Name: Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Öğrenin, trigeminal ganglionlarda herpes simpleks virüs tip bir genomunu floresan in situ hibridizasyon ile tespit etme yöntemini. Bu teknik, latente enfekte farelerde viral genom ve RNA ürünlerini görselleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz HSV-1 numune sağlamak için N. Sawtell (Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi, Cincinnati, Ohio, ABD), S. Efstathiou&#39;dan (Cambridge Üniversitesi, Birleşik Krallık) ve James Hill, (LSU Sağlık Bilimleri Merkezi, New Orleans, ABD) teşekkür ederim sırasıyla, fare ve tavşan-enfekte ve reaktifler için, yararlı tartışmalar için H. Masumoto (Kazusa DNA Araştırma Enstitüsü, Chiba, Japonya) ve S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Fransa). Bu çalışma (PL, http://www.cnrs.fr için ATIP programı) Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) hibe, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) (ANR-05-Miim-tarafından finanse edildi 008-01, CENTROLAT, <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a> ), FINOVI Vakfı ( <a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a> ), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) Université de Lyon, program dahilinde &quot;Investissements d&#39;Avenir &quot;(ANR-11-IDEX-0007) ANR tarafından işletilen ( <a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a> ), l&#39;Association la Recherche contre le Yengeç (ARC-7979 ve ARC-dökün 4910, <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a> ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a> ) ve İnka (EPIPRO programı, <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e -cancer.fr</a> ). FC ve PL CNRS araştırmacılar vardır.

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Burada açıklanan protokol Fare nöronal doku bölümlerinin nöronlar içinde HSV-1 genomu latent algılanmasını sağlar. Viral gen ekspresyonunu düzenleyen yollarının anladığımız nöronal dokular içinde in situ HSV-1 genomik DNA tespit etmek için bir yöntem eksikliği ile sınırlanmıştır. Genom kopya sayısı ve enfekte nöronların oranına ilişkin bilgiler ayrışmış nöronlar 11,12 PCR analiz ağırlıklı geldi. HSV-1 gecikme üzerindeki rolü teklif konak hücre nükleer mimarisi durulaştırmada, biz latent enfekte farel...

