtiyaç duyarken, eğim ayarlamak için entegre aparatları var. </li><li> Koşu bandı altında çalışan protokol sırasında, hayvanların herhangi bir atık toplamak için koşu bandı, hayvanların koymadan önce bir tepsi ya da mavi bir laboratuar yastık yerleştirin. </li><li> Çalışan fareler, koşu bandı çevre acclimated olmalıdır önce. Bu, elektrik şebekesi ve kayış tahrik motoru ancak kemer (yani 0 m / s hız ile) hareket etmiyor 15 dakika boyunca koşu bandı hayvanlar yerleştirerek içerir. </li><li> Motivasyon elektrikli ızgara üzerinde açın. Kullanılan bakliyat şiddeti ve sıklığı genellikle koşu bandı üzerinde kontrol ama bir üreticiden diğerine değişir. Genellikle, maksimum yoğunluğu ise yüksek frekanslı (en azından her iki saniyede bir kez) uyumu artıracak çalıştırmak için fareler motive etmek için gerekli değildir. </li><li> Çalışan protokol başlamak için koşu bandı kemer etkinleştirin. Bir ilk hızı yaklaşık 5 metre / dk, fareler için bir ısınma dönemi için kullanılmalıdır. Genellikle 1-2 metre / dk her dakika koşu bandı başlangıç ​​aşağıdaki ekleyerek, yavaş koşu bandı hızı hızlandırılabilir. </li><li> Hayvanların çoğu protokollerde Uyum deneysel çalışan başlamadan önce ısınma hızında 3 ila 10 gün boyunca bir dizi kısa çalışır (5 dakika) yaparak geliştirilebilir. </li><li> Akut bir egzersiz yorgunluk genellikle maksimum hıza kadar süre ile koşu bandı hızını artırarak içerecektir (genellikle &lt;30 m / m) farelerin tükenme belirtileri göstermeye kadar elde ve muhafaza edilir. Yorgunluk yargılamak için kriterler değişebilir ancak genellikle bir fare, koşu bandı yüzeye dönmeden, elektrikli ızgara, elektrikli ızgara veya arka arkaya 5 saniye zaman yarıdan daha fazla harcama. Bireysel bir fare bitkin sonra koşu bandı kaldırılabilir ve çalışan toplam süre kaydedilebilir. </li><li> Koşu Bandı açısını değiştirme egzersiz yükü (yokuş yukarı bir açı ile) artırmak veya kas lifleri 1 sarkolemmal zarında yırtılma zarar eksantrik kasılmalar (yokuş aşağı açı ile) ikna etmek için akut çalışan çalışmalarda kullanılabilir. Evans mavi boya, hasarlı kas liflerinin 2,3 tanımlamak için bir histolojik boya olarak kullanmak için bu işlemler öncesinde hayvanların içine enjekte edilebilir . </li><li> Dayanıklılık eğitimi çalışan protokoller zaman uzun bir süre (ay) üzerinden hayvan kas veya kardiyovasküler sistem remodeling üretmek amacıyla bir egzersiz yükü. Isınma prosedürü ancak (&gt; 1 saat) maksimum hızı genellikle düşüktür ve çalışma zamanları oldukça uzun olabilir (adım 1.5), yukarıda belirtilen aynı. </li><li> Farelerin çalışan tamamlanmasından sonra kafeslerine iade edilebilir. Koşu Bantları genellikle fareler çalışırken, özellikle uzun protokoller üzerinden, oldukça kirli. Her kullanımdan sonra, genellikle% 70 etanol sprey, koşu bandı temizlemek için gereklidir. </li></ol> UV lazer Hasar ardından 2. İzole kas liflerinin Membran Onarım Kapasitesi Ex Vivo Testi <ol><li> Fare ayak fleksör digitorum brevis (FDB) kas yüzeysel katmanı parçalara ayır. Birincisi, altındaki kas zarar vermemeye dikkat çekerken, orta hat tek açık cilt kesilir yatay kesimler ve cilt kaldırmak. FDB kas (proksimal tendon) düz beyaz tendon kalkaneus kemik bağlı olarak görülebilir. Pervasızca forseps tendon ayrı ve tendon yakın site eki sever, forseps serbest tendon kapmak ve bağlı kalır herhangi bir bağ dokuları