Name: 10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Öğrenin, Illumina mRNA-Seq kütüphaneleri hazırlama yöntemini sadece 10 nanogram toplam RNA kullanarak. T7 lineer amplifikasyon ile gen ifadesi analizi yapın ve sınırlı hücre popülasyonlarından güvenilir sonuçlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Wisconsin Vakfı Araştırma ve Üniversitesi Morgridge Enstitüsü fon tarafından desteklenmiştir. Krista Eastman editoryal yardımlarından dolayı teşekkür ederiz.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Yazarlar JAT Hücresel Dynamics International (CDI) kurucusu, stockowner, danışman ve yönetim kurulu üyesi olduğunu açıkladı. Ayrıca bilimsel danışman olarak hizmet vermekte ve Taktikler II Kök Hücre Ventures mali çıkarları var.

Eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler yapmak için mevcut protokoller, 1 mg 9 - 2,5 mg 10 total RNA başlangıç ​​miktarı arasında gerektirir. Burada bu yöntem sağlar hem de tek bir okuma ve eşli sonuna Illumina sıralama kütüphaneler ve gösteri hazırlamak için doğrusal T7 amplifikasyon temelli (T7LA) yöntemi ile karşılaştırılabilir veri üreten toplam RNA düşük olarak 10 ng kütüphaneler, nesil en az 1000 kat daha başlangıç ​​materyalinin (10 mikrogram total RNA) yapılan amplifiye (MinAmp) kütüphaneleri. 10 ng kütüphaneler, sadece genlerin benzer sayıların toplamı, tespit, ama aynı zamanda (Şekil 3a ve b) benzer gen ekspresyonu imzalar üretmek değil. Ayrıca, T7LA yöntemi ile üretilen tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler hem de araştırmacılar ya da protokol yapılmış kütüphaneler tarafından üretilen verileri karşılaştırmak sağlar (Şekil 3c) birbirlerine çok benzer. Bu kütüphanelerin, insan embriyonik kök hücre RNA hazırlanan bu yana, biz aramakütüphaneleri arasında 30 kök hücre spesifik genler ve bu genlerin hemen hemen tüm (% 93-100), böylece protokolü doğrularken total RNA (Şekil 4) başlayarak en az 10 ng yapılan kütüphaneler tarafından tespit olduğunu bulmak. Biz bizim protokolü akış sıralanmış hücreleri veya başlangıç ​​materyali sınırlayan lazer-mikro-disseke doku gibi durumlarda, özellikle araştırmacılar için çok faydalı olacağını inanıyorum. Bu gibi durumlarda, protokol gen ekspresyonu verileri nesil bizim protokol başlangıç ​​RNA büyüklüğü en az 3 emirleri arasında karşılaştırılabilir ifade profilleri üreten bu yana çok daha büyük bir başlangıç ​​miktarlarda yapılan kütüphaneler karşılaştırılabilir izin verecek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Şirket </td><td> Seti / reaktif </td><td> Katalog # </td><td> Eklemek </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Parçalanma reaktif </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Kalemi Akrilamid </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kiti </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Sigara DEPC nükleaz ücretsiz su tedavi </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP seti </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> metillenmiş dNTP </td><td> R0431 </td><td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Küme Nesil kiti v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 döngüleri </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Örnek Hazırlık Seti </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece. NEB DNA numune hazırlık Master Mix ile değiştirilebilir Set 1 Kedi # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Küme Nesil kiti v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Sadece eşleştirilmiş sonunda numune hazırlık için </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Eşleştirilmiş Sona örnek Hazırlık Seti </td><td> PE-102-1001 </td><td> Sadece eşleştirilmiş sonunda numune hazırlık için </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB artı merdiven </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Çıkışı </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2. iplikçik tampon 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimeraz </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-jel SYBR güvenli% 2 </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Üstsimge III (5X FS tampon ve 0.1M DTT ile) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit tahlil kiti </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit testi kiti </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligaz </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA Polimeraz </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Saf Dnase Rnase su </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Üstsimge II çift zincirli cDNA sentezi kiti </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rastgele Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Sadece eşleştirilmiş sonunda numune hazırlık için </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B astar </td><td> N / A </td><td> Tek kişilik oda için samÖrneğin hazırlık sadece </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 sindirim kiti </td><td> R0189S </td><td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute kiti </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Jel saflaştırma kiti </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase seti </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kiti </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Araştırma </td><td> DNA temiz ve konsantratör (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

