Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir model herpes virüsünün litik replikasyonunda bir konak sinyal yolunun rolünü incelemek için çeşitli virolojik ve biyokimyasal yaklaşımlar kullanmaktır. Burada bir örnek olarak, herpes virüsü gamma HV 68 ile enfeksiyon sırasında mitokondriyal antiviral sinyal proteini Mavs'in rolünü inceliyoruz. Akut enfeksiyon sırasında Mavs'in rolünü inceleyen ilk olarak, vahşi tip ve Mavs nakavt fareleri, akut viral bir enfeksiyonu takiben gama HV 68 ile enfekte edilir.

Fare akciğeri toplanır ve viral yükler, numunelerin seri olarak seyreltildiği ve kaplandığı bir plak testi ile belirlenir. Tek tabakalarda daha sonra plakların sayısı sayılır. Nakavt farelerde artan viral yükler, ilgilenilen genin antiviral bir rol oynadığını düşündürmektedir.

Buna karşılık, nakavt farelerde azalmış viral yükler, genin viral enfeksiyon için gerekli olduğunu gösterir Bu bulguları doğrulamak için. İn vitro viral çok aşamalı büyüme kinetiği fare embriyonik fibroblastlarında, vahşi tipte incelenir ve mavs nakavt fare embriyonik fibroblastları gama HV 68 ile enfekte edilir ve çeşitli sürelerde inkübe edilir. Hücreler daha sonra toplanır ve yabani tip hücreler ile mavs eksik hücreler arasındaki çok aşamalı büyüme kinetiğini karşılaştırmak için plak testleri yapılır.

Bu bulguları daha da doğrulamak için, vahşi tip ve mavs nakavt fare embriyonik fibroblast hücreleri gama HV 68 ile enfekte edilir. Daha sonra DNA ve RNA, enfekte olmuş hücrelerden ayrı ayrı ekstrakte edilir ve viral genomik transkriptler gerçek zamanlı PCR ile analiz edilir. Bu protokol için ilk olarak, bir virüs litik enfeksiyonu sırasında bir konak bağışıklık yolunun rolünü incelediğimizde aklımıza geldi.

Bu protokol, diğer patojenler tarafından enfeksiyon sırasında konak sinyal yollarının kurallarını araştırmak için potansiyel olarak uygulanabilir. Bu prosedüre, altı ila sekiz haftalık cinsiyet uyumlu çöp yapılan farelerin sevkıyattan sonra dört günlük bir süre boyunca alışmasına izin vererek başlayın. Aşağıdaki deney bir biyolojik tehlike tesisinde gerçekleştirilecektir.

Hazırlık olarak, laboratuvar önlüğü, eldiven, maske ve biyogüvenlik kabininde çalışan patikler dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyin. İkinci seviye. Viral süspansiyonu, enfekte olacak her fare için 40 ila 10.000 PFU gama HV 68 ve 30 mikrolitre steril PBS ile hazırlayın.

İntraperitoneal ketamin Ksilazin enjeksiyonunu takiben viral süspansiyonu buz üzerinde tutun. Bir ayak parmağını kıstırarak farelerin sakinleştirildiğinden emin olun. Daha sonra bir pipet kullanarak, 30 mikrolitre viral süspansiyonu sol veya sağ burun deliğine damla damla verin.

Virüsün akciğere hava yoluyla iletilmesini kolaylaştırmak için fareyi beş ila 10 dakika yan yatırın. Daha sonra fareleri kafeslerine geri koyun ve sedasyondan tamamen kurtulana kadar izleyin. Daha sonra, enfeksiyondan sonraki çeşitli günlerde viral titreyi değerlendirmek için bir hücre lizatı hazırlamak üzere enjekte edilen farelerden akciğer dokusu toplanır.