kesim sırasında çevre dokulara FDB ayırmak için hafifçe yukarı çekin. FDB bu tendonların derin kas tabakasına bağlanmak kesim tarafından kaldırılmış olabilir bireysel basamak distal tendon şube görünce. </li><li> FDB kas demeti koyun 1 ml kollajenaz çözüm önceden ısınmış 1,5 ml Eppendorf tüp, tüp yatay yönde 37 ° C orbital çalkalayıcı bir bant içinde 37 ° C ve 200 rpm'de 65 dakika süreyle sallamak. Inkübasyon Times, yıpranmış bir görünüm ve kas soluk renk ile gösterilir yeterli sindirim, sağlamak için ayarlanması gerekir. </li><li> 1 ml pipet ile sindirilir paket kesinti olmadan kolayca geçmesine izin vermek için yeterli bir çapa sahip bir kesim ucu ile 2.5 Ca 2 + Tyrode ~ 600 ul içeren bir 1.5 ul santrifüj tüpü içine sindirilmiş FDB paket dikkatlice aktarın . Paket gevşek liflerin sallamak için tüp yavaşça çevirin. </li><li> 30 mcL pipet Kes böylece dpaket pipet yavaşça içine çekmek ve daha sonra çözüm geri itin pipet kullanın (15 arasında çapı 20 mikron) iameter kas demeti daha sadece biraz daha küçük. Liflerin çoğunluğu paket kopuk olana kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Bir cam alt delta T çanak üzerine istenilen miktarda ve bırak kopuk lifleri, tüp hafifçe çevirerek karıştırın. Yük hacmi, izolasyon ve bir tabak belirli bir protokol için gerekli olan faydalı liflerin sayısı verimlilik üzerine göre değişir. Kalan lifleri ° C ek çalışmalar için yaklaşık 6 saat, 4 tüp içinde saklanabilir. </li><li> Çanak, 5 dakika boyunca rahatsız oturmak için izin verin. Bu lifler çanak cam alt yapışmasına yol açar. </li><li> UV lazer ile donatılmış bir konfokal mikroskopi cam dipli çanak yerleştirin. &gt; 100X büyütmede faz mikroskobu altındaki lifler normal bir çizgi çizgi desen ve şekil gibi düz bir çubuk varlığını kontrol etmek için dikkat edin. </li><li> 2.5 mcM 5 final konsantrasyon çözüm FM1-43 veya FM4-64 styrylpyridinium boyalar 4 ekleyin. </li><li> Lif, 45 derecelik bir görüş alanı (Şekil 1) sağ alt sol üst açıyla odaklı fiber konumu görüntüleme penceresinde zarar neden. 5x5 piksel, 5 saniye için maksimum güç (80 mW veya daha fazla, 351 / 364 nm) UV lazer kullanılarak plazma membran bir alan (yaklaşık 0.9μmx0.9μm) ışın tedavisi. Işınlanmış bölge plazma membran bölünmüş; kalan fiber (Şekil 1) dışında olmalı, 5x5 kutusunun yarısı lif içinde olması gerekir,. </li><li> 5 dakika kadar, her biri 5 saniye aralıklarla elyaf haline boya giriş görüntüler yakalayın. </li><li> Floresan boya sonunda elyaf haline endocytosed olacak, çanak başına en fazla 3 elyaflar için adım 2.8 tekrarlayın ve herhangi bir veri analizi zorlaştıracaktır. 3 lifleri adım 2,5 'ten sonra yeni bir yemek hazır olmalıdır. </li><li> Yakalanan her kare arası boya giriş miktarını ölçmek için floresan değişimi (mesafe kadar taşınmış / F 0) hesaplarken verileri analiz ediyoruz. Bu gibi kamuya ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) olarak analiz yazılımı kullanarak 2 bir alanda yaklaşık 200 mikron ortalama floresan ölçüm gerektirir. Lifleri arasında bir karşılaştırma için, her kare için aşağıdaki hesaplama yapılabilir: F 0 ilk yakalanan çerçeve (t = 0; yaralanma önce) ilgi bölgenin ortalama floresan mesafe kadar taşınmış / F 0, ve mesafe kadar taşınmış sonraki her çerçeve floresan değişimi (FF 0). </li></ol> 3. Hücre Zarı Onarım Dinamik Process Monitor Hücre Konfokal Görüntüleme Canlı <ol><li> Mikropipetler PYREX kılcal yapılmıştır. Kapiller mikropipet çektirmesi üzerine yerleştirilen ve önceden belirlenmiş bir program (Heat = 695 = 50 çekin; Vel .