10 nanogram total rna tek okuyun ve eşleştirilmiş sona mrna-seq illumina kütüphaneler

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

MRNA Seq ile Tüm transcriptome sıralama artık global gen ekspresyonu, mutasyon, allel spesifik ifadesi ve diğer genom analizleri gerçekleştirmek için yaygın olarak kullanılır. mRNA-Seq bile olmayan sıralı genomların gen ekspresyon analizi için kapı açılır. mRNA-Seq yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık sunar ve bir örnek transkript kopya numaraları ölçümünü sağlar. Illumina Kullanıcı genom analizörü, bir tek uzun okuma neyin &quot;eşleştirilmiş sonuna&quot; bir yaklaşım, hem de kendi biter sıralı.. Bir büyük nispeten kısa dizisi sayısı (&gt; 10 7) (&lt;150 bp) okur sıralama yapar alternatif ek kavşakları izleme sağlar , eklemeler ve silmeler, ve de novo transcriptome montaj için yararlıdır. Araştırmacılar tarafından karşılaştığı en önemli sorunlardan biri de sınırlı bir miktarda malzeme başlangıç. Örneğin, deneylerde hücreler lazer mikro-diseksiyonu, hasat başlangıç ​​total RNA mnanogram ölçü ay. MRNA Seq kütüphaneler bu tür numunelerin hazırlanması 1, 2 tarif edilmiştir ancak önyargı tanıtmak önemli PCR içerir. Minimal PCR ile RNA Sıra kütüphane yapım prosedürleri, 3, 4 yayınlanmış olmasına rağmen, toplam RNA başlayan mikrogram miktarlarda ihtiyaç var. Burada önemli PCR önler ve total RNA sadece 10 nanogram gerektirir kütüphane hazırlanması için mRNA Seq sıralama için Illumina Genom Analyzer II platformu için bir protokol. Bu protokol tanıtan önemli bir amplifikasyon önyargı olmadan yönlü kütüphaneleri üretmek için gösterilen tek sonunda sıralama 5, daha önce açıklanan ve onaylanmıştır olmasına karşın, biz burada eşleştirilmiş bir protokol olarak kullanmak için daha da doğrulamak. Biz seçici icat &quot;T7, T7 tabanlı Eberwine doğrusal amplifikasyon yöntemi kullanılarak toplam RNA başlayarak polyadenylated haberci RNA&#39;lar yükseltmekLA &quot;(T7 lineer amplifikasyon). Amplifiye poli-A mRNA&#39;ların parçalanmış, transkripsiyonu ve adaptör final sıralama kütüphanesi üretmek için bağlandı tersine her ikisi de tek bir okuma ve eşli sonuna çalışır, diziler insan transcriptome 6 eşleştirilir ve böylece normalize birden çok çalışır verileri mukayese edilebilir. numuneleri 7 karşılaştırırken RPKM üstün bir ölçü, bir milyon kişi başına transkript birimlerinde gen ekspresyonu ölçümü (TPM), rapor .

Burada T7 lineer RNA amplifikasyon dayalı gen ekspresyon analizi için iki tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna Illumina mRNA Seq sıralama kütüphaneler hazırlanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, toplam RNA başlayan sadece 10 nanogram gerektirir ve tüm transkript temsil eden son derece tutarlı bir kütüphane oluşturur.

