Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Bu prosedürün genel amacı, floresan in situ hibridizasyon ile latent enfekte farelerden trigeminal ganglion bölümlerinde tip bir olan herpes simpleks virüsünün genomunu tespit etmektir. Bu, önce virüsün hayvan dudağında aşılanması, ardından virüsün trigeminal gangliyonlarda yerleştiği 28 günlük bir kuluçka süresi ile gerçekleştirilir. Daha sonra, trigeminal gangliyonlar hasat edilir, gömülür ve kriyo kesitli hale getirilir.

Bölümler, bir sodyum sitrat tamponu içinde ısıtılmasının temel adımı da dahil olmak üzere çeşitli hazırlık işlemlerine tabi tutulur. Son olarak, floresan in situ hibridizasyon, herpes'e özgü floresan bornozlar kullanılarak gerçekleştirilir. Sonuç olarak, sonuçlar, konfokal mikroskopi kullanılarak viral genomun bireysel olarak enfekte olmuş nöronların çekirdeği içindeki konumunu gösterebilir.

Çoğu durumda, çeşitli yaşam döngüsünün incelenmesi, hayvan modellerinin kullanılmasını gerektirir. Burada temsil edilen tekniğin temel yararı, bir enstitü akıcı izasyon yaklaşımı kullanarak tek hücre düzeyinde veri sağlamasıdır. HS enfeksiyonlarının kraliyet katili modeli, insanlarda HSV'nin doğal tarihinin çoğu yönünü yeniden üretir: bir enfeksiyon.

Bu, virüsün doğal konakçısıdır. Birincil enfeksiyon ağız dokularında yapılır ve daha sonra virüs dudaklardan iki al gangliona ilerler. Bu, insanlarda HS V gecikmesinin ana tarafıdır: İki immün immün ve boyamayı birleştirdi.

Bu yöntem, virüsün nükleer bileşenlerle nasıl etkileşime girdiği ve bu etkileşimlerin gecikmenin sürdürülmesini ve nihayetinde virüsün yeniden aktivasyonunu nasıl etkileyeceği gibi herpes virüsü gecikmesi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, anestezi uygulanmış bir fareye ve bir HSV bir virüs stok çözeltisine sahip olun. Fenol kırmızısı içermeyen ortamda yeniden süspanse edilir.

Bir binoküler stereoskop kullanarak, iğneyi mukokutanöz sınırda sol üst dudağın subepitel tabakasına yerleştirin. Beş saniye boyunca 0,5 mikrolitre virüs çözeltisi enjekte edin ve ardından aynı bölgeye ikinci bir virüs enjeksiyonu yapın. Fareyi uyanana kadar 37 derecelik bir inkübatöre veya ısıtma yastığına aktarın.

Ardından, metin protokolüne göre sabitlemeden önce gerekli kurtarma süresi boyunca ev kafesine koyun. Alt çenenin her iki yanından kesin. Daha sonra burun boşluğunu ortaya çıkarmak için burun ucunu kesici dişlerin hemen arkasından kesin.

Damağı makasla ikiye bölün ve ardından yana yerleştirin. Trigeminal gangliyonlar damağın altındadır. İki ila üç milimetre uzunluğunda beyaz dikdörtgen kitlelerdir ve trigeminal sinire bağlıdırlar.

Ganglionların her iki yanındaki trigeminal sinir dallarını beyin sapından çıkarmak için kesin. Cerrahi pense kullanarak, gangliyonları çıkarın ve PBS'de% 20'ye aktarınSukroz, 24 saat boyunca inkübe etmelerine izin verin. Ertesi gün oda sıcaklığında, her iki trigeminal gangliyonu tek bir kriyoseksiyon bloğuna gömün.

Gömme ortamı, bloğu bir kriyostat üzerinde bölümlere ayrılana kadar eksi 80 santigrat derecede dondurun. Trigeminal gangliyonları uzunlamasına 10 mikronluk bölümler halinde kesin ve 30 santigrat dereceye kadar ısıtılmış süper don slaytlarında toplayın. Tek bir slayta dört ila beş bölüm sığabilir.

Slayta birden çok seri etiketi vermek yararlı olabilir. Birkaç aşağı akış uygulaması planlanıyorsa, dilimleri eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin. Bu protokol için prob, HSV bir genomunun 30 kilobaz kısımlarını içeren kozmosların NIC translasyonu ile SI 3D CTP ile etiketlenmesiyle hazırlanır.

Deiyonize formda amid içinde çökeltilir ve süspanse edilir ve birinci gün S SI üç katılımı nedeniyle pembe görünmelidir. Slaytları oda sıcaklığında bir sürgü tutucuya yerleştirin ve bölümlerin 10 dakika kurumasını bekleyin. Ardından bölümleri 10 dakika boyunca tek bir XPBS'de yeniden sulandırın.

Daha sonra, dokuyu 20 dakika boyunca bir XPBS'de% 0.5 Triton X 100 içinde geçirgen. Ardından, slaytları iki XSS ile yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve maskeleme tamponu ısınana kadar iki XSSC'de tutun. Maskeyi çıkarmak için, sitrat tamponunu kaynayana kadar bir mikrodalgada önceden ısıtın.

Bu, bir cam slayt tepsisini 200 mililitre tamponla doldurarak yapılır. Tepsiyi 500 mililitre damıtılmış su ile doldurulmuş daha büyük bir kaba koyun ve tamponu kaynayana kadar önceden ısıtın. Ardından slaytları tepsiye aktarın.