= 55 gün = 250) tarafından çekildi. </li><li> Mikropipet 3 eksen (xyz) mikromanipülatör bağlanmıştır. </li><li> Hücreler bir cam alt delta T çanak normal yöntemler kullanılarak plazmid DNA ile transfekte. Medya 2.5mm Ca 2 açık olmalıdır + Tyrode tampon önce deneyleri başlar. </li><li> Transfekte hücreler içeren cam yemekleri konfokal mikroskop 40X 1.3NA immersiyon yağı amacı ile bir lazer tarama yerleştirildi. </li><li> Akut canlı hücre hasarı, hücre zarının içine mikropipet ekleyerek yapılır ve sonra hızlı bir şekilde hücre 3,6 mikropipet geri çekmek oldu . 1.54 s / kare bir aralıkta Ardışık canlı hücre görüntüleri elde edildi. </li><li> Saponin indüklenen zarı bozulma testi için, 2.5mm Ca 2% 0.005 'saponin (Sigma) + Tyrode tampon bir ağırlık akış özel monte perfüzyon sistemi 7 ile perfüze edildi. Perfüzyon oranı yaklaşık 1 ml / dak perfüzyon ucu doğrudan görüntülü hücre üstünde olmalıdır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Fare koşu bandında çalışan bir temsilci, film çekimleri sırasında yapılabilir. Iskelet kas hasarı nedeniyle fare film mg53 / düşük çalışan kapasitesini gösterecektir. Analiz fiber membran onarım kapasitesi, yukarıda ayrıntılı UV lazer hasar protokolü tarafından yol açtığı hasar ölçüde bağlıdır. Bu kapasite, genotip elyaf izole edilmiş olan fare, ekstrasellüler koşulları ve herhangi bir tadilat protein ekspresyonu (transfeksiyon veya enfeksiyon) tarafından etkilenir. Normal vahşi tip fiber boya girişi (Şekil 2a) hafif ve orta sağlayacaktır. Mg53 / elde edilen kas lifi tehlikeye zarı tamir kapasitesine sahip farelerin fiber (Şekil 2b), boya daha önemli giriş gösterecektir. Mikroelektrot yaralanma gösterisi translokasyon MG53 içeren vesi için tipik sonuçlaryaralanma sitede CLES. Şekil 3a ve 3b gösterisi GFP-MG53, hücre zarının içine mikropipet ekleme zarar C2C12 myotubes transfekte. GFP-MG53 mikropipet önce hücre hasarı, plazma zarı ve sitoplazma 3 hem de yer almaktadır. Mikropipet penetrasyon sonrasında, GFP-MG53 içeren veziküller zarar siteleri (ok ucu tarafından gösterildiği gibi) doğru ilerledik. Şekil 3c% 0.005 'saponin, plazma zarı permeabilize bir deterjan ile tedavi edilen bir GFP-MG53 transfekte C2C12 matür gösterir. Saponin tedavi üzerine, GFP-MG53 sitoplazmada hücre zarından transloke. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Weisleder, ve ark. Şekil 1. Fiber hizalama ve yaralanma bölge tanımı. Görünümü ve gösterilen yaralanma bölge tanımı alanı içinde izole kas lifi doğru yönlendirmesi. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Weisleder, ve ark. Şekil 2. FDB lif Görüntüler UV lazer hasar önce yaralanma (0 sn, sol) ve 200 sn yazılan yaralanma (sağda) lifler göstermektedir. Vahşi bir tür fare (a) Elyaf hafif yaralanma göstermektedir. Tehlikeye zarı onarımı ile farelerden alınan lifler (b), girmek için boya izin. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Weisleder, ve ark. Şekil 3. Mikroelektrod ve saponin kültür hücreleri zarar verebilir. Görüntüleri C2C12 myotubes (a, b) ve yaralanma (üstte) ve sonrası yaralanma (alt) önce bir C2C12 myoblast (c) göstermektedir. Mikroelektrot (a, b) yaralandı hücreler yaralanma siteleri (oklar) MG53 translokasyon göstermektedir. Saponin (c) ile tedavi edilen hücreler, hücre zarı MG53 translokasyon göstermektedir.

