Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Bu protokol, lusiferaz raporlayıcı hücre hatlarının oluşturulmasını ve ardından biyolüminesans ekspresyonunun hücre otonom sirkadiyen ritimlerinin izlenmesini detaylandırmaktadır. İlk olarak lentiviral lusiferaz ekspresyon raporlayıcıları oluşturun ve lentiviral partiküller üretin, ardından ilgili hücreleri enfekte ederek seçilen kültürleri çoğaltın. Daha sonra, senkronize edilmiş raporlayıcı hücrelerdeki biyolüminesans ekspresyonunu uygun bir kayıt cihazı kullanarak izleyin.

Nihayetinde, biyolüminesans kaydı, hücre otonom sirkadiyen ritimleri göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, geçici transfeksiyon ve germ hattı koruması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, VIR aracılığıyla gerçekleşmesidir. Gen, hücre genomuna stabil entegrasyonun yanı sıra daha yüksek verimlilik ve çok yönlülük sağlar.

Bu yöntem, sirkadiyen saat araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, dokuya özgü sirkadiyen saatler var mıdır? Eğer varsa, dokuya özgü sirkadiyen saatlerin özellikleri nelerdir?

Bu yöntem saat mekanizmaları hakkında bilgiler sağlayabilse de, hücre döngüsü dinamikleri ve tümorigenez gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, dokuya veya hücre tipine özgü saatleri incelemeye karar verdiğimizde ortaya çıktı.

Prosedürü, doktora sonrası araştırmacı Dr. Chita Norm Napkin ve Atory laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Sandra uygulamalı olarak gösterecektir. Tipik olarak, bir memeli sirkadyen raporlayıcı konstrüktü, sirkadyen bir promotörün lusiferaz geniyle birleştirildiği bir ekspresyon kaseti içerir. Bu lentiviral raporlayıcıda, destabilize lusiferaz, fare per2 promotörünün kontrolü altındadır.

Rekombinasyon reaksiyonu ile reporter vektörlerin oluşturulmasına ilişkin ayrıntılı talimatlar için, etkili transfeksiyon için hazırlanan beraberindeki makaleye başvurun. %90 ila %100 konflüense sahip, düşük pasaj numaralı insan embriyonik böbrek hücreleri kültürü ile başlayın. Şimdi altı kuyucuklu kültür plaklarını kaplama aşamasına geçelim.

Transfeksiyon için, her kuyucuğa bir mililitre %0,001 poly L lycine ekleyin, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve bir kez PBS ile durulayın. Ardından, hücreleri tripsin kullanarak toplayın ve hücreleri önceden kaplanmış plakların her bir kuyucuğuna ekin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakları dairesel hareketlerle sallayın.

1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpündeki ekilmiş hücrelerin %80 ila %90 konfluansa ulaştığını doğrulayın. Hem transfeksiyon hem de sonraki enfeksiyon için kontrol olarak, bir lentiviral raporer plazmidi, DNA ve üç paketleme vektöründen oluşan plazmid transfeksiyon karışımını hazırlayın. CMV promotör kontrolü altında geliştirilmiş yeşil floresan protein içeren bir lentiviral GFP ekspresyon vektörü için ek bir kuyucuk ekleyin.

Ardından, plazmidlere 100 µL 0,25 M kalsiyum klorür ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra 100 µL 2X BBS çözeltisi ekleyip nazikçe ancak tamamen karışmasını sağlayın. DNA karışımını 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Beklerken, 2 9 3 T hücrelerindeki besiyerini iki mililitre taze besiyeri ile değiştirin. Besiyeri pH değerinin dengelenmesi için plakayı en az 10 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ardından, transfeksiyon karışımını hücrelere damla damla ekleyin, plağı hafifçe çalkalayın, mikroskop altında partikül oluşumunu gözlemleyin ve ardından hücreleri gece boyunca inkübatöre yerleştirin.

Transfeksiyondan yaklaşık 16 saat sonra, besiyerini iki mililitre taze DMEM ile yenileyin ve gece boyunca kültüre edin. Ardından, transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için transfeksiyon kontrol hücrelerindeki EGFP ekspresyonunu inceleyin. Yüksek EGFP ekspresyonu ile %90 ila %100 arasında gerçekleşen bir transfeksiyon verimliliği, başarılı bir viral hazırlığın güvenilir bir göstergesidir.

Salgılanan enfeksiyöz viral partikülleri içeren ortamı hasat edin; kalıntı 2 9 3 T hücrelerini uzaklaştırmak için santrifüjleyin ve virüs içeren süpernatantı toplayın. Üçüncü günde, 12 kuyucuklu bir plakaya yaklaşık 12, 003 T üç hücresi ekerek gece boyunca %20 ila %30 konfluens düzeyine kadar kültürleyin ve dördüncü günde hücreleri gözlemleyin. Yine dördüncü günde, viral partiküller içeren toplanmış ortama poly brain ekleyin ve pipetleme yaparak iyice karıştırın.