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

mRNA-Seq ile tüm transkriptom dizileme; küresel gen ekspresyonu, mutasyon, alele özgü ekspresyon ve diğer ... analizlerini gerçekleştirmek için günümüzde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, az miktardaki başlangıç materyalinden Illumina mRNA sekans kütüphaneleri oluşturmaktır. Prosedürün ilk adımı, cDNA üretmek için toplam RNA'nın DTT yedi primer ile ters transkripsiyonuna tabi tutulmasıdır. cDNA, in vitro transkripsiyon yoluyla RNA amplifikasyonu için kullanılır. Ardından, amplifiye edilen RNA rastgele fragmantasyona tabi tutulur.Fragmente edilmiş RNA'nın ters transkripsiyonu, ardından adaptör ligasyonu, boyut seçimi ve PCR amplifikasyonuna tabi tutulan cDNA üretir. Nihayetinde, bu protokol gen kopya sayılarının ölçümü yoluyla örneğin gen ekspresyon profilini gösterir. Bu tekniğin temel avantajı, başlangıçta sadece 10 nanogram toplam RNA gerektirmesidir.Bu miktar, mevcut diğer protokollerin gerektirdiğinden katlarca daha azdır. Dahası, bu kadar küçük başlangıç RNA miktarlarından eşleşmiş kütüphaneler oluşturabilir. Bu yöntem, lazer yakalama, mikrodissection veya akış sitometrisinden elde edilenler gibi elde edilmesi zor hücre popülasyonlarından gen ekspresyon profillerinin belirlenmesine olanak tanıyarak bilim insanlarının biyolojide yeni soruları araştırmasına imkan sağlayacaktır.Bu yöntemi geliştirme fikri, insan amniyonik kök hücrelerinden farklılaştırılmış çok sınırlı sayıda hücreden gen ekspresyonu profilini çıkarma ihtiyacı duyduğumuzda ortaya çıktı. RNA miktarının çok az olması ve kolayca degrade olabilmesi nedeniyle RNA işleme basamaklarının öğrenilmesi zor olduğu için, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Prosedürü laboratuvarımdan Angela Elwell, Jennifer Bolen ve Baal Kimm Wynn uygulamalı olarak göstereceklerdir.Hem tek uçlu hem de çift uçlu sekanslama kütüphanelerini paralel olarak hazırlama yöntemi, bu akış şemasında gösterildiği gibi çok adımlı bir prosedürdür. İlk olarak, ilgili hücre veya dokulardan toplam RNA izole edilir ve çift zincirli cDNA hazırlamak için kullanılır. Ardından, T7 tabanlı ewin doğrusal amplifikasyon yöntemi kullanılarak cDNA'dan poliadenile mRNA'lar seçici olarak amplifiye edilir. Sonrasında, amplifiye edilmiş poli A RNA rastgele fragmanlara ayrılır.Fragmente edilmiş RNA temizlendikten sonra, cDNA'ya ters transkripsiyonu yapılır. cDNA uç onarımı gerçekleştirilir ve DNA fragmanlarının 3' ucuna A bazları eklenir. Ardından, DNA'ya adaptör ligasyonu yapılır ve Not1 digesyonu uygulanır. Single-end kütüphane durumunda, DNA kütüphanesi jel purifikasyonu ile izole edilir ve Illumina adaptörlerini ligalamak için PCR ile amplifiye edilir.Son olarak, DNA kütüphanesi miktar tayini yapıldıktan sonra dizileme için hazır hale gelir. Bu videonun amaçları doğrultusunda, bu protokoldeki yalnızca seçili prosedürler gösterilecektir. Fragmente edilmiş polyA mRNA'ların cDNA'ya ters transkripsiyonu, birinci zincir ve ikinci zincir sentezini içerir.Tek okumalı kütüphane için birinci zincir sentezi için, bir PCR tüpüne şu reaktifleri ekleyin: 10 µL fragmante poly mRNA ve 1 µL Not1 rastgele nonamer primer. Not1 nonamer primerin dizisi burada gösterilmiştir. Yeşil renkle gösterilen beş prime proksimal dizi, Not1 restriksiyon bölgesidir.Mavi renkle gösterilen sekans chip sekans kitindeki illumina'nın adaptör B sekansının ters tamamlayıcısı iken, karışımı termosiklet cihazında 70 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve ardından hızlıca buz üzerinde soğutun. Karışım buz üzerindeyken, superscript 3 kitinden şu reaktifleri ekleyin: 4 µL 5x birinci zincir tamponu, 2 µL DTT ve 1,5 µL DNTP karışımı. DNTP karışımında, DCTP yerine beş metil DCTP kullanın. Tüpü termosiklet cihazında 42 °C'de iki dakika boyunca tutun ve ardından 1 µL superscript 3, ters