<html> Herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1) çoğaltmak ve yaymak için periyodik olarak yeniden etkinleştirir hangi periferal sinir sistemi, trigeminal ganglionların (TG) nöronlarda uzun vadeli bir latent enfeksiyon oluşturarak, kalıcı bir insan nörotropik virüsüdür. HSV-1 genomu bu konak hücre genomu içine entegre 1,2 yok gibi çok kopyalı chromatinized plazmidler kalır, ana nöronun çekirdeğine bir 150 kb dsDNA saptanması. Gecikme sırasında, HSV-1 replikatif döngü programı genetik kuvvetle bastırılır ve gen ekspresyonu gecikme kurulması yeniden aktive 3 başlaması için gecikme ile ilişkili transkripti (LAT) locus, sınırlandırılmıştır. LAT bir büyük 2 kb istikrarlı kement içine işlenmiş uzun 8.5 kb noncoding RNA ve birkaç miRNA 4-7 arası üretir. HSV-1 gecikme dolayısıyla viral genomik DNA, RNA LAT ve tespit replikatif döngüsü proteinlerinin yokluğunda varlığı ile karakterize edilir. &quot;ontent&gt; Hayvan modelleri, ağırlıklı olarak fare ve tavşan, insan gecikme çeşitli özellikleri yansıtan deneysel modellerdir. bu modellerin ana çıkarları biri de imünokompetan konaklarda HSV-1 gecikme fizyolojik yönlerini okuyan sağlamasıdır. Geçtiğimiz on yıl içinde , bu tür genetik olarak değiştirilmiş virüsler ve fareler gibi pek çok deneysel araçları, fizyoloji, genetik ve hayvan dokularından HSV-1 gecikme, hücresel biyolojisi incelemek için geliştirilmiştir. Şimdiye kadar, viral genomik DNA miktarı tespit edilir ve Southern lekeleme yolu ile ve daha ayrışmış-ra ikinci QPCR. Ancak, şu anda doku bölümleri 8. Sonuç olarak, gecikme rutin olarak in situ olarak melezleşme ile RNA LAT RNA&#39;nın saptanması yerine yoluyla histolojik bölümler üzerinde değerlendirilir in situ olarak melezleşme ile HSV-1 genomu tespit etmek için uygun bir yöntem yoktur viral genom tespiti. viral genomların varlığında thi göre, enfekte olmuş hücrelere karakterize etmek mümkün olmuştur çünküs teknik sınırlama bu tür viral genom, hücresel ve viral gen ekspresyonu ya da konakçı hücre-aracılı bağışıklık karşılığının 9,10 arasındaki ilişki olarak ana bilgisayar virüs etkileşimleri, birçok açıdan analizlerine büyük bir dezavantaj olmuştur. En önemlisi, gizli enfeksiyon, hücre-hücre heterojenlik nispeten keşfedilmemiş kalır ve SCID farelerde ve 11-17 farelere implante insan duyu ganglion nöronlarında gecikme önemli bir özelliği olduğu gösterilmiştir. Tipik olarak, bu hücre başına HSV-1 genomu kopya sayısının 5 ila birkaç yüz değişir qPCR gösterilmiştir. LAT gecikme ve reaktivasyonu önemli bir düzenleyici olarak görünse de, izole nöronların ve yerinde PCR QPCR veri latent enfekte nöronların sadece bir alt kümesi, 30 gibi düşük%, LAT lokusunu 11,12,18-21 ifade ettiğini belirtti. Ne konakçı hücre ve virüs gecikme kurulması ile ilgili doku etkisinin içindeki hücre ortamı veviral gen ekspresyonu açık değildir. Burada hayvan nöronal doku bölümleri içinde düşük kopya HSV-1 genomik DNA&#39;nın saptanması için etkin bir in situ hibridizasyon (FISH) yöntemi, güçlü bir floresan tarif eder. Bu yöntem, tasarlanmış ve konakçı hücre içi nükleer bileşenleri 22 ile viral genomun etkileşimini incelemek için gerekli olan yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntüleme erişmek için tarafımızdan kullanılmıştır. Ayrıca, viral gen ekspresyonunu düzenleyen virüs-host etkileşimleri için eşsiz bir araçtır RNA ve proteinler ile viral DNA, eş zamanlı olarak saptanması için bir çok boyama yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, aynı zamanda, bölme sayıda enfekte nöronlar miktarının gibi HSV-1 genomu latent saptanmasını gerektiren analizlerin geniş bir aralığı için uygulanabilir. Bir anahtar bir adım hibridizasyona viral DNA erişilebilir yapmak için antijen alımı tedavi uygulamaktır. Böylece, bu protokol, aynı zamanda saptanması için etkili olabilir,hayvansal dokular içinde geleneksel DNA FISH yaklaşımlarla anda algılanamaz diğer dsDNA virüslerin.

