Name: STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin, çevresel kan örneklerinden tek bir lentiviral vektör kullanarak insan iPS hücreleri üretme yöntemini. Bu protokol, kök hücre teknolojisini araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmalar GJM ve GM NIH UO1HL107443-01 Ödülü tarafından finanse edildi.

1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izolasyonu ve Genişletme GÜN 0 <ol><li> Sodyum sitrat içeren bir BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp içine periferik kan 4 ml çizin. Tüp 8-10 kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 30 dakika için 1800 x g&#39;da santrifüjlenir. İdeal olarak, bu adımı toplama 2 saat içinde yapılmalıdır. </li><li> Steril bir 15 ml konik santrifüj tüpüne buffy coat (jel bariyeri ve plazma arasındaki hücre tabakası) pipetleme mononükleer hücre (MH) toplayın. 15 dakika 300 x g santrifüj ile birkaç kez, invert steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 ml toplam hacmi getirmek. </li><li> Steril PBS içinde 10 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve hücre sayımı ile yerine getirir. 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de steril 15 ml konik santrifüj tüpü ve santrifüj içine 1 2x10 6 hücre aktarın. </li><li> Genişleme ortam, 2 ml (EM) (içinde tekrar süspansiyon hücreleri 50 ug / ml içeren Asco QBSF-60 Kök Hücre Ortarbic asit, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml, IGF-1, 1 uM Deksametazon ve 100 ug / ml primocin ya da% 1 pen / strep) ve aktarma bir iyi bir 12-kuyulu plakanın. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin. </li><li> 300 x kalan hücreleri santrifüjleyin % 10 DMSO içeren FBS 10 dk ve donma ~ 2x10 6 hücre / flakon için g. </li><li> PBMC kullanılarak dondurulmuş protokol başlamak için, 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de QBSF orta ve santrifüj 10 ml içine hücre 1 vial eritin. EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12-kuyulu plakanın iyi bir transfer. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin. </li></ol> GÜN 3 ve 6. GÜN <ol start="17"><li> Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın. </li><li> 10 dakika için 300 x g&#39;da hücre santrifüjleyin. </li><li> EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12 de bir transfer-Plaka. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin. </li></ol> 2. STEMCCA Lentivirus ile PBMC&#39;ler ve İletimi GÜN 9 <ol><li> Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın. </li><li> 10 dakika için 300 x g&#39;da hücre santrifüjleyin. </li><li> 5, ug / polybrene ve STEMCCA lentivirüs ml içeren taze EM, 1 ml hücre yeniden süspanse edin (MOI = 1-10) ve bir 12-kuyulu plakanın de bir transfer. (Lentiviral parçacıklarının üretim tarif protokol bulunabilir <a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a> ) </li><li> 90 dakika için 25 ° C&#39;da 2,250 rpm&#39;de plaka Spin. </li><li> Spin sonra, taze EM ilave 1 ml ekleyin ortam, 2 ml toplam olarak 5 ug / ml polybrene ihtiva eden ve 37 ° C de inkübe plaka,% 5 CO 2 inkübatör. </li></ol> 10. GÜN <ol start="16"><li> Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın. </li><li> 10 dakika için 300 x g&#39;da hücre santrifüjleyin. </li><li> EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12-kuyulu plakanın 1 iyi transfer. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin. </li></ol> 3. Kaplama MEFS üzerine Hücreleri transdüklü GÜN 11 <ol><li> Coat 2x10 5 hücre az% 0.1 jelatin ve plaka inaktive fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) ile / iyi MEF orta (IMDM% 10 FBS,% 1 Temel Olmayan Amino Asitler içeren, 100 mcM β-bir 6-plaka kuyu merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml primocin ya da% 1 Pen / Strep.) Infeksiyon başına 3 kuyu hazırlayın. </li></ol> GÜN 12 <ol start="2"><li> Bir steril 15 ml konik tüpe transfer hücreleri<html> ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın. </li><li> 10 ng / ml bFGF, ve askorbik asit ve EM kullanıldığı gibi aynı konsantrasyonlarda, büyüme faktörü içeren MEF orta 3 ml hücreler yeniden süspanse edin, orta (50 ug / ml Askorbik Asit, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml, IGF-1, 1 uM deksametazon). </li><li> Levha 1 hücreleri ml başına iyi MEFS ihtiva eden bir 6-kuyulu plakanın. / Kuyu ortamı 2.5 ml toplam bFGF, askorbik asit ve büyüme faktörleri ile MEF ortam 1.5 ml ilave edilir. </li><li> 25 500 rpm&#39;de döndürme tabağı ° C&#39;de 30 dakika süre ile. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. </li></ol> GÜN 14 <ol start="6"><li> 10 ng / ml bFGF ve 50 mg / ml Askorbik Asit (hiçbir büyüme faktörleri) içeren MEF medyanın 2,5 ml Yem hücrelerini her geçen gün. Aspire ve her besleme ile yüzen hücreler atın. </li><li> Olarak (genellikle haftada bir kez) ihtiyaç duyulan ek MEFS ekleyin. </li></ol>p &quot;&gt; ~ GÜN 20 <ol start="8"><li> Bir kez küçük koloniler yem hücreler insan embriyonik kök hücre (hESC) orta (DMEM/F12 içeren% 20 Knockout Serum Değiştirme,% 1 Temel Olmayan Amino Asitler, 100 mcM β-merkaptoetanol, 2 mM L-Glutamine 2 ml ile günlük, görünür , 100 ug / ml primocin ya da% 1 Pen / Strep ve 10 ng / ml bFGF). </li></ol> 4. Toplama ve IPSC Klonların Genişletme ~ GÜN 30 - 40 <ol><li> 12-plaka inaktive MEFS / iyi hESC orta 1 ml artı Stemolecule Y27632 (ROCK inhibitörü) 10 uM içeren önceden seeded bireysel kuyularda her koloni seçin. </li><li> Yalnızca