Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Bu prosedürün genel amacı, latent enfekte farelerin trigeminal ganglion kesitlerinde, floresan in situ hibridizasyon yöntemiyle tip 1 herpes simplex virüsü genomunu saptamaktır. Bu işlem, öncelikle virüsün hayvan dudağına inoküle edilmesi ve ardından virüsün trigeminal ganglionlarda yerleştiği 28 günlük bir inkübasyon süresinin ardından gerçekleştirilir. Sonrasında, trigeminal ganglionlar toplanır, gömülür ve kriyoseksiyonları hazırlanır.

Kesitler, sodyum sitrat tamponunda ısıtma şeklindeki temel adım da dahil olmak üzere, çeşitli hazırlık işlemlerine tabi tutulur. Son olarak, herpes spesifik floresan problar kullanılarak floresan in situ hibridizasyon gerçekleştirilir. Nihayetinde sonuçlar, konfokal mikroskopi kullanımıyla, tek tek enfekte olmuş nöronların çekirdeği içindeki viral genomun konumunu gösterebilir.

Birçok durumda, çeşitli yaşam döngülerinin incelenmesi hayvan modellerinin kullanımını gerektirir. Burada sunulan tekniğin temel avantajı, in situ hibridizasyon yaklaşımını kullanarak tek hücre düzeyinde veri sağlamasıdır. HS enfeksiyonlarının tavşan modeli, HSV-1 enfeksiyonunun insanlardaki doğal seyriyle ilgili çoğu yönü yeniden üretir.

Bu, virüsün doğal konakçısıdır. Birincil enfeksiyon ağız dokularında oluşur ve ardından virüs dudaklardan iki al ganglionuna ilerler. Burası, insanlarda HSV latansının ana bölgesidir. İki immünostaining yöntemi birleştirilmiştir.

Bu yöntem, virüsün nükleer bileşenlerle nasıl etkileşime girdiği ve bu etkileşimlerin latansın sürdürülmesini ve nihayetinde virüsün reaktivasyonunu nasıl etkileyeceği gibi herpes virüsü latansına ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, anestezi uygulanmış bir fare ve fenol kırmızısı içermeyen ortamda yeniden süspanse edilmiş bir HSV-1 virüs stok çözeltisi hazırlayın.

Binoküler bir stereoskop kullanarak, iğneyi sol üst dudağın mukokütan sınırındaki subepitelyal tabakaya yerleştirin. Beş saniye boyunca 0,5 µL virüs çözeltisi enjekte edin ve ardından aynı bölgeye ikinci bir virüs enjeksiyonu yapın. Fare, uyanana kadar 37 °C'lik bir inkübatöre veya ısıtma pedine aktarın.

Ardından, metin protokolüne uygun olarak perfüzyonla tespit etmeden önce, gereken recovery süresi boyunca hayvanı kendi kafesine yerleştirin. Alt çenenin her iki yanından kesin. Daha sonra, burun boşluğunu açığa çıkarmak için burnun ucunu, kesici dişlerin hemen arkasından kesin.

Damak kısmı makasla ortadan ikiye kesin ve ardından kenara ayırın. Trigeminal ganglionlar damağın altındadır. Bunlar, iki ila üç milimetre uzunluğunda, beyaz, oval kütlelerdir ve trigeminal sinire bağlıdırlar.

Ganglionların her iki tarafındaki trigeminal sinir dallarını, onları beyin sapından ayırmak için kesin. Cerrahi pensler kullanarak ganglionları çıkarın ve 20%Sucrose içeren PBS'ye aktararak 24 saat boyunca inkübe olmalarına izin verin. Ertesi gün oda sıcaklığında, her iki trigeminal ganglionu tek bir kriyoseksiyon bloğuna gömün.

Gömme ortamıyla birlikte bloğu, kriyostat üzerinde kesilene kadar -80 °C'de dondurun. Trigeminal ganglionları boylamasına 10 µm kalınlığında kesitler halinde kesin ve bunları 30 °C'ye ısıtılmış super frost lamlar üzerine toplayın. Tek bir lama dört ila beş kesit sığdırılabilir.

Slayta birden fazla seri etiketi vermek faydalı olabilir. Eğer birden fazla alt uygulama planlanıyorsa, kesitleri -80 °C'de saklamadan önce beş ila 10 dakika boyunca kurumaya bırakın. Bu protokol için prob, HSV 1 genomunun 30 kilobazlık kısımlarını içeren cosm'ların NIC translasyonu ile SI 3D CTP kullanılarak etiketlenmesiyle hazırlanır.

Çöktürülüp deiyonize formamid içinde süspansiyon haline getirilir ve birinci gündeki S SI three inkorporasyonu nedeniyle pembe görünmelidir. Lamları oda sıcaklığında bir lam tutucuya yerleştirin ve kesitlerin 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Ardından kesitleri 1X PBS içinde 10 dakika boyunca rehidrate edin.

Ardından, dokuyu 1X PBS içindeki %0,5 Triton X 100 ile 20 dakika boyunca permeabilize edin. Daha sonra slaytları 2X SSC ile yıkama başına 10 dakika olacak şekilde üç kez yıkayın ve maskeleme kaldırma tamponu ısınana kadar 2X SSC'de bekletin. Maskeleme kaldırma işlemi için sitrat tamponunu, tampon kaynayana kadar mikrodalga fırında önceden ısıtın.

Bu işlem, bir cam lam tepsisinin 200 mililitre tampon çözelti ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. Tepsiyi, 500 mililitre distile su ile doldurulmuş daha büyük bir kabın içine yerleştirin ve tampon çözeltiyi kaynayana kadar önceden ısıtın. Ardından lamları tepsiye aktarın.