Mikrodalgada tamamen tamponla kaplandıklarını doğrulayın. Tampon kaynama noktasına gelene kadar slaytları tamponda yaklaşık 20 saniye ısıtın. Tamponun kaynamasına izin vermeyin.

Ardından slaytları oda sıcaklığında iki dakika soğutun ve ısıtma döngüsünü altı kez daha tekrarlayın. Maskeleme adımının tekrarlanabilirliği için yeme döngülerinin sayısını ve süresini ampirik olarak belirlemek çok önemlidir. Mikrodalga fırın, tepsi, kap, tepsideki tampon hacmi.

Isıtma bittiğinde kaptaki su hacmi aynı tutulmalıdır. Slaytları bir davlumbaz altında beş dakika boyunca iki XSSC'ye aktarın, slaytları üç ila bir ila dört metanol, asetik asit ve PBS çözeltisinde 15 dakika inkübe edin. Daha sonra slaytları taze hazırlanmış üç ila bir metanol içinde 15 dakika boyunca asetik asit karışımına inkübe edin.

Şimdi% 70 etanolde art arda 10 dakikalık inkübasyonlar yoluyla bölümleri kurutun, ardından saf etanolde iki adet 10 dakikalık inkübasyon yapın. Slaytları proba hazırlamak için oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya bırakın. Kurumuş bölümlere damla damla 80 mikrolitre prob solüsyonu uygulayın ve üzerlerini bir kapak fişi ile örtün.

Problama solüsyonunun kapak kızağının tüm yüzeyine yayıldığını ve kabarcık olmadığını kontrol edin. Ardından kapak kızağını kauçuk çimento ile kapatın ve kurumasını bekleyin. Slaytları beş dakika boyunca 80 santigrat derecede inkübe ederek denatürasyona devam edin.

Ardından slaytları beş dakika boyunca buz üzerinde metal bir tepsiye hızlı bir şekilde aktarın. Bunu, ertesi gün 37 santigrat derecede bir gece hibridizasyon ile takip edin. 37 santigrat derece ısı bloğu üzerindeki kızaklarla kauçuk çimentoyu forseps ile çıkarın.

Kapak kızağını bir neşter bıçağının ucuyla nazikçe çıkarın. Ardından, bölümleri SSC ile tekrar tekrar yıkayın. Şimdi, numuneleri bir XPBS'de mililitre başına 0,5 mikrogramda DAPI veya kanca 3 3 4 4 2 gibi uygun boya ile 10 dakika boyunca boyayın.

Ardından, slaytları yıkama başına 10 dakika boyunca bir XPBS ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, slayttan mümkün olduğunca fazla sıvıyı boşaltın. Daha sonra her slaydın sonunda, solma önleyici bir madde ile 80 mikrolitre montaj ortamı uygulayın.

Kabarcık oluşumunu önleyerek ortamı yüksek optik kaliteli bir kapak kaymasıyla yavaşça örtün. Ardından slaytı oje ile kapatın ve karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Bu protokolü geliştirirken, maskeyi çıkarmak için birkaç tuz tamponu test edildi.

EDTA tamponları dokuya zarar verme eğilimindeydi. Sodyum sitrat tris, HCL ve damıtılmış su, protokolün ticari problarla çalışacağını doğrulamak için HSV bir tespitine uygundu. HSV bir gizli genom tespiti, Enzo Biochem'den elde edilen bir PAN HSV bir biyotinile prob kullanılarak gerçekleştirildi, HSV için hem tekli hem de çoklu spot paternleri bir genom tespit edilebildi.

Ayrıca, DNA balık protokolü, yaygın olarak kullanılan üç HSV bir suşu ile enfekte olmuş fareler ve tavşanlar üzerinde test edildi. Tüm vakalarda, HSV bir genomu değişken parlaklık ve yoğunluğa sahip sivilceli bir sinyal gösterdi. Ek olarak, protokolün uygulanabilirliği, genel bir herpes enfeksiyonu geçiren farelerden alınan dokular üzerinde DNA balığı gerçekleştirilerek HSV'nin replikatif döngüsünde test edildi.

Bu hayvanlarda, DRG gözleri ve beyin de dahil olmak üzere çeşitli dokularda HSV bir genomunun büyük ve parlak agregatları tespit edildi. DNA balık protokolü çok yönlüdür. HSV, bir genom ve viral veya hücresel RNA'ların ve proteinlerin birlikte saptanmasına izin verir.

Örneğin, HSV bir genomunun HSV bir lat RNA ile birlikte birlikte saptanması, HSV bir genomunun Centro MERIC proteini CE NPA A gibi hücresel proteinlerle birlikte saptanması mümkündür, HSV bir genomun kromatin ve PML nükleer cisimleri ile birlikte tespiti kullanılmıştır. İlişkili protein A TRX, kırmızı renkte HSV 1D NA'yı gösteren üçlü bir boya ile görüntülendi. RNA ürünü mavi renkte lat ve yeşil renkte bir TRX.

Maskeyi çıkarma ayarlandıktan sonra, DNA balık prosedürü çok sağlamdır. 20 slayt veya daha fazla gruplar halinde 24 saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, herpes virüslerini ve diğer kalıcı virüsleri araştıran araştırmacıların, hücresel bileşenlerin ve nükleer mimarinin bu virüslerin biyolojisini nasıl etkileyebileceğini tek hücre düzeyinde keşfetmelerini sağlayacaktır.