Şimdi üç T3 hücresindeki besiyerini aspire edin ve her kuyuya bir mililitre viral karışım ekleyin. 37 °C'de gece boyunca inkübe edin; hücreleri bir kez PBS ile yıkadıktan sonra, besiyerini yenileyin ve hücreleri toparlanma ve büyüme için 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Konfluens seviyesine ulaştıklarında hücreleri ayırın ve ertesi gün gece boyunca kültürleyin.

Enfekte hücrelerin seçimine başlamak için, mililitre başına 10 mikrogram içeren taze besiyeri ekleyin. Blastisin öldürme konsantrasyonu, her hücre hattı için ampirik olarak belirlenmelidir. Antibiyotikle dirençli hücrelerin sürekli seçimi için, blastisin içeren besiyerini her iki ila üç günde bir yenileyin.

Sirkadiyen saat raporlayıcılarının ekspresyonu. Blastisinle dirençli raporlayıcı hücre kültürü, 35 milimetrelik kültür kaplarında konfluens olana kadar çoğaltıldıktan sonra, her bir koşul altında her bir raporlayıcı hücre hattı için genellikle fenotip analizi amacıyla üç veya daha fazla kap hazırlanır. Hücreleri senkronize etmek için PBS ile bir kez yıkadıktan sonra, 10 mikromolar forlin veya 200 nanomolar dekzametazon içeren DMEM eklenir ve 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca inkübe edilir.

Şimdi hücreleri taze hazırlanmış kayıt ortamına yerleştirin. Kültür kaplarını 40 milimetrelik steril örtü camları ile kapatın ve buharlaşmayı önlemek için vakum gresi ile sızdırmaz hale getirin. Kapları lumous cycle lüminometreye yerleştirin ve gerçek zamanlı biyolüminesansı başlatın.

Kayıt 96'lık eski plak kayıtları için. GSR iki kayıt cihazı ile ilgili olarak eşlik eden yazıya bakınız. Ritim kayıtlarını lum cycle analiz programında beş ila yedi gün boyunca kolayca gerçekleştirdik.

İlk olarak ham verilere taban çizgisi uydurma işlemi uygulayın. Ardından, kalıcı ritimler gösteren örnekler için gerekli parametreleri belirlemek ve bir sinüs dalgasına uydurmak üzere taban çizgisi çıkarılmış verileri kullanın. Yüksek geçici lüminesans nedeniyle, verilerin %90'ından fazlası için uyum iyiliği kolaylıkla sağlanır.

Sinyalin yükselmesi ve ortam değişimi. Veri sunumu için genellikle analizimizden ilk döngü verilerini hariç tutarız. Gerektiğinde ham verileri zamana karşı grafiğe dökün.

2 9 3 T hücrelerinin geçici transfeksiyonunda ve hücre hatlarının enfeksiyonunda genlik ve fazı karşılaştırmak için temel çizgisi çıkarılmış verileri grafiğe dökün. Transfekte edilmiş ve transduksiyon yapılmış GFP eksprese eden hücrelerin floresan görüntüleri, lentiviral aracılı gen aktarım sisteminin oldukça etkili olduğunu göstermektedir. Bir sirkadiyen saatin temel geri bildirim döngüsü, ritmik gen ekspresyonu üretmek için sirkadiyen artırıcı elementler üzerinde etki eden transkripsiyon faktörlerinden oluşur.

Burada, üç T üç hücrelerindeki dört farklı raporlayıcı yapı, raporlayıcı ekspresyonunun belirgin fazlarını üretmektedir. RNAi yoluyla gen susturma ve farmakolojik olarak aktif bileşikler kullanılarak, çoklu sirkadiyen elementlerin kombinatoryal düzenlemesi ile yeni ara fazlar oluşturulabilir. Bu deneyde, 35 milimetrelik kaplardaki U2 OS hücrelerinin biyolüminesans kayıtları için lum cycle lüminometresi kullanılmıştır.

cry one ve cry two genlerinin susturulma etkilerini aydınlatmak için Irna kullanılmıştır. Burada, hücrelerin biyolüminesans kaydı için bir sinerji lüminometresi kullanılmıştır. 96 kuyucuklu bir plaka içerisinde üç T üç reporter hücreleri kullanılmıştır.

Hücresel ritimler üzerindeki triune nakavt etkilerini değerlendirmek için RNA'lar kullanılmıştır. Bu örnekte, 384'lü plakalar içindeki hücrelerin biyolüminesans kayıtları için UX sistemi ve bir Tecan lüminometre kullanılmıştır. Belirtilen plakalar seçilirken, küçük moleküller U2 OS raporlayıcı hücrelerin hücresel ritimlerindeki protein fonksiyonlarını farmakolojik olarak hedefleyebilir ve bozabilir.

Geliştirilmesinin ardından, bu teknik, sirkadiyen biyoloji alanındaki araştırmaların farklı hücre ve doku tiplerindeki saat mekanizmalarını ve fizyolojisini keşfetmesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, lüsiferaz raporlayıcı hücre hatlarının nasıl oluşturulacağı ve hacimlerin nasıl izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.

VIR ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür uygulanırken kişisel koruyucu ekipmanlar ve viral dekontaminasyon gibi önlemler her zaman alınmalıdır.