Kurban edilen farelerden toplanan akciğerleri, buz üzerinde 500 mikrolitre 1.0 milimetre zirkonya silika boncuk içeren steril 1.5 mililitrelik vidalı kapaklı tüplere yerleştirin. Değilse, aynı gün içinde bir sonraki adıma geçin. Numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Aksi takdirde, bir mililitre soğuk serum içermeyen DMEM ekleyin. Tüpü bir boncuk çırpıcıya yerleştirin ve akciğerleri 30 saniye boyunca homojenize etmek için başlat düğmesine basın. Virüsü etkisiz hale getirebilecek numunenin aşırı ısınmasını önlemek için.

30 saniye homojenizasyondan sonra tüpü en az bir dakika buz üzerinde soğutun. Ardından bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, homojenize dokuyu bir dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 RCF'de santrifüjleyin.

Dönüşü takiben, hücre kalıntıları tüpün dibinde olacak ve lipitler yüzeyde olacaktır. NIH üç, T, üç veya BHK 21 tek katmanlı kullanarak bir plak testi yapmak için hemen burada gösterildiği gibi snat'ı alın. Daha sonra, bir plak tahlili yapılır Numunede bulunan viral titreyi belirlemek için, viral süpernatantın seri seyreltmesini yaparak plak tahliline başlayın.

İlk olarak, çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir plakaya 270 mikrolitre ortam ekleyin. İlk satırı boş bırakın. Daha sonra, 96 oyuklu plaka plakasının ilk sırasına 200 mikrolitre süpernatan ekleyin, her numune üç kopya halinde.

Daha sonra, numunenin 30 mikrolitresini ilk sıradan bir sonraki sıraya aktarın ve karıştırın. Daha sonra karışımın 30 mikrolitresini bir sonraki sıraya aktarın ve karıştırın. On kat seri seyreltme yapmak için bu adımı birkaç kez tekrarlayın.

Daha sonra, seyreltilmiş viral süpernatanı hücre tek tabakasına ekleyin. 24 oyuklu bir plakada. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve hücre kalıntılarını çıkarmak için inkübasyonu takip eden iki saatlik bir inkübasyon sırasında plakayı her 30 dakikada bir sallayın, süpernatanı plakadan aspire edin.

Daha sonra hücreleri bir kez taze ortamla yıkayın. Yıkamadan sonra, hücrelere metilselüloz içeren ortam ekleyin. Hücreleri dört ila altı gün boyunca inkübe edin.

Dört ila altı gün geçtikten sonra. Her numune için plak numarasını okumak için bir mikroskop kullanın. Her seyreltme için plak sayısını kaydedin.

Ardından ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. Çok fazla veya çok az plak içeren kuyular, titreyi doğru bir şekilde hesaplamak için kullanılamaz. Bu nedenle, her numune için, içinde yedi ila 70 plak bulunan bir seyreltme kullanın.

1000 kat seyreltilmiş bu numune, oyuk başına ortalama 23 plağa sahiptir. Seyreltilmemiş çözeltideki viral titreyi hesaplamak için, seyreltme faktörünü plak sayısı ile bir mililitredeki mikrolitre sayısı ile çarpın. Daha sonra bunu kuyucuk başına eklenen seyreltilmiş süpernatant hacmine bölün.

Yani bu örnekte, 1000 çarpı 23 plak çarpı mililitrede 1000 mikrolitre bölü 2.3 çarpı 10 üzeri mililitre başına beşinci şekillendirme birimine eşittir. Daha sonra, fare embriyonik fibroblastlarında gama HV 68'in büyüme kinetiğini belirlemek için bilinen bir titreye sahip bir viral stok çözeltisi kullanılır, ORM'ler, vahşi tip mitleri ve bir konakçı gende eksik olanları kuyu başına 10.000 hücrede 24 oyuklu bir plakaya bölerek başlar. Ertesi gün, her bir kuyucuktaki ortamı 0,5 mililitre düşük MOI gama HV 68 süspansiyonu ile değiştirin.

