STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu protokol, dört mililitre periferik kandan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini göstermektedir. Sıfırıncı günde, periferik kan örneğinden mononükleer hücreleri izole edin ve genişletin. Primer hücreleri yeniden programlama kök ko-vektörü ile transdüse edin.

Dokuzuncu günde, transduce edilmiş hücreleri inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları üzerine ekimi gerçekleştirin ve yaklaşık üç hafta boyunca kültüre edin. Ekspansiyon ve karakterizasyon için HESC benzeri kolonileri seçin. SSEA-4, TRA-1-60 ve TRA-1-81 gibi pluripotensi belirteçlerinin ekspresyonuna yönelik immünofloresan boyama sonuçları.

İndüklenmiş insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde üretimini gösterin. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri üretmek için kök hücre antiviral vektörünün kullanımı, mevcut diğer yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Belki de en çekici olanı, donör dokusuna kolay erişim gerektirmesi —bu noktada kolayca elde edilebilen periferik kan örneklerini kastediyorum— nedeniyle yaklaşımın genel basitliğidir.

Bu yöntemin en önemli özellikleri, yeniden programlama verimliliği ve elde edilen IPS hücre klonlarının kalitesidir. Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Andrea January Summer ve George Murphy'nin laboratuvarındaki lisansüstü öğrencisi Sarah Rozellele gerçekleştirecektir. Hepsi sıfırıncı günde.

Sodyum sitrat içeren bir vakuteyner hücre hazırlama tüpüne dört mililitre periferik kan çekin. Tüpü, kan alımından sonraki iki saat içinde sekiz ila 10 kez altüst ederek karıştırın. Mononükleer hücreleri toplamak için örneği oda sıcaklığında 1, 800 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.

Plazmayı aspire ederek uzaklaştırın ve jel bariyeri ile plazma arasındaki hücre tabakası olan buffy coat'u pipetle çekin. Buffy coat'u steril 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve toplam hacmi steril PBS ile 10 mililitreye tamamlayın. Tüpleri birkaç kez altüst edin ve 300 G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücre peletini 10 mililitre steril PBS içinde yeniden süspanse edin, hücre sayımı gerçekleştirin ve ardından 1 ila 2 x 10⁶ hücreyi steril 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri santrifüjasyonla toplayın ve peleti iki mililitre genişletme medyumunda yeniden süspanse edin. Ardından, izole edilen mononükleer hücreleri 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna ekimleyin ve 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında kültüre edin.

Kalan hücreleri santrifüj ile toplayın ve üçüncü ve altıncı günlerde, %10 DMSO içeren FBS içinde şişe başına yaklaşık iki x 10⁶ hücre olacak şekilde stoklar dondurun. Hücreleri steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yapışık hücreleri toplamak için kuyucuğu bir mililitre QBSF 60 kök hücre besiyeri ile bir kez yıkayın.

Hücreleri santrifüj ederek hasat edin ve hücre peletini iki mililitre em içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücre süspansiyonunu 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve dokuzuncu günde kültürü inkübatöre geri koyun. Hücreleri steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yapışmış hücreleri toplamak için kuyucuğu bir mililitre QB SF 60 kök hücre medyumu ile bir kez yıkayın; kültürü 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hücre peletini, bir ila 10 MOI için mililitrede beş mikrogram poly brain ve STEM lentivirus içeren bir mililitre taze EM içinde yeniden süspande edin. Daha sonra süspansiyonu 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve 25 °C'de 90 dakika boyunca 2.250 RPM'de santrifüjleyin. Toplam iki mililitre EM elde etmek için, mililitrede beş mikrogram poly brain içeren ek bir mililitre taze EM ekleyin ve plakayı 10. günde hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Hücreler daha önce gösterildiği şekilde hasat edildikten sonra, hücre peletini iki mililitre EM kültüründe tekrar süspanse edin. 11. günde, 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğundaki transduksiyona uğramış hücreler için, altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarını %0,1 jelatin ile kaplayın, ardından inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastlarını meth medyumunda kuyucuk başına iki x 10⁵ hücre olacak şekilde ekleyin. Enfeksiyon başına üç kuyucuk hazırlayın.

