Name: Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Öğrenin, düşük viral yüklerde HIV-1 RNA miktarını belirlemek ve tek genom dizileme yapmak için real-time PCR yöntemini. Bu teknik 0.3 kopya/ml gibi düşük seviyelerde bile viral RNA tespiti sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar pek çok çalışmada HIV-1 katılan hastaların kabul etmek istiyoruz. JMC FM Kirby Vakfı desteği ile Amerikan Kanser Derneği, Araştırma Profesörü oldu.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

HIV-1 enfekte doğal enfeksiyon kontrol, kombine antiretroviral tedavi bireyler (CART) ya da çok düşük viral yük, plazma 4, 11, 12, 17, 18 ml başına tipik olarak yaklaşık 1 kopyalama var. Doğal kontrolü olan hastalarda viral yük, çoğu zaman ayrı bir set noktası 1, 2, 17 etrafında dalgalanma. Testlerin duyarlılığı burada plazma giriş hacmi son derece bağımlı nitelendirdi. Genellikle, 7 ml plazma ile çalışıyoruz, ancak olumlu sonuçlar, hem de gerçek plazma viral yük bağlı olarak, plazma küçük miktarla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Rasgele hekzamer (500 ug / ml) </td><td> Promega </td><td> C118A </td><td></td></tr><tr><td> Taqman tampon A </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4304441 </td><td></td></tr><tr><td> RNAsin (40 U / ul) </td><td> Promega </td><td> N211B </td><td></td></tr><tr><td> RT enzim (200 U / ul) </td><td> Strategene </td><td> 600107-51 </td><td></td></tr><tr><td> AmpliTaq Gold DNA Polimeraz </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> 6-pack </td></tr><tr><td> AmpliTaq 10XGold PCR tampon II </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> enzim ile geliyor </td></tr><tr><td> Magnesiumcloride 25 mm </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> enzim ile geliyor </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl tamponu, pH 8.0, 5 mM </td><td> Invitrogen </td><td> AM9855G </td><td></td></tr><tr><td> Üstsimge III ters transkriptaz enzim, 200 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-044 </td><td></td></tr><tr><td> Üstsimge III 10X buffer </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> enzim ile geliyor </td></tr><tr><td> DTT 100 mm </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> enzim ile geliyor </td></tr><tr><td> Platinum Taq DNA polimeraz High Fidelity 5 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td></td></tr><tr><td> 10X High Fidelity PCR Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td> enzim ile geliyor </td></tr><tr><td> Proteinaz-K 20 mg / ml </td><td> Ambion </td><td> 2546 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidinium Tiyosiyanat çözüm 6M </td><td> FlukaBiochemica </td><td> 50983 </td><td></td></tr><tr><td> Glikojen 20 mg / ml </td><td> Roche </td><td> 10901393001 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19516 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol 70% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E702-3 </td><td></td></tr><tr><td> Moleküler sınıf su </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP (her biri 25 mg) </td><td> BioLine </td><td> BIO-39.025 </td><td></td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Euipment, Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kolay Seal Santrifüj Tüpleri (16x73mm) </td><td> Seaton Bilimsel </td><td> 6041 </td><td></td></tr><tr><td> Beyaz Kemik kron </td><td> Seaton Bilimsel </td><td> 4020 </td><td> Kolay Mühür Tüpler için Kapaklar </td></tr><tr><td> Optiseal Bell-Top Tüpler Tüp Rack, 8,9 ml </td><td> Beckman </td><td> 361642 </td><td></td></tr><tr><td> Hex sürücü ½ inc açılış </td><td> Seaton Bilimsel </td><td> 4013 </td><td></td></tr><tr><td> Kapak kaldırma tüpü </td><td> Seaton Bilimsel </td><td> 4014 