transkriptaz ekleyip 42 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, para uç kütüphanesi için birinci zincir sentezi reaksiyonunu hazırlayın. Bir PCR tüpüne şu reagenleri ekleyin: 10 µL fragmente edilmiş poly NNA ve 1 µL rastgele heksamer primer. Termosiklet cihazında 65 °C'de beş dakika inkübe edin ve ardından hızla buz üzerinde soğutun.Tüpü buz üzerinde tutarak, superscript three First strand kit içerisinden şu reaktifleri ekleyin: 4 µL 5x first strand tamponu, 2 µL DTT ve 1,5 L DN NTP'ler. Termosikletörde 45 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından 1 µL superscript three, ters transkriptaz ekleyin ve 45 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Her iki reaksiyon da ikinci zincir sentezine hazırdır. Buz üzerindeki her bir karışıma, üst simge iki kitinden şu reagensleri ekleyin: 91 µL nükleazdan arındırılmış su, 30 µL 5x ikinci zincir tamponu, 3 µL dNTP'ler, 1 µL E. coli DNA ligaz, 4 µL E. coli DNA polimeraz ve 1 µL E. coli RNase H. Her tüpü ters çevirerek karıştırın, ardından kısa süreliğine santrifüjleyin ve 16 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.Tek okumalı kütüphane için cDNA uç onarımı amacıyla, 40 µL saflaştırılmış cDNA'ya şu reaktifleri ekleyin: 10 mM ATP içeren 5 µL T4 DNA ligaz tamponu, 2 µL dNTP Karışımı, 1 µL T4 DNA polimeraz, 1 µL Klenow enzimi ve 1 µL T4 PNK. Eş uçlu kütüphane için ise 30 µL saflaştırılmış cDNA'ya şu reaktifleri ekleyin: 45 µL RNase-free su.10 mM ATP içeren 10 µL T4 DNA ligaz tamponu, 4 µL 10 mM dNTP karışımı, 5 µL T4 DNA polimeraz, 1 µL klonlama enzimi ve 5 µL T4 PNK ekleyin; uç onarımı sonrası her iki tüpü termosiklet cihazında 20 °C'de 30 dakika inkübe edin.Bu protokoldeki bir sonraki adım, tek okumalı kütüphane için DNA fragmanlarının 3' ucuna adenin bazları eklemektir. Şu reaksiyon karışımını hazırlayın: 34 µL DNA örneği, 5 µL klino tamponu, 10 µL dATP ve 1 µL klino exo. Eşli uçlu kütüphane için şu reaksiyon karışımını hazırlayın: 32 µL DNA örneği, 5 µL clin out tamponu.10 µL dATP ve üç µL clin out exo ekleyin; adaptör ligasyonu için reaksiyonları kurmadan önce her iki reaksiyon karışımını 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Adaptörleri buz üzerinde çözün ve tek okumalı kütüphane için 1/20 oranında seyreltin. Aşağıdaki reaksiyon karışımını hazırlamak için Illumina chip sequence örnek hazırlama kitini kullanın: 10 µL DNA örneği, bir µL adaptör oligo karışımı, 15 µL 2X DNA Ligaz tamponu ve dört µL DNA Ligaz; 15 dakika boyunca inkübe edin.Çift uçlu kütüphane için, aşağıdaki reaksiyonu hazırlamak üzere Illumina çift uçlu örnek hazırlama kiti kullanın. 10 µL DNA örneğini, 10 µL PE adaptör oligo karışımını, 25 µL 2X DNA ligaz tamponunu ve 5 µL DNA Ligazı karıştırın; ilgili inkübasyonların sonunda 20 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her iki ligasyon reaksiyonunu XMO kolonlarını kullanarak temizleyin.Tek uçlu okuma (single read) kütüphanesini ve 44 µL su ile eş uçlu (paired end) kütüphanesini 6 µL elüsyon tamponu ile elüye edin, ardından 5 µL EB ile bir elüsyon daha gerçekleştirin. Yalnızca tek uçlu okuma kütüphanesi için Not1 sindirimi yapın. ZYMO kolonunu kullanarak reaksiyonu saflaştırdıktan sonra 37 °C'de iki saatten gece boyuna kadar inkübe edin.Tek okuma kütüphanesini altı µL tampon eb ile elüe edin ve ardından beş µL eb ile ikinci bir seyreltme yapın. Her iki kütüphane için adaptör ligasyonu yapılmış DNA, artık boyut seçimine hazırdır. Adaptör ligasyonu yapılmış DNA için boyut seçimi prosedürü, Vitrogen marka %2 cyber safe EE kullanılarak gerçekleştirilir; bu prosedüre başlamak için program sıfır ön çalışmasını iki dakika boyunca çalıştırın.Ön çalıştırmadan sonra, 10 µL 1 KB plus ladder ve 2D NA örneklerini yükleyin. Boş kuyucukları 10 µL su ile doldurun. %2'lik bir jeli 28 dakika boyunca çalıştıracak programı başlatın.