<ol><li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li>
<li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53%2C+caveolin-3%2C+and+dysferlin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioprotection+of+ischemia%2Freperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li>
<li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li>
<li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
</ol>

Koşu Bandı çalışan tedavi edilen hayvanlar için bir egzersiz yükü sağlayan yararlı bir yöntem. Ölçüm kas fonksiyonu için bir metodoloji ya da dayanıklılık kapasitesi olarak sürekli tekrarlanabilir moda 8 yürütmek zor herkesin bildiği gibi gürültülü bir yaklaşımdır. Genel olarak, yorgunluk kez deney grupları arasında önemli farklılıklar, bazı nakavt fare hatları ve 9 yabani tür fareler arasında bu gibi çözmek için bir bitiş noktası olarak kullanılabilir. Deneysel manipülasyonlar, bazı ilaç denemeleri gibi daha ince fark, üreten, bu tekniği ile ilişkili gürültü üzerinde farklılıkları gidermek olmayabilir. Tekrarlanabilirlik ve duyarlılık bu tekniklerin en üst düzeye çıkarmak için çok yakından oturumunda oturum için gerekli koşulları sağlamak için önemlidir. Gün süre hayvanların yanı sıra kullanılan ısınma dönemi koşulları, icra edildiği önemli faktörlerdir ve deneme yargılanma tutarlı kalmalıdır. Gerilme etkileri farelerde belirli suşları diğer suşlar daha koşu bandı üzerinde daha fazla zaman aday ve dayanıklılık egzersizi 10 farklı yanıt olarak, koşu bandı protokollerin tasarımı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Genel bir kural olarak, birçok farelerin bir yorgunluk çalışmada toplam 200-300 metre koşu bandı hızı (m / m başladıktan sonra her dakika için 1 ile 5 m / m başlangıç ​​hızı) sabit artış ile çalıştırmak mümkün olacaktır. Bir dayanıklılık egzersizi için fareler 30 dakika 2 ya da 3 haftada bir kere, 9 ila 12 m / m arasında çalıştırmak olabilir. Ancak, bireysel çalışmalar, genellikle, deneysel bireysel ihtiyaçlarına uygun protokol bazı optimizasyon gerektirir. UV lazer hasar prosedürü, iskelet kas lifleri 3,6,11 zarı tamir kapasitesini ölçmek için etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir . Bu deneylerin başarısı için hayati bir bileşendir izlerse düzenli bir desen ve buruşuk görünmüyor düzgün bir sarcolemma ile düz bir çubuk biçimli bir görünüm ekranı yalnızca kas lifleri kullanmaktır. Diğer kas lifleri seçilirse zarı hasarı Bu deneylerin sonuçları bu lifler ve yorumlama zaten mevcut olabilir komplike olabilir. Işınlanmış bölgenin lif ve tanımı yönünü Şekil 1&#39;de tanımlanmış olması da önemlidir. Bu, böylece lifler arasında karşılaştırma izin tekrarlanabilir büyüklükte bir yaralanma sağlar. Yaralanma tanımlanan bölgenin tamamen fiber içinde yer alıyorsa, bir iç yaralanma sarcolemma kesintiye yerine oluşturulur. Ayrıca, mesafe kadar taşınmış / F 0 için hesaplanan değer faiz ortalama floresan ölçümü için seçilen bölge çok hassastır. Yaklaşık 200μm 2, ve yaralanma sitesi de dahil olmak üzere komşu bir alana uygundur. Yaralanma tanımlanan bölgenin aksine, bu alanda fiber içinde tamamen yalan gerekir. Fiber dış mekan eklerseniz, daha ciddi bir fenotip ile