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serolojik pipetler </td><td> Costar </td><td> 4051 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetboy </td><td> herhangi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Transferi pipetler </td><td> ISC Bioexpress </td><td> P-5005-7 </td><td></td></tr><tr><td> 5.8 ml Dispossable transferi pipetler, ince uçlu </td><td> VWR </td><td> 14670-329 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml santrifüj tüplerine </td><td> Şahin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml santrifüj tüplerine </td><td> herhangi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris tampon Tuzlu tablet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5030-100TAB </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasantrifüjdeki ve rotor </td><td> Sorval </td><td> 90SE ve T-1270 </td><td></td></tr><tr><td> 96-PCR plakaları </td><td> Biorad </td><td> HSS-9601 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Reaktif rezervuar </td><td> Costar </td><td> 4870 </td><td></td></tr><tr><td> Microamp optik 96-iyi reaksiyon plaka </td><td> Applied Biosystems </td><td> N801-0560 </td><td></td></tr><tr><td> Optik plaka kapsar </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4333183 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp Optik Sıkıştırma Pad </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4312639 </td><td></td></tr><tr><td> MicrosealBir film </td><td> Biorad </td><td> MSA-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml santrifüj tüplerine </td><td> Herhangi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> % 1 agaroz jel (E-jel, Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> G-7008-01 </td><td></td></tr><tr><td> E-baz (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> EB-M03 </td><td></td></tr></tbody></table> EDTA Koleksiyonu tüpler herhangi bir marka

standart klinik tahliller algılama sınırı aşağıda viral yükler hiv enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve hiv-1 rna miktarının

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Viral genler yükseltme ve standart analizleri ile tespit sınırı altında (aşağıda 50-75 kopya / ml) viral yük ile HIV-1 enfekte kişilerde HIV-1 RNA miktarının belirlenmesi, hastada viral dinamikleri ve virüs konak etkileşimleri hakkında fikir edinmek için gerekli Kimdir enfeksiyon ve kombine antiretroviral tedaviye (CART) olanlar doğal olarak kontrol eder. Burada viral genomların tek genetik dizilimini (SGS protokolü) 13, 19 ve ne kadar doğru, düşük viral yükü (tek kopya assay (SCA) protokolü) 12, 20 olan hastalarda HIV-1 RNA miktarını yükseltmek için nasıl açıklar . Tek kopya testi duyarlılığı plazma test olmak hacmi bağlı olarak ile gerçek-zamanlı PCR testtir. , Tek bir virüs genomunun 7 ml plazma tespit edilirse, daha sonra RNA kopya sayısı 0.3 kopya / ml olarak bildirilmiştir. Testin RNA ekstraksiyon verimliliği için bir iç kontrol testleri ve olası DNA veya kirlenme amplifikasyonu için kontrol. Hasta örnekleri üç nüsha olarak ölçülür. Tek genom sıralama assay (SGS), artık yaygın olarak kullanılan ve emek-yoğun olmayan 3, 7, 12, 14, 15 olarak kabul uç nokta cDNA ürün 96-iyi yayılmış seyreltilmiş hangi bir sınırlayıcı seyreltme testtir plakası. Poisson dağılımına göre, kuyuların en az 1 / 3 &#39;ünden ürün vermek, bir, tek bir cDNA molekülden amplifikasyon PCR ürününün ortaya çıkan% 80 şansı vardır. SGS resampling maruz kalma ve PCR-tanıtıldı rekombinasyon 19 önyargılı olmayan klonlama üzerinde bir avantaja sahiptir. Ancak, SCA ve SGS amplifikasyon başarı astar tasarım bağlıdır. Her iki Testler, HIV-1 alt tip B için geliştirilmiş, ancak değişen astar, problar ve standartlarına göre diğer alt tiplerinin ve genomun diğer bölgeler için adapte edilebilir.