Çalışma tamamlandığında, jel dilimlerinin 200 ila 300 baz çifti arasındaki kısmını yeni bir jiletle seçin. Çeşitli kütüphaneler tarafından tanımlanan gen sayısı değerlendirilmiş olup, bu tablo küme sayılarına ilişkin bilgileri göstermektedir. Hem tek okuma hem de çift uçlu kütüphaneler için tanımlanan genlerin hata oranı ve tek okuma ile çift uçlu kütüphanelerin hizalama yüzdeleri belirtilmiştir.10 nanogram T seven LA kütüphaneleri, 10 veya daha fazla TPM değerine sahip olan 10 mikrogram UN amplifiye kütüphaneleri ile neredeyse aynı sayıda gen tanımlamıştır. Tek okuma (single read) kütüphaneleri durumunda, 10 nanogram T seven LA kütüphanesi, paradigm kütüphaneleri için 10 mikrogram UN amplifiye kütüphanesi tarafından tanımlanan 8.500 genin %100'ünü tanımlamıştır. 10 nanogram T seven LA kütüphanesi, 10 mikrogram unpled kütüphanesi tarafından tanımlanan genlerin %86'sını tanımlamıştır.10 nanogramdan daha az miktarla hazırlanan kütüphaneler, aynı miktarda geni tanımlayamamıştır. Örneğin, tek okuma protokolünde, bir nanogramlık T seven LA kütüphanesi, 10 microgram min amp kütüphanesi tarafından tanımlanan genlerin yalnızca yaklaşık %50'sini tanımlayabilmiştir. Bu nedenle, T seven LA protokolünde kullanılacak toplam RNA'nın en düşük miktarı, bir housekeeping geninin haritalandırılması için 10 nanogram ile sınırlandırılmalıdır.GA DH, en az 10 nanogram başlangıç RNA'sı ile hazırlanan tüm T seven LA kütüphanelerinin, uç beş prime eksonu da dahil olmak üzere tüm eksonları tanımladığını göstermektedir. Tek okumalı kütüphaneler için soldaki ölçek çubuğu 350 toplam okumayı belirtmektedir. DEN kütüphaneleri için merkezdeki ölçek çubuğu 5.000 toplam okumayı belirtmektedir.10 nanogram T seven LA tek okumalı (single read) ve çift uçlu (paired end) kütüphanelerin min amp kütüphaneleri ile karşılaştırılması, yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Tek okumalı 10 nanogram T seven LA kütüphanesi ile 10 microgram min amp kütüphanesi arasında 0,90'lık bir spearman korelasyonu elde edilmiş ve PEREN 10 nanogram T seven LA kütüphanesi ile 10 microgram min amp kütüphanesi arasında 0,95'lik bir korelasyon elde edilmiştir. Ayrıca, 10 nanogram toplam RNA'dan hazırlanan iki tek okumalı ve peren kütüphanesi arasında bir karşılaştırma yapılmış olup, elde edilen çok yüksek korelasyon katsayısı, T seven LA protokolü kullanılarak hazırlanan her iki kütüphane türünün de birbirine çok benzer bir gen ekspresyon imzası oluşturduğunu kanıtlamaktadır.Son olarak, bu kütüphaneler insan embriyonik kök hücre RNA 30 kök hücrelerinden hazırlandığı için, kütüphaneler arasında belirli genler aranmıştır. Bu genlerin neredeyse tamamı, başlangıç toplam RNA miktarı en az 10 nanogram olan kütüphaneler tarafından tanımlanmış ve böylece bu protokol doğrulanmıştır. Bu protokol uygulanırken, degradasyonu önlemek için küçük RNA örneklerinin aşırı dikkatle işlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, çok küçük miktarlardaki başlangıç materyallerinden Illumina, Mr.Aeq tek okumalı ve Paradigm kütüphanelerinin nasıl hazırlanacağı konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Nanopore sıralamasını uzak konumlarda ve kaynak kötü ayarlarında maliyet-etkili sıralamaya izin veren bir yeni teknoloji. Burada, mRNAs 'ın bu şartlar ile uyumlu olan tüm kandan sıralanması için bir protokol sunuyoruz.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Erken fare embriyolarında mikroRNA'ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Bio-Rad Total RNA Kiti Kullanarak Neuroprecursor Hücreler RNA Ekstraksiyon

Öğrenin, Illumina mRNA-Seq kütüphaneleri hazırlama yöntemini sadece 10 nanogram toplam RNA kullanarak. T7 lineer amplifikasyon ile gen ifadesi analizi yapın ve sınırlı hücre popülasyonlarından güvenilir sonuçlar elde edin.

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

Daha fazla video keşfet