liflerinde mesafe kadar taşınmış / F 0 düşürürken, ortaya çıkan boş bir alanı az boya girişi ile lifleri mesafe kadar taşınmış / F 0 artacaktır . Bu testin duyarlılığı azaltır, böylece lifler arasında karşılaştırma daha zor hale. Mikropipet hasar tahlil için, etkin bir şekilde hücre zarının zarar için mikropipet ve cam alt çanak arasındaki açı yaklaşık 45 derece olmalıdır. Hücreler, yemeğin altına sıkıca bağlı olmalı ve yuvarlak hücreler mikropipet alay sonra ayırmak, büyük olasılıkla bu yana kullanılan olmamalıdır mikropipet hasar için seçilmiştir. Saponin permeabilzation deneyler, penetrasyon testleri mikropipet ile karşılaştırıldığında daha az gerçekleştirmek için teknik olarak zor ve göreceli olarak daha hızlı. Ancak, saponin hasar saponin diffüz ve o çanak diğer hücrelere zarar verir bu yana sadece bir hücre çanak başına kullanılabilir olması da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Kemirgen koşu bandı </td><td> Columbus Instruments egzersiz 3 / 6 veya eşdeğeri </td><td></td></tr><tr><td> % 70 etanol </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon araçları da dahil olmak üzere ince uçlu forseps, yaylı makas </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td></td></tr><tr><td> 2 mg / ml kollajenaz tip I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + Tyrode tampon (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7.2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mm Ca 2 + Tyrode tampon (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7.2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık kontrol edilebilen orbital çalkalayıcı </td><td> New Brunswick veya eşdeğeri </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG Bulaşık </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> EKK 510 konfokal mikroskop Enterprise 80 mW UV lazer veya eşdeğer konfokal mikroskop ile </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43 veya FM4-64 boyalar </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat kılcal Boyutu 0.8-1.0 X 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Parça No 9530-2 </td></tr><tr><td> Mikropipet çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td> model P-97 </td></tr><tr><td> 3 eksen mikromanipülatör </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 lazer tarama konfokal mikroskop veya eşdeğer mikroskop </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

mg53-aracılı hücre zarı tamiri görselleştirme in vivo ve in vitro sistemleri

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Hücre zarının akut yaralanma tamir elemental normal hücresel fizyoloji süreci ve hatalı zarı onarımı, pek çok dejeneratif insan hastalıklara bağlı olmuştur. Membran mühürlenirken makine önemli bir bileşeni olarak MG53 son keşfi, moleküler biyoloji, temel doku onarımı yanı sıra, rejeneratif tıp potansiyel translasyonel uygulamaları için daha iyi bir anlayış sağlar. Burada detaylı MG53 in vivo fonksiyonu olarak izole kas liflerinin içine boya giriş ölçerek ex vivo zarı tamir kapasitesini test etmek için fare modelleri, treadmill egzersiz protokolleri kullanarak kas hasarı tamir keşfetmek ve dinamik bir süreç izlenmesi için deneysel protokolleri kültür hücreleri canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak MG53-aracılı vezikül kaçakçılığı ve hücre zarı onarımı.

Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Hücre membranındaki akut hasarın onarımı, normal hücresel fizyolojinin temel bir sürecidir ve kusurlu membran onarımı birçok ... ile ilişkilendirilmiştir.

Bu prosedürün genel amacı, hem canlı hayvanda hem de izole hücrelerde membran onarım kapasitesini değerlendirmektir. İzole iskelet kas lifleri toplanır ve FM 1 43 boyası içeren ortamla çevrelenir. Daha sonra, boyanın hücre içine girişini sağlamak amacıyla hücre membranının bir kısmını ışınlayıple hasar vermek için bir UV lazer kullanılır.İzole edilmiş hücreler, hücrenin plazma membranına ve sitozolüne yerleşecek olan GFP MG 53 eksprese eden plazmid DNA ile transfekte edilir. Ardından, hasar oluşturmak amacıyla bir mikro elektrot ucu C two C 12 membranına yerleştirilir. Nihayetinde, GFP MG 53'ün hasar bölgesine translokasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Mikro elektrot penetrasyonu ve kas lifi izolasyonu tekniklerinde uzmanlaşmak için gereken uygulamalar sebebiyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü; laboratuvar yöneticimiz Dr. Lin, doktora sonrası araştırmacı Dr. Wazu, lisansüstü öğrencimiz Matt Orange ve bölümümüzdeki araştırma doçenti Dr. Shazale gösterecekler. Başlamak için, deney sırasında hayvanlardan gelecek atıkları toplamak amacıyla koşu bandının altına bir tepsi veya mavi laboratuvar pedi yerleştirin.Ardından, koşu bandı yüzeyinin açısını ayarlayın. Bazı koşu bantlarında eğimi ayarlamak için entegre bir mekanizma bulunurken, bazılarında koşu bandının başka yöntemlerle yükseltilmesi gerekir. Genellikle düz bir yüzey veya yokuş aşağı veya yokuş yukarı 7 ile 15 derece arasında bir açı kullanılır.Fareleri, elektrikli ızgara kapalı ve bant tahrik motoru açıkken ancak bant hareket etmiyorken koşu bandına yerleştirerek alıştırın; 15 dakikalık alışma süresinden sonra motivasyonel elektrikli ızgarayı açın. Koşu bandını yaklaşık beş metre/dakika başlangıç hızıyla çalıştırın. Hızı her dakika bir ila iki metre/dakika artırarak hayvana beş dakikalık bir ısınma süresi tanıyın.Test sırasındaki uyumu artırmak için bu ısınma süresini üç ila 10 gün boyunca her gün tekrarlayın. Akut bitkinlik egzersizi gerçekleştirmek için, maksimum hıza ulaşana kadar koşu bandının hızını zamanla artırın ve bitkinlik belirtilerini izleyin.Bir hayvan, zamanın yarısından fazlasını koşu bandı dışında veya beş saniye üst üste ızgara üzerinde geçirdiğinde tükenmiş sayılır. Tükenmiş fareyi çıkarın ve toplam koşu süresini kaydedin. Dayanıklılık eğitimi.Koşu protokolleri aynı ısınma prosedürü ile başlar. Ancak, maksimum hız genellikle daha düşüktür ve koşu süreleri oldukça uzun olabilir. Testten sonra fareleri kendi kafeslerine geri koyun ve koşu bandını %70 ethanol ile temizleyin.