Mikrodalgada tamamen tampon çözelti ile kaplandıklarından emin olun. Slaytları, tampon çözelti kaynama noktasına gelene kadar yaklaşık 20 saniye boyunca tampon içinde ısıtın. Tampon çözeltinin taşmasına izin vermeyin.

Ardından lamları oda sıcaklığında iki dakika boyunca soğutun ve ısıtma döngüsünü altı kez daha tekrarlayın. Maske kaldırma adımının tekrarlanabilirliği için ısıtma döngülerinin sayısı ve süresinin ampirik olarak belirlenmesi kritiktir. Mikrodalga fırın, tepsi, kap ve tepsideki tampon hacmi.

Isıtma işlemi tamamlandığında, kaptaki su hacmi aynı tutulmalıdır. Slaytları çeker ocak altında beş dakika boyunca iki XSSC içerisinde bekletin, ardından slaytları 15 dakika boyunca metanol, asetik asit ve PBS'den oluşan üç ila bir ila dört oranındaki çözeltide inkübe edin. Daha sonra slaytları, yeni hazırlanmış üç ila bir oranındaki metanol ve asetik asit karışımında 15 dakika boyunca inkübe edin.

Şimdi kesitleri sırasıyla 70% ethanol içinde 10 dakikalık inkübasyonlarla dehidrate edin, ardından saf ethanol içinde iki kez 10 dakikalık inkübasyonlar gerçekleştirin. Lamları, proba hazırlamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kurumaya bırakın. Kurutulmuş kesitlere 80 µL prob çözeltisini damla damla uygulayın ve üzerlerini bir lam kapatıcı ile kapatın.

Prob çözeltisinin lamel yüzeyine tamamen yayıldığından ve hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Ardından lameli kauçuk yapıştırıcı ile mühürleyin ve kurumasını bekleyin. Lamları beş dakika boyunca 80 °C'de inkube ederek denatürasyon işlemine geçin.

Ardından lamları hızlıca buz üzerindeki metal bir tepsiye aktarıp beş dakika bekletin. Bunu, ertesi gün 37 °C'de gece boyu sürecek bir hibridizasyon ile takip edin. Lamlar 37 °C'lik bir ısıtma bloğu üzerindeyken kauçuk çimentoyu pensle çıkarın.

Lamelleri bir bistüri ucunu kullanarak nazikçe kaldırın. Ardından, kesitleri SSC ile defalarca yıkayın. Şimdi, örnekleri 1X PBS içinde 0.5 micrograms per milliliter konsantrasyondaki DAPI veya HOECHST 33342 gibi uygun bir boya ile 10 dakika boyunca boyayın.

Ardından lamları, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde üç kez XPBS ile yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, lam üzerindeki sıvıyı mümkün olduğunca süzün. Daha sonra her lamın ucuna, solma önleyici madde içeren 80 microliters kapatma medyumu uygulayın.

Kabarcık oluşumunu önleyerek, ortamı yüksek optik kalitede bir lamel ile yavaşça kapatın. Ardından lamı oje ile mühürleyin ve dört derece Celsius'ta karanlıkta saklayın. Bu protokol geliştirilirken, maskeleme giderme işlemi için çeşitli tuz tamponları test edilmiştir.

EDTA tamponları dokuya zarar verme eğilimindeyken; sodyum sitrat tris, HCl ve distile su, protokolün ticari problarla çalışacağını doğrulamak amacıyla HSV 1 tespitinde uygun bulunmuştur. HSV 1 latent genom tespiti, Enzo Biochem'den temin edilen bir PAN HSV 1 biyotinillenmiş prob kullanılarak gerçekleştirilmiştir; HSV 1 genomu için hem tekli hem de çoklu nokta paternleri tespit edilebilmiştir.

Ayrıca, DNA fish protokolü, yaygın olarak kullanılan üç HSV 1 suşu ile enfekte edilmiş fareler ve tavşanlar üzerinde test edilmiştir. Tüm durumlarda, HSV 1 genomları değişken parlaklık ve yoğunlukta benekli bir sinyal göstermiştir. Ek olarak, protokolün uygulanabilirliği, genel herpes enfeksiyonu geçiren farelerden alınan dokularda DNA fish gerçekleştirilerek HSV 1'in replikatif döngüsünde test edilmiştir.

Bu hayvanlarda, DRG, gözler ve beyin dahil olmak üzere çeşitli dokularda, HSV 1 genomlarının büyük ve parlak agregatları saptandı. DNA FISH protokolü oldukça çok yönlüdür. HSV 1 genomu ile viral veya hücresel RNA'ların ve proteinlerin eş zamanlı olarak saptanmasına olanak tanır.

Örneğin, HSV 1 genomu ile HSV 1 lat RNA'sının birlikte saptanması mümkündür; HSV 1 genomunun Centro MERIC protein CE NPA A gibi hücresel proteinlerle birlikte saptanması gerçekleştirilmiştir. HSV 1'in kromatin ve PML nükleer yapılarıyla birlikte saptanması sağlanmıştır. İlişkili protein A TRX, HSV 1D NA'nın kırmızı, RNA ürünü lat'ın mavi ve A TRX'in yeşil olduğu üçlü boyama ile görselleştirilmiştir.

Maskeleme çözme işlemi kurulduktan sonra, DNA fish prosedürü oldukça güvenilirdir. 20 veya daha fazla slaytlık gruplar halinde 24 saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, herpes virüsleri ve diğer kalıcı virüsleri araştıran araştırmacıların, hücresel bileşenlerin ve nükleer mimarinin bu virüslerin biyolojisini tek hücre düzeyinde nasıl etkileyebileceğini keşfetmelerine olanak sağlayacaktır.