Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Temel Protokol Plus, Sorun ve Optimizasyon Stratejileri

Bu prosedürün genel amacı, az miktarda başlangıç materyalinden belirli bir DNA segmentinin bol miktarda tedarikini üretmek için kullanılan polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR'de yer alan adımları göstermektir. İlk olarak, PCR reaksiyonunda kullanılacak reaktifleri ve malzemeleri birleştirin, ardından dört deoksi ribonükleotid, DNA şablonu, primerler ve DNA polimeraz dahil olmak üzere reaksiyon karışımını ayarlayın. Bir sonraki program, termal döngü koşullarını ve PCR reaksiyonunu çalıştırır.

Bunu takiben. Reaksiyonun başarılı olup olmadığını belirlemek için sonuçları kontrol edin. Sonuç olarak, bir polimeraz zincir reaksiyonu, istenen ürün boyutunda spesifik bir amplikon vermelidir.

Genel olarak, bu protokole yeni başlayan kişiler, değişken reaktiflerin her birinin hesaplamalarını ayarlamakta biraz zorlanacaklar ve bazen pipetleme, doğru hacimler, özellikle gliserol içeren polimeraz ile ilgili sorunlar yaşayacaklar. Deneye yeni doldurulmuş bir buz kovası ile başlayın. Reaksiyonu kontamine etmemek için eldiven giyin.

Karışım ve reaktifler. PCR bileşenlerini tamamen çözülmesi için buz üzerinde düzenleyin. Bunlar arasında DNA şablon primerleri, magnezyum klorürlü veya magnezyumsuz DNA polimeraz 10 x reaksiyon tamponu, deoksi nükleotidler, steril su ve magnezyum klorür bulunur.

Tampon magnezyum klorür olmadan kullanılıyorsa magnezyum klorür gereklidir. 0,2 mililitre ince duvarlı PCR tüpleri için bir tutucu olarak bir buz kovasına 96 oyuklu bir plaka yerleştirin. Şimdi tezgahı PCR tüpleri ve kapakları ile donatın.

Bir PCR tüp rafı, etanole dayanıklı bir işaretleyici ve bir dizi mikro pipetleyici. 50 mikrolitrelik nihai hacim elde etmek için her zaman kuantum steril damıtılmış su ile reaksiyon karışımını detaylandıran bir reaktif tablosu oluşturun. Örneğin, magnezyum içermeyen beş mikrolitre tampon, bir mikrolitre 10 milimolar DN NTP ve optimize edilmiş 4.0 milimolar magnezyum kullanmak.

Her 20 mikromolar primerden bir mikrolitre, mikrolitre şablon başına iki nanogramdan 0.5 mikrolitre. Ve 0.5 mikrolitre polimeraz sadece 33 mikrolitre steril su gerektirir. 10 x tamponda yoksa veya PCR optimizasyonu için gerekirse magnezyum klorür ekleyin.

PCR tüplerini her reaksiyon tüpüne etanole dirençli bir işaretleyici ile etiketlemeye devam edin. İlk olarak, hesaplanan steril su miktarlarını ekleyin, ardından 10 x tampon ve 10 milimolar DN NTP ekleyin. Bu reaksiyon için magnezyum klorür ile bir titrasyon gerçekleştiriyoruz.

Magnezyum konsantrasyonu sabit olmayacağından, PCR tüplerine ayrı ayrı magnezyum klorür eklenir ve hacim steril su ile 10 mikrolitreye normalize edilir, böylece her bir PCR tüpüne 40 mikrolitre nihai ana karışım eklenir. 50 mikrolitre reaksiyonu ve magnezyum klorürü tamamlamak için DNA şablonunu ve primerleri eklemeye devam edin. Son olarak, 1.8 mililitrelik bir mikro füj tüpüne 50 mikrolitrelik reaksiyon başına 0.5 ila 2.5 birim DNA polimeraz ekleyin.

Kontrollerin yanı sıra pipet transfer kaybını da karşılayacak kadar bir ana karışım çözeltisi hazırlayın. Bir mikro pipetleyiciyi toplam çözelti hacminin yaklaşık yarısına ayarlayın ve pipetleyerek nazikçe karıştırın. Her test numunesi için eloquent ana karışımı PCR tüpüne karıştırın.