İleri analizler için ayaktaki flexor digitorum brevis kasının yüzeysel tabakasını izole edin. İlk olarak, alttaki kasa zarar vermemeye dikkat ederek ayak tabanının derisini orta hat boyunca kesin. Ardından, yatay kesikler atarak deriyi çıkarın.Calcaneus kemiğine tutunmuş olan FDB kasının yassı beyaz tendonunu tanımlayın. Tendonu tutunma bölgesine yakın bir yerden ayırmak ve ardından kesmek için pens kullanın. Bağ dokularını temizlerken tendonu nazikçe yukarı çekin.Distal tendonların tekil parmaklara ayrıldığı noktayı belirleyin. Tendonları, daha derin kas tabakasına bağlandıkları yerden kesin ve FDB'yi çıkarın. FDB kas demetini, 37 °C'ye önceden ısıtılmış bir mililitre kollajenaz çözeltisinin içine yerleştirin.Tüpü 37 derece Celsius'lik bir orbital çalkalayıcıya yatay olarak bantlayın ve 65 dakika boyunca 200 RPM hızında çalkalayın. Yeterli sindirim, parçalanmış görünüm ve soluk renk ile belirlenir. Sindirilmiş demetin geçişine izin vermek için bir mililitrelik bir pipet ucunun ucunu kesin.Demeti, yaklaşık 600 µL 2.5. Kalsiyum tiro içeren bir santrifüj tüpüne kolayca aktarın. Gevşek liflerin demetten ayrılması için tüpü nazikçe ters çevirerek sallayın.Ardından, 30 µL'lik bir pipet ucunun ucunu, çapı kas demetinden sadece biraz daha küçük olacak şekilde kesin. Bu ucu, demeti pipete çekmek ve ardından tekrar çözeltinin içine itmek için kullanın. Liflerin çoğunluğu demetten ayrılana kadar bu işlemi tekrarlayın.Tüpü nazikçe çevirerek ayrıştırılmış fiberleri karıştırın. İstenilen miktarı alıp cam tabanlı delta T tabağına damlatın. Kalan fiberleri, kullanım ve ek çalışmalar için yaklaşık altı saat boyunca dört derece Celsius'ta saklayın.Kabın beş dakika boyunca kıpırdatılmadan bekletilmesine izin verin. Bu, fiberlerin kabın cam tabanına yapışmasını sağlar. Cam tabanlı kabı, UV lazerle donatılmış bir konfokal mikroskoba yerleştirin.Normal bir striyasyon paterninin varlığını ve düz, çubuk benzeri bir şekli kontrol etmek için fiberleri 100 x'ten daha büyük bir büyütmede faz kontrast mikroskobunda gözlemleyin. Çözeltiye, final konsantrasyonu 2.5 micromolar olacak şekilde FM 1 43 veya FM 4 64 styro perineum boyaları ekleyin. Hasar oluşturmak için fiberi, görüş alanının sol üstünden sağ altına doğru 45 derecelik bir açıyla konumlandırın.Plazma membranının beş çarpı beş piksellik bir alanını ışınlayın. Maksimum güce ayarlanmış bir UV lazeri beş saniye boyunca uygulandığında, ışınlanan bölge plazma membranını bölmelidir; beş çarpı beşlik kutunun yarısı fiberin içinde, geri kalanı ise fiberin dışında olmalıdır. Boyanın fibere girişini, beş dakikaya kadar her beş saniyede bir görüntülüleyin. Floresan boya zamanla fiber içine endositoz edileceği ve veri analizini karmaşıklaştıracağı için, kap başına yalnızca üç fiber ışınlanabilir.Üç fiber kullanıldıktan sonra yeni bir kap hazırlanmalıdır. Fiberler arası karşılaştırma yapmak için analiz yazılımı kullanarak, yaklaşık 200 kare mikronluk bir alandaki floresans yoğunluğu değişimini hesaplayın. Her kare için delta F bölü F sıfır şeklinde şu hesaplama yapılmalıdır; burada F sıfır, yakalanan ilk karedeki ilgi alanının ortalama floresansı, delta F ise sonraki her karedeki floresans değişimidir.GFP MG 53 eksprese eden plazmid DNA ile hücreleri transfekte etmek için standart yöntemleri kullanın. Ardından mikro pipetleri hazırlayın. Bir mikro pipete Pyrex kapiler yerleştirin.