HIV-1 RNA düzeyi, plazma ve sıralama miktarının tek HIV-1 viral yük saptama sınırının altında (50-75 kopya / ml) bireylerin genomların zordur. Burada özü ve güvenilir bir şekilde HIV-1 RNA 0.3 kopya / ml tedbirler ve çok düşük viral yük örnekleri, tek bir genom sıralama viral genomların yükseltmek için nasıl bir gerçek zamanlı PCR kullanarak plazma viral RNA miktarını nasıl açıklar.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Standart analizlerin saptama sınırının altında ( ... altında) viral yüke sahip HIV-1 enfekte bireylerde viral genlerin amplifikasyonu ve HIV-1 RNA'sının nicelendirilmesi

Bu videoda, plazma mililitresinde 50 kopyadan daha az viral yüke sahip bireylerden tekil HIV genomlarının miktarlarının belirlenmesi ve sekanslanması için kullanılan yöntemler gösterilmektedir. İlk olarak, yedi mililitre plazma içeren bir tüp, çöktürme işlemi için santrifüj edilir. Ardından, HIV 1 seviyesini belirlemek için virüs RNA'sı ekstrakte edilir.RNA'nın ters transkripsiyonunun yapıldığı, standartlar ve kontrollerle birlikte 96 kuyucuklu plakaya yüklendiği ve kantitatif gerçek zamanlı PCR'a tabi tutulduğu tek kopya analizi gerçekleştirilir. Ardından, viremi düzeyi, kullanılan plazma giriş hacmine göre hesaplanır. Viral popülasyonu karakterize etmek için mililitre başına 0.3 kopya kadar düşük miktarlar tespit edilebilir.Viral RNA'dan transkribe edilen cDNA'nın uç nokta dilüsyonuna ulaşmak için 96 kuyucuklu bir plakaya dağıtıldığı tek bir genom dizileme analizi gerçekleştirilir. Ardından, viral genomları çoğaltmak için iç içe (nested) PCR uygulanır. Belirli bir örnek için PCR reaksiyonlarının %30 veya daha azı pozitifse, tek bir cDNA kopyasının amplifikasyonu olduğu belirtilir.Ardından, bireysel viral genomların nükleotit dizilimini ortaya çıkarmak için bu örnekler dizilenir. Bu tekniklerin yüksek hassasiyeti, standart analizlerle tespit edilemeyen HIV RNA seviyesine sahip hastaları izlememize ve doğal kontrol mekanizmalarını anlamamıza olanak tanır. HIV'i incelemek için bu yöntemleri farklı primerler ve bir dahili standart ile kullansak da, aynı yöntem diğer virüslerin çalışılmasında da kullanılabilir.Genel olarak bu yöntem, virüsün büyük plazma hacimlerinden izole edilmesinin zor olması ve yanlış pozitifleri önlemek için DNA'dan arındırılmış bir ortam gerektirmesi nedeniyle zahmetlidir. Bu prosedüre hasta plazma örneklerinden RNA ekstre ederek başlayın. Yedi mililitre plazmayı temiz bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.Tek kopya analizi için RNA ekstraksiyonu yapılacaksa, bu aşamada 30.000 adet RCAs virüsü kopyası içeren 200 µL internal virion kontrolü eklenir. Ardından, RNA kantifikasyonunu etkileyebilecek lipidlerden ve hücresel kalıntılardan kurtulmak için plazmayı 2.600 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, bir settin easy seal santrifüj tüpünün bir yanını, hücresel kalıntı veya lipidlerden kaçınarak su geçirmez bir kalemle işaretleyin. Plazmayı işaretli settin eae tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın.Ardından, girilen plazma hacmini kaydedin. Tüpleri, vidalı boyun kısmının altına kadar tris tamponlu salin ile doldurun. Hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Tüplerin kapaklarını kapatın. İşaretleri dışa bakacak şekilde numuneleri önceden soğutulmuş bir ultrasantrifüj rotoruna yerleştirin. 