Şimdi şablon DNA'sı olmayan negatif kontrol için, tüm reaktifleri ekleyin ve eksik DNA hacmini telafi etmek için steril su kullanın. Daha sonra pozitif kontrol için, deneysel PCR örnekleriyle aynı koşullar altında bilinen bir fragmanı çoğaltan bir dizi şablon DNA ve primer kullanın. PCR termal döngüleyiciler, reaksiyon karışımını hızla ısıtır ve soğutur, bu da dupleksin ısıya bağlı denatürasyonuna, DNAA'nın primerlerin DNA şablonunun artı ve eksi ipliklerine diz çökmesine ve PCR ürününün uzamasına izin verir.

Döngü süreleri, şablonun boyutuna ve genel formül için DNA'nın GC içeriğine bağlıdır. Şablonun ilk denatürasyonu ile başlayın, ardından üç aşamalı bir sıcaklık döngüsü programının 25 ila 35 turunu başlatın. Bu döngülerin ilk adımı, DNA şablonunu denatüre etmektir.

Daha sonra, primerlerin görünen erime sıcaklığının yaklaşık beş santigrat derece altında bir primerlerin diz çökmesi için optimal programlayın, ardından polimerazı DNA şablonuna getirmek ve PCR ürününü sentezlemek için uzama adımını izleyin. Şimdi döngü sayısını girin. Sonraki program.

Amplikon sentezinin tamamlanması için uzatılmış bir uzama adımı. Son olarak, karışımı dört santigrat dereceye kadar soğutan bir sonlandırma adımı ekleyin. Standart PCR koşulları istenen amplikonu vermezse, daha iyi sonuçlar elde etmek için PCR optimizasyonu gereklidir.

Bu nedenle, tepkiler ilk kez işe yaramadıysa, tepkiyi gidermeyi denemek istersiniz. Ve ilk olarak, sorunun insan hatası olmadığından emin olmak istersiniz. Ve bu, bir pipetleme hatanız varsa veya teste bir reaktif eklemeyi unuttuysanız, test tüplerinden biri olabilir.

Daha sonra, durumun bazı sıkılıklarını değiştirmeyi deneyebilirsiniz, böylece termocycler'ın kurulumunu değiştirebilir veya magnezyum konsantrasyonunu değiştirebilirsiniz, bu başka bir alternatif yöntemdir. Sorunları gidermek için reaktife bazı katkı maddeleri eklemeyi de deneyebilirsiniz. Alternatif olarak, sıcak başlatma PCR'yi, ilk denatürasyon süresinin önemli ölçüde arttığı çok yönlü bir modifikasyon olarak düşünün.

AROS jel elektroforezi daha sonra, bu reaktif seti için optimal magnezyum iyonu konsantrasyonunu belirlemek için S seia'nın genomik DNA'sından GAL üç geninin PCR'sini çözmek için kullanılır, not, Beklenen boyutta bir PCR ürünü. 2098 baz çifti, 2.5 milimolar magnezyum konsantrasyonundan başlayarak ve farklı DNA şablonunda dört milimolar'da optimal bir konsantrasyonla görünür PCR ürününün amplifikasyonu, ayrı bir bant gerektirdiğinden iki milimolar magnezyum. Reaksiyonun sıkılığını etkili bir şekilde suboptimal amplifikasyon koşullarına indirgemek, spesifik olmayan ürünlerden oluşan bir leke üretir.

Ayrıca, reaksiyon indirgemesinin genel sıkılığı ile, bir amplikon simgesi oluşturmak için daha düşük miktarda magnezyum iyonu gerekir. Böylece, değişkenleri göz önünde bulundurarak PCR'yi optimize etmek, istenen ayrı ürünü üretebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir polimeraz zincir reaksiyonunun nasıl kurulacağını ve hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Amaç, her bir PCR'nin değişkenlerini ve istenen amplikonu oluşturmak için bunların nasıl manipüle edilebileceğini anlamaktır.