<table><tbody><tr><td>Balb/c fareleri</td><td>Janvier, Fransa</td><td></td><td>6 haftalık dişiler</td></tr><tr><td>HSV-1</td><td>suşları SC16 suşu (vahşi tip)Bkz</td><td></td><td>. Labetoule, M. et al. Invest. Oftalmol. Sci 44, 217&ndash; 225 (2003) HSV-1 suşu ve virüs stoğu hazırlama ile ilgili ayrıntılar için.</td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>K2753</td><td>Ketamin (100 mg / kg) ve Ksilazin (10 mg / kg) içeren bir çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu</td></tr> <tr><td>Silazin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>158127</td><td>90 ml suda 4 g PFA'yı askıya alın. 50 & mikro ekleyin; l 1N NaOH ve 60 ° C'de ısı; Çalkalama ile bir su banyosunda C. PFA yaklaşık 30 dakika içinde çözünür. 10 ml 10x PBS ekleyin. Bu çözelti önceden hazırlanabilir ve -20 ° C'de saklanabilir; 5 ml'lik tüplerde C. Dikkat. Çeker ocak altında manipüle edin.</td></tr><tr><td>Fizyolojik</td><td>Salin Sigma</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7.4 (steril)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td>1x PBS'de% 20'lik bir sükroz çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>Kriyoseksiyon gömme ortamı - Tissue-Tek OCT Bileşiği</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Büyük vektör DNA saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>HSV-1 genomu içeren Cosmid veya BAC vektörünü saflaştırmak ve -20 °C'de saklamak için; C</td></tr><tr><td>Nick çeviri kiti</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>10 976 776 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GE Sağlık</td><td>PA53021</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>G50 Mini döndürme sütunu</td><td>GE Sağlık</td><td>27-5330-01&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Somon sperm DNA'sı 10 mg / ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Sigma</td><td>87047</td><td>% 70'lik bir çözelti hazırlayın</td></tr><tr><td>Somon sperm DNA'sı</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Formamid Moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>Dikkat. Çeker ocak altında manipüle edin.</td></tr><tr><td>HSV-1 biyotinile ticari prob&nbsp;</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ENZ-40838</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmEdge hidrofobik kalem</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>20x Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>ddH20'da 2x SSC çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Suda %10'luk bir stok çözeltisi hazırlayın ve +4 ° C'de saklayın. %0,5'lik çözeltiyi kullanmadan hemen önce 1x PBS'de hazırlayın.</td></tr><tr><td>10 mM Sodyum sitrat pH 6.0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>100 mM'lik bir stok çözeltisi (10x) hazırlayın. 10.5 g sitrik asit (MW 210.14) ağırlığında. Dikkat, tahriş edici ve toksik, uygun maske ve eldiven kullanın) ve 400 ml suda çözün. 1 N NaOH ile pH'ı 6.0'da ayarlayın (dikkat, tahriş edici, eldiven giyin). Damıtılmış su ile 500 ml'ye ayarlayın. Kullanmadan önce 10 kez damıtılmış suyla seyreltin.</td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dekstran sülfat - MW 500.000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Denhardt çözümü (100x)</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kauçuk Çimento "FixoGum"</td><td>Marabut</td><td>290110000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA saflaştırma kiti & nbsp; - Qiaquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td> <td>&</td></tr><tr><td>T7 in vitro transkripsiyon kiti</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>11388908910</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA saflaştırma mini sütunu</td><td>Qiagen</td><td>73404</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ribonükleozit Vanadil Kompleksi</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>Damıtılmış suda% 3'lük bir çözelti hazırlayın. +4 & derece'de saklayın; C ve ışıktan koruyun.</td></tr><tr><td>Maya tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>RNAse içermeyen suda 10 mg/ml'lik bir çözelti hazırlar</td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>İnvitrojen</td><td>PCN5000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Primer antikorlar</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td>Sonuç bölümünde aşağıdaki primer antikorlar kullanılmıştır: anti-fare CENP-A (tavşan mAb C51A7, Hücre Sinyalleme Teknolojileri) ve anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biyoteknolojisi)</td></tr><tr><td>İkincil floresan antikorlar</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td>Protokolümüzde rutin olarak kullanılan floresan sekonder antikorlar Alexa Fluor işaretli keçi antikorlarıdır (IgG H+L). Sonuç bölümünde kullanılan antikor, Alexa Fluor 488 (referans A11001)</td></tr> <tr><td>Tyramide Signal Amplification (TSA) kiti - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (mavi floresan)</td> <td>Invitrogen Life Technologies</td> ile hazırlanmış bir anti-tavşan keçisi antikorudur<td>#T20937</td><td>TSA kitleri ayrıca Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification (TSA) kiti - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (yeşil floresan)</td><td>Invitrogen Life Technologies'den</td> de temin edilebilir<td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Yaşam Teknolojileri</td><td>H3570</td><td>0.5 & mikro hazırlayın; Kullanmadan hemen önce 1x PBS'de g / ml çözeltisi. Kalan çözümü atın.</td></tr><tr><td>22 mm x 50 mm lamel . n & deg; 1.5 cam</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72204-04&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Solmayı önleyici madde içeren montaj ortamı - VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Diğer bir konvansiyonel ürün, Elektron Mikroskobu Bilimi Superfrost cam slaytlarından Fluoromount G'dir</td></tr><tr><td></td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ekipman/Malzeme</td><td>Şirket</td><td>Referans Notu</td><td></td></tr><tr><td>Enfeksiyon</td><td></td><td></td> iğnesi <td>Cam mikropipet sıcak çekilmiş. Özel yapım.</td></tr><tr><td>Diseksiyon ekipmanları</td><td>Moria, Fransa</td><td></td><td>Mikrocerrahi makas ve forseps</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Cole Palmer Instruments</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>Mikroşırınga pompa cihazı (Nano Pompa)</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica Fransa</td><td>CM 1510-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>-80 derece ve derece; C dondurucu</td><td>Sanyo</td><td></td><td>Ultra Düşük -80 derece; C</td></tr><tr><td>Ev tipi mikrodalga fırın</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kuru blok ısıtıcı</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kuluçka Makinesi, Slayt hendeği,</td><td>Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Coplin Kavanoz</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68512</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vitray kap</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Sonuç bölümünde sunulan görüntüler, objektif 40X LD NeoFluor N.A 0.6 ve 100X PlanApochromat N.A 1.3 olan bir Zeiss AxioObserver ile toplandı. Filtre seti #38, #43 ve #43. HXP 120 floresan ışık kaynağı. Fotometri CoolSNAP HQ2 CCD kamera. Sinyal, Zeiss AxioImager/AxioObserver serisi, Nikon Ti-E/Ni-E serisi veya Leica DM/DMI6000 serisi gibi yeni bir yüksek verimli mikroskopta daha kolay gözlemlenecektir</td></tr></tbody></table>