Önceden ayarlanmış programa göre çekme ve çekme işlemleri gerçekleştirilir. Mikro pipet, üç eksenli bir mikro manipülatör kültürüne takılır. Delta T kabındaki ortam uzaklaştırılır ve yerine 2,5 millimolar kalsiyum tiro tamponu eklenir.Transfekte edilmiş hücreleri içeren kap, 40 x 1.3 NA yağ daldırma objektifli bir lazer taramalı konfokal mikroskoba yerleştirin. Mikro pipeti hücre membranına yerleştirip ardından hızla geri çekerek hücrede akut canlı hücre hasarı oluşturun. Troponin kaynaklı membran bozulması için kare başına 1,54 saniye aralıklarla ardışık canlı hücre görüntüleri toplayın.Görüntülenen hücrenin tam üzerine, dakikada yaklaşık bir mililitre hızla %0.005 troponin PERFÜZYONU yapın. Koşu kapasitesindeki azalmayı ölçmek için koşu bandı kullanılabilir. Burada görülen MG 53 nakavt fareler, iskelet kasındaki hasar nedeniyle azalmış koşu kapasitesine sahiptir.UV lazerin neden olduğu hasarın boyutu, görülen fiberin membran onarım kapasitesine bağlıdır. Burada normal bir fareden alınan, hasar öncesi bir fiber görülmektedir. Bu görüntü 200 saniye sonra yakalanmıştır ve hafif bir hasarı göstermektedir.Membran onarım kapasitesi bozulmuş MG 53 nakavt farelerinden türetilen bir kas lifi, hasar sonrası daha belirgin boya girişine sahip olacaktır. Burada, hasarsız bir GFP MG 53 transfect edilmiş C two C 12 miyotüp örneği verilmiştir. Bu görüntüdeki ok, hasar bölgelerine doğru hareket eden GFP MG 53 içeren vezikülleri göstermektedir.Bu örnekte, plazma membranına zarar vermek için saponin kullanılmıştır. Yaralanma sonrası GFP MG 53'ün sitozolden hücre membranına translokasyonuna dikkat ediniz. Bu prosedürü uygularken, pürüzsüz saralemembranlara ve net çizgilenme modellerine sahip kaliteli kas liflerinin izole edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Bu videoyu izledikten sonra, kasın membran onarım kapasitesinin ve kültürlenmiş hücrelerin nasıl değerlendirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu...

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak...

Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Iyileşme yaralı hücrelerinin hücre zarı gibi bir işlem yaralanma siteye özgü protein ve hücre içi bölmeler kaçakçılığı içerir. Bu protokol, bu süreçleri izlemek için deneyleri açıklar.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Termoplazmonik delme yöntemi, hücrelerde ve dev unilameller veziküllerde plazma membran onarımı sırasında protein tepkilerini incelemek için konfokal mikroskopi, optik cımbız ve altın nanopartikülleri entegre eder. Teknik, hızlı ve lokalize membran delinmesini mümkün kılarak, anahtar proteinlerin ve bunların karmaşık plazma membran onarım mekanizmasındaki fonksiyonel rollerinin tanımlanmasına izin verir.

Canlı Hücrelerde ve Model Membranlarda Plazma Membran Onarımını Araştırmak İçin Termoplazmonik Bir Yaklaşım

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

Öğrenin MG53-aracılı hücre zarı tamiri yöntemlerini in vivo ve in vitro sistemlerde görselleştirmeyi. Bu teknikler, iskelet kası liflerinde membran onarım kapasitesini değerlendirmek için kullanılır.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Daha fazla video keşfet