Ertesi gün, daha önce gösterildiği gibi transduse edilmiş mononükleer hücreleri hasat edin. Santrifüjasyonun ardından hücre peletini, BFGF, askorbik asit ve büyüme faktörleri içeren üç mililitre meth medyumunda yeniden süspanse edin.

Şimdi MES plağındaki her kuyucuktan bir mililitre MC'li OFM medyasını aspire edin. Ardından 1,5 mililitre tamamlanmış meth medyası ekleyin ve plağı 25 °C'de 30 dakika boyunca 500 RPM'de santrifüjleyin. Daha sonra, 14. günden itibaren iki gün boyunca 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında kültüre edin.

Besiyerini, her iki günde bir, 10 ng/mL BFGF ve 50 µg/mL askorbik asit içeren ancak büyüme faktörü içermeyen 2,5 mL meth besiyeri ile yenileyin. Yaklaşık 20. günde, küçük kolonlar göründüğünde, 30. ve 40. günler arasında hücreleri her gün iki mililitre insan embriyonik kök hücre besiyeri ile besleyin. Her bir kolonu seçin ve bir mililitre HESC besiyeri ile ROCK inhibitörü içeren inaktive edilmiş maths ile ön işlem görmüş 12 kuyucuklu bir plağın ayrı kuyucuklarına aktarın; hücreleri günlük olarak besleyin.

Ardından, rock inhibitörü içermeyen bir mililitre HESC medyumu ile, insan monosit türevli pluripotent kök hücreleri artık pluripotens belirteçlerinin immünofloresan boyaması ve ayrıca entegre yeniden programlama kasetinin çıkarılması için hazırdır. Bu protokol sırasında hücreler, P BMC'lerden insan iPSC üretimine kadar çeşitli morfolojik değişiklikler geçirir. Sıfırıncı günde, periferik kandan izole edilen mononükleer hücreler dokuz gün sonra genişletme medyumunda kültüre edilir.

Hücrelerin sağlıklı olduğu ve transdüksiyon öncesinde çoğaldığına işaret eden, hücre kümeleri şeklinde üzüm salkımlarına benzer yapılar gözlemlenir. Hücrelerin MA'lara ekilmesinden yaklaşık 21 gün sonra koloniler oluşur. 30. günde, iPSC kolonileri tipik insan embriyonik kök hücresi benzeri morfoloji sergiler.

PBMC'lerden üretilen iPSC'lerin bu immünofloresan analizi, pluripotens belirteçleri SSEA-4, TRA-1-60 ve TRA-1-80 ekspresyonunu göstermektedir. iPSC'ler ayrıca alkali fosfataz için pozitif boyanma göstermektedir. Bu görüntüler, Summers ve ark. 2010'da açıklandığı üzere, CRE rekombinaz ve bir purimisin direnç geni eksprese eden bir plazmid ile transfeksiyon yoluyla transgen içermeyen iPSC'lerin üretilme adımlarını göstermektedir; transfeksiyon öncesindeki iPSC'lerle karşılaştırıldığında hücre ölümü gözlemlenmektedir.

İki günlük purmisin seleksiyonunun ardından, transfeksiyondan yaklaşık 10 gün sonra dirençli hücrelerden yeni koloniler oluşur; seçilen koloniler üzerinde yapılan Southern blot analizleri, transgenin eksize edildiğini doğrular. 1, 3, 5 ve 7. şeritler, eksize edilmeden önceki iPSC klonlarında transgenin varlığını göstermektedir. Transgenin eksize edilmesinin ardından 2, 4, 6 ve 8. şeritlerde bu bantlar görülmez. Bu videoyu izledikten sonra, herhangi bir bireyden alınan az miktardaki periferik kandan, yüksek kaliteli, normal veya hastalığa özgü insan iPS hücrelerini tutarlı ve güçlü bir şekilde üretebilmeniz gerekir.

Bu yaklaşım, rep programlama sürecini basitleştirerek onu kök hücre topluluğu için yaygın olarak erişilebilir kılar. Aynı zamanda, daha homojen kök hücre hattı popülasyonlarının oluşturulması için bir temel sağlar.