floresan nöronal dokularda kalıcı dna virüs genomu ve transkriptlerinin algılama in situ melezleme immün ile birlikte

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Bir genin tek hücre codetection, kendi ürün ve hücresel RNA, düzenleyici proteinler gen ekspresyonu düzenleme çalışma için çok önemlidir. Bu, viroloji alanında bir sorundur, özellikle de bir nükleer kopyalayan bir kalıcı DNA virüs kendi çalışma için hayvan modellerini içerir ki. Herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1), çevresel nöronlarda bir ömür boyu latent enfeksiyon oluşturur. Latent virüsü reactivates ve yeni herpetik bölüm neden olan rezervuar olarak hizmet vermektedir. HSV-1 gecikme hücre biyolojisi, hayvan modellerinde in situ HSV-1 genomu tespit yöntemlerinin eksikliği, kısmen, az anlaşılmaktadır. Biz yaklaşımın verimli enfekte hayvan modellerinde nöronal dokularda kesimleri içinde düşük kopya viral genomları tespit situ hibridizasyon (FISH) bir DNA-floresan açıklar. Bu yöntem ısıya dayalı antijeninin ortaya çıkartılması dayanır ve direkt etiketlenmiş ev yapımı DNA probları ya da ticari olarak temin edilebilir sondalar. Biz üçlü stai geliştirdining yaklaşım, her boyama gereksinimi karşılamak için peroksidaz tabanlı sinyal amplifikasyonu kullanarak, RNA-FISH ve immünfloresansta ile DNA-FISH birleştirerek. Önemli bir gelişme konfokal mikroskopi ve geniş alan geleneksel epifluoresan yüksek çözünürlükte görüntülenebilir 10 um doku bölümleri, düşük arka plan sinyalleri içinde, elde etme yeteneğidir. Buna ek olarak, üç boyama, hücresel ve viral proteinlere karşı yönelik bir antikor yelpazesi ile çalışmıştır. Tüm protokol, doku içinde antikor ve prob girmesinin karşılamak için 2.5 gün sürer.

Kapsamlı test birkaç ay sonra, ısı bazlı kimyasal maskesinin floresan in situ hibridizasyon için latent HSV-1 genomu hazır olduğunu keşfetti. Bu işlem sırasında, çeşitli prosedürler maskesinin denenmiş ve sadece ısıya dayalı tedaviler (örneğin bir mikrodalga fırın içinde alt kaynama sıcaklığına kadar ısıtılması bölümleri) etkili ortaya çıktı. Biz sonra rutin 0.01 M pH 6.0 sitrat tamponu (hepimizin çalışmalarda kullanılan), 1x PBS, 1 mM EDTA, 0.1 M dahil epitoplann 31,32, almak için immünohis...