4 °C'de 30 dakika boyunca 170,000 ×g hızda santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra pelet görünür olmayacaktır. Süpernatantı uzaklaştırın, ardından viral pelete 90 µL moleküler derece su ve 10 µL ACE K proteini ekleyin. Daha sonra, tüpün açılı durduğundan ve peletin ACE K proteinli su karışımına tamamen gömüldüğünden emin olun.Tüpü 55 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, numuneyi tüpün dibine indirmek için tüpü kısa süre santrifüjleyin. Ardından, 10 µL 20 mg/mL glikojen ve 315 µL 6 M gadyum tiyosiyanat çözeltisi ekledikten sonra vorteksleyin.Tüpün içeriğini, 495 µL moleküler saflıkta izopropanol içeren yeni bir 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüpüne hafifçe aktarın ve 10 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 21.000 ×g'de santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve tüpe 500 µL %70 etanol ekleyip 10 saniye boyunca vorteksleyin ve 21.000 ×g'de 15 dakika santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, geniş uçlu bir transfer pipeti kullanarak etanolü uzaklaştırın, kalıntı etanolü temizlemek için tekrar santrifüjleyin ve ardından peleti 10 dakika boyunca havada kurutun.Eğer tek kopya analizi yapılacaksa, peleti 55 µL RNA tamponunda çözün ve tüpü buz üzerine yerleştirin. Eğer tek genom dizilemesi yapılacaksa, RNA'yı pH 8.0'da 40 µL tris hidroklorür içinde çözün ve tek kopya analizi gerçekleştirmek için tüpleri oda sıcaklığında bekletin.HIV one ve RCAs standart eğrileri, RNA tamponu içerisinde HIV one ve RCAs RNA transkriptlerinin yarı logaritmik seri dilüsyonları yapılarak hazırlanır. 1,5 mililitrelik tüpler etiketlendikten sonra, her bir tüpe 54 mikrolitre RNA tamponu ekleyin. Ardından, HIV one için 10 mikrolitrede 0,3 RNA kopya sayısına ve RCAs için 10 mikrolitrede 100 RNA kopya sayısına kadar dilüsyon yapın.Her dilüsyon arasında vorteksleyerek karıştırın. Her tüpe 54 µL RNA tamponu eklendikten sonra, ilk tüpe 25 µL transkript ekleyerek başlayın; vorteksle kısa süreli karıştırın, santrifüjleyin ve sırasıyla bir sonraki tüpe aktarın ve etiketlenmiş son tüpe kadar bu şekilde devam edin.Seyreltmeler hazırlandıktan sonra, cDNA sentezi için ters transkriptazı veya RT kokteylini birleştirin. DNA kaynaklı amplifikasyonu kontrol etmek için sekiz adet ters transkriptaz içermeyen (NRT) kontrol reaksiyonu da dahil olmak üzere, 96 adet RT-PCR reaksiyonu için yeterli miktarda hazırlayın. Ardından, standartlar ve kontroller de dahil olmak üzere sekiz hasta örneğini barındıracak olan optik 96 kuyucuklu bir plaka hazırlayın.NRTle belirlenmiş sekiz kuyuya 20 µL NRT reaksiyon karışımı ve kalan 88 kuyuya 20 µL RT reaksiyon karışımı ekleyin. RT ve NRT karışımlarını plakaya ekledikten sonra, negatif kontroller olduğunu belirten etiketli kuyulara 10 µL su ekleyin. Ardından, HIV etiketli kuyulara beraberindeki yazılı protokolde gösterilen konsantrasyonlarda 10 µL HIV transkriptleri ve RCA olarak etiketlenmiş iki kuyuya ekleme yapın.Plakadaki "sample" (numune) olarak etiketlenmiş, yan yana üçlü gruplar halindeki sekiz set kuyucuğa, istenen konsantrasyonlarda 10 µL RCA transkriptleri ekleyin ve ardından belirtilen numuneden 10 µL ekleyin. Ayrıca, bu numuneden 10 µL'yi "NRT" olarak etiketlenmiş sekiz kuyucuğa ve ardından "internal