Plakayı 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin ve inkübasyonun inkübasyon boyunca iki saat ilerlemesine izin verin. Kuluçka işleminden sonra her 30 dakikada bir plakayı sallayın. Viral süspansiyonu çıkarmak için bir pipet kullanın ve virüs ile enfekte olmuş hücrelere %8 fetal sığır serumu içeren 0,5 mililitre taze tam DM EM ekleyin.

Enfeksiyondan sonraki çeşitli günlerde hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. Orta uç hücreleri birden çok kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hasat edin. Bunları steril 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın, tüpleri hemen eksi 80 santigrat derecede dondurun, gama HV 68'i Mets'ten serbest bırakın.

Üç döngü dondurma ve çözme işlemi gerçekleştirin. Hücreleri 37 santigrat dereceye yerleştirerek çözün. Sonra girdap yapın ve eksi 80 santigrat derece dondurucuya geri koyun.

DNA veya RNA replikasyonunun konakçı genlerdeki veya viral genlerdeki eksiklikten etkilenip etkilenmediğini incelemek için daha önce gösterildiği gibi bir NIH üç, T, üç veya BHK 21 tek tabakası kullanarak bir plak tahlili ile viral titreyi belirleyin. Enfeksiyondan sonraki çeşitli günlerde enfekte mes ile başlayın, süpernatanı atın, hücreleri soğuk PBS ve tripsin buz hücreleri ile durulayın. Daha sonra, dönüşü takiben bir dakika boyunca oda sıcaklığında 1000 RCF'de santrifüjleme yoluyla hücreleri peletleyin, süpernatanı atın ve hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Konakçı ve viral kökenli olan toplam DNA ve RNA'yı çıkarın. Ardından döndürme kolonlarını santrifüjleyin. Viral litik transkriptlere özgü toplam DNA ve primer kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.

Beta aktin gibi bir konakçı temizlik genine atıfta bulunarak hücre içi gama HV 68 genomunun nispi miktarını belirleyin. CDNA'yı toplam RNA ve oligo DT primeri ile hazırlayın. Viral transkriptlerin nispi miktarını belirlemek için yukarıdaki gibi CD, NA ve primerleri kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.

Ev sahibi temizlik genine atıfta bulunarak, Mavs, burada gösterildiği gibi mitokondriyal antiviral sinyallemenin kısaltmasıdır. Mavs adaptör molekülü, proinflamatuar sitokinlerin ve interferonların gen ekspresyonunu yukarı regüle eden NF, kappa, B ve interferon düzenleyici faktörleri, IRF'leri aktive etmek için sitozolik teçhizat gözü benzeri reseptörlerden gelen sinyalleri iletir. Gama HV ile enfekte olmuş yabani tip farelerin ve Mavs eksikliği olan yavru farelerin akciğerindeki viral yükler burada gösterilmiştir.

Mavs eksikliği, enfeksiyondan 10 gün sonra akciğerdeki viral yükleri önemli ölçüde azalttı, bu da Mavs'in in vivo olarak verimli viral enfeksiyon için gerekli olduğunu gösteriyor. Bu şekil, yabani tip fare embriyonik fibroblastlarında ve Mavs'ta Mavs eksikliği eksik olanlarda viral çok aşamalı bir büyüme eğrisini göstermektedir. Fare embriyonik fibroblastlarında Mavs'in etkili viral replikasyon için gerekli olduğunu gösteren önemli ölçüde gecikmiş viral büyüme in vitro gama HV 68 enfekte fare embriyonik fibroblastlarındaki viral litik genlerin mRNA seviyeleri, Mavs'ta gerçek zamanlı PCR eksikliği ile analiz edildi, üç temel litik genin mRNA seviyelerini önemli ölçüde azalttı.

Tüm bu sonuçlar toplu olarak Mavs'in gama HV 68 transkripsiyon aktivasyonu ve litik replikasyon için gerekli olduğu sonucunu desteklemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, konak patojen etkileşimini hem VO hem de Vevo'da birden fazla düzeyde nasıl sorgulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Patojenlerle çalışmanın son derece tereddütlü olabileceğini unutmayın.

Performanslar devam ederken kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler alınmalıdır.