Bu hayvan modellerinin doku bölümleri içinde kalıcı bir DNA virüsü genomunun saptanması için in situ hibridizasyon protokolünde bir floresan kurulmuştur. Bu protokol, viral genomun codetection, kendi RNA ürünleri ve tek bir hücre içinde viral veya hücresel proteinleri tarafından enfeksiyon süreci üzerinde çalışırken sağlar.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Bu prosedürün genel amacı, latent enfekte farelerin trigeminal ganglion kesitlerinde, floresan in situ hibridizasyon yöntemiyle tip 1 herpes simplex virüsü genomunu saptamaktır. Bu işlem, öncelikle virüsün hayvan dudağına inoküle edilmesi ve ardından virüsün trigeminal ganglionlarda yerleştiği 28 günlük bir inkübasyon süresinin ardından gerçekleştirilir. Sonrasında, trigeminal ganglionlar toplanır, gömülür ve kriyoseksiyonları hazırlanır.Kesitler, sodyum sitrat tamponunda ısıtma şeklindeki temel adım da dahil olmak üzere, çeşitli hazırlık işlemlerine tabi tutulur. Son olarak, herpes spesifik floresan problar kullanılarak floresan in situ hibridizasyon gerçekleştirilir. Nihayetinde sonuçlar, konfokal mikroskopi kullanımıyla, tek tek enfekte olmuş nöronların çekirdeği içindeki viral genomun konumunu gösterebilir.Birçok durumda, çeşitli yaşam döngülerinin incelenmesi hayvan modellerinin kullanımını gerektirir. Burada sunulan tekniğin temel avantajı, in situ hibridizasyon yaklaşımını kullanarak tek hücre düzeyinde veri sağlamasıdır. HS enfeksiyonlarının tavşan modeli, HSV-1 enfeksiyonunun insanlardaki doğal seyriyle ilgili çoğu yönü yeniden üretir.Bu, virüsün doğal konakçısıdır. Birinc

detection-genome-transcripts-persistent-dna-virus-neuronal-tissues

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Bu videoda, MCPyV viryonları ile enfekte olmuş hücreler, MCPyV'ye özgü genomları tespit etmek için in situ hibridizasyon zincir reaksiyonuna tabi tutuldu. Ayrıca, DNA-HCR tekniği, enfekte insan derisi hücrelerinde MCPyV DNA'sını görselleştirmek için FISH ile birleştirildi.

HCR-DNA FISH: Enfekte Hücrelerde Viral DNA'yı Tespit Etmek için Bir Floresan In Situ Hibridizasyon Tekniği

Kaynak: Vallery, T. K. &amp; Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, virüsle enfekte olmuş hücrelerde viral RNA'yı görselleştirmek için floresan in situ hibridizasyon yöntemini göstermektedir. Prob hibridizasyonu, sinyal amplifikasyonu ve konfokal görüntüleme süreçlerinde yer alan adımları ana hatlarıyla açıklamaktadır.

Floresan İn Situ Hibridizasyonu ile Konak Hücrelerde Viral RNA Dağılımının Belirlenmesi

Kaynak: Baleriola, J., et. al., Yüksek Çözünürlüklü In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Beyin Bölümlerinde Aksonal Lokalize mRNA'ların Tespiti.  J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, floresan in situ hibridizasyon ve antikor boyama kullanılarak sabit fare hipokampal dilimlerinde kolinerjik aksonlar içinde mRNA'nın tespitini göstermektedir. Floresan mikroskobu, kolinerjik nöronlarda prob etiketli mRNA'ların ve kolin asetiltransferazın mekansal lokalizasyonunu ortaya çıkarır.

Floresan In Situ Hibridizasyonun Ardından Fare Beyin Dilimlerinde Nöronların İmmün Boyanması

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

Biz situ hibridizasyon floresan kullanan bir protokol tarif (FISH) lytically enfekte insan hücrelerinin içinde birden fazla herpesviral RNA görselleştirmek için, süspansiyon veya yapışık. Bu protokol, nükleositoplazmik oran üreten floresan ların niceliğini içerir ve konak ve viral proteinlerin immünoresans (IF) ile eşzamanlı olarak görüntülenmesi için uzatılabilir.

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Öğrenin, trigeminal ganglionlarda herpes simpleks virüs tip bir genomunu floresan in situ hibridizasyon ile tespit etme yöntemini. Bu teknik, latente enfekte farelerde viral genom ve RNA ürünlerini görselleştirir.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Daha fazla video keşfet