control" (iç kontrol) olarak etiketlenmiş kuyucuklara ekleyin. İşlem tamamlandığında beş µL numune ve beş µL su eklemiş olduğunuzdan emin olun.96 kuyucuklu plaka, bu şekilde gösterildiği gibi hazırlanır. Plaka mühürlenir ve bir termosikletörde şu şekilde çalıştırılır: 15 dakika boyunca 25 °C, 40 dakika boyunca 42 °C, 10 dakika boyunca 85 °C, 30 dakika boyunca 25 °C ve sonrasında 5 °C'de bekletilir.cDNA sentezi gerçekleşirken, HIV ve RCA'lar için PCR master karışımlarını hazırlayın. cDNA sentezi tamamlandığında, plakayı temiz oda dışındaki cDNA işlemlerine ayrılmış bölgeye götürün.Bu şekilde yeşil ile gösterilen kuyucukların her birine 20 µL QPCR için H-I-V-P-C-R master mix ekleyin. Ardından, bu şekilde gri ile gösterilen kuyucuğa 20 µL RCAs PCR master mix ekleyin. Plakayı 2.600 ×g hızında merkezleterek döndürün.Plakayı bir gerçek zamanlı PCR cihazına yerleştirin ve QPCR'ı şu koşullarla çalıştırın: 10 dakika boyunca 95 °C. Ardından, 15 saniye boyunca 95 °C ve bir dakika boyunca 60 °C şeklinde 45 döngü. Sonuçlar elde edildikten sonra, tekil genom dizilemesi yapmak için RCA'lar ve HIV için ayrı analizler gereklidir.pH 8.0'da tris hidroklorür içinde süspansiyon halinde bulunan RNA'yı kalıp olarak kullanarak CD NA sentezleyerek başlayın. İlk olarak 96 kuyucuklu bir PCR plakasında; 5 µL 10 mM DN NTP'ler, 5 µL 2 mM gene spesifik primer (pole veya en) ve 40 µL ekstrakte edilmiş RNA'yı birleştirin. Plakayı BioRad marka bir micros eal film ile mühürleyin.Ardından, denatürasyon için reaksiyonu 65 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. RNA karışımını. RNA denatüre olurken RT reaksiyon karışımını hazırlayın.Bunun, tek kopya analizi için kullanılan RT reaksiyon karışımından farklı bir karışım olduğunu unutmayın. Denatürasyon adımından sonra, RNA'yı denatüre formda tutmak için PCR plakasını BUZ üzerine yerleştirin. Ardından, her bir örneğe taze hazırlanmış RT reaksiyon karışımından 50 µL ekleyin ve PCR plakasını termosiklet cihazında şu ayarlarla çalıştırın: 45 °C'de 50 dakika, 85 °C'de 10 dakika ve bekletme için 4 °C.Bu adımda, cDNA sentezlenirken RNA, cDNA'ya ters transkript edilir. PCR reaksiyon karışımını P6-RT veya zarf PCR primerleri ile hazırlayın. Bunun, tek kopya analizi için kullanılan PCR reaksiyon karışımından farklı bir karışım olduğunu unutmayın. Yeni bir 96 kuyucuklu PCR plakasına, 70 örnek ve üç negatif kontrol dahil olmak üzere toplam 73 kuyucuğun her birine 8,0 µL taze hazırlanmış PCR reaksiyon karışımı ekleyin.CD NA sentezi tamamlandığında, plakayı temiz oda dışındaki CD NA işlemleri için belirlenmiş alana taşıyın. Ardından, nihai hacmi 140 microliter'e tamamlamak için CD NA örneğine pH 8.0'da 40 microliter tris hidroklorür ekleyin. Daha sonra 70 kuyucuğun her birine 2.0 microliter örnek ve negatif kontrollerin her birine 2.0 microliter su ekleyin. Bir PCR plağını mühürleyin ve burada gösterilen programı kullanarak PCR'ı çalıştırın.Ardından, beraberindeki yazılı metinde yer alan talimatlara göre nested PCR uygulayın. PCR sonrası örnekleri %1'lik agaroz jelde yürütün. Sonuçları inceleyin.Kuyucukların %30'undan fazlası pozitif değilse, PCR ürünlerinin çoğunluğu tek bir cDNA molekülünün sonucudur. Bu videoda açıklandığı şekilde tek kopya analizi gerçekleştirilmiştir. Bu şekil, bazı seçkin kontrolcülerin qPCR sonuçlarını göstermektedir.Burada görülebileceği üzere, örnekler ve seyreltilmiş HIV standardı için amplifikasyon eğrileri doğru görünmektedir. Daire içine alınmış yedi numaralı örnek hariç, çoğu örnekte dahili viryon standardının geri kazanımı 1500 kopyanın üzerindeydi. Verimli bir RNA ekstraksiyonunun sağlandığını gösteren kırmızı ile vurgulanmış sonuçlar üç numaralı örneğe aittir.Üç kuyucuktaki kopya sayıları sırasıyla sıfır, bir ve sıfır kopyadır. Turuncu ile vurgulanan NRT kontrolü ve sarı ile vurgulanan negatif kontrolün her ikisi de negatif çıkmış olup, bu durum amplifikasyonun diğer örneklerden gelen kontaminasyonla etkilenmediğini doğrulamaktadır. Pozitif ve negatif kontrollerden geçildiği için artık kopya sayısı hesaplanabilir. RNA elüsyonundaki toplam kopya sayısını elde etmek için 0,3 olan ortalama kopya sayısı 5,5 faktörü ile çarpılmalıdır; 0,3 çarpı 5,5 eşittir 1,65. Ardından bu değer, analiz edilen toplam plazma hacmi olan 7,3 mililitreye bölündüğünde, ml başına 0,2 kopya HIV 1 RNA değeri elde edilir.Tekil genom dizileme testi videoda açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu şekil, çalışmadaki HIV-1 kontrol edilemeyen bireylerden birine ait AROS jelini göstermektedir. H1 ve H2 kuyucuklarındaki negatif kontrollerin her ikisi de negatiftir.Kuyu sayısının üçte birinden daha azının amplifiye olmuş olması, bunun bir uç nokta dilüsyonu olduğunu doğrulamaktadır ve bu amplifikasyonların çoğu tek bir cDNA kopyasından kaynaklanmaktadır. SGS'den elde edilen dizilerin hizalaması burada gösterilmiştir. Belirsizlik içeren bölge bulunmaması, amplifikasyonun tek bir cDNA kopyasından gerçekleştiğini kanıtlamaktadır. Yüksek hacimli plazmalardan RNA ekstraksiyonu denenirken.Analizin geliştirilmesinden sonra, assay verimliliğini etkileyebilecek hücre ve lipitlerden kaçınmak için ön santrifüj işleminin gerçekleştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu teknik, standart assaylerin saptama limitinin altındaki viral yüklere sahip çok çeşitli hasta gruplarında viral dinamikleri incelemek için kullanılmıştır.

amplifying-quantifying-hiv-1-rna-hiv-infected-individuals-with-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

HIV-1 replikasyon döngüsünün entegrasyon sonrası adımlarını hedefleyen RNA moleküllerinin etkinliğini ve toksisitesini değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır. Bu yöntemler, yeni molekülleri taramak ve mevcut moleküllerin formatını optimize etmek için kullanışlıdır.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile birlikte gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu analiz RNA virüs enfeksiyonları düzeyini ölçmek için yaygın olarak kullanılmış. Burada dang virüs dahil olmak üzere birkaç RNA virüsleri miktar için geliştirilen bir RNA arıtma adım gerekli değildir doğrudan bir RT-qPCR tahlil mevcut.

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA'yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP'yi incelemek için kullandık.

İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Öğrenin, düşük viral yüklerde HIV-1 RNA miktarını belirlemek ve tek genom dizileme yapmak için real-time PCR yöntemini. Bu teknik 0.3 kopya/ml gibi düşük seviyelerde bile viral RNA tespiti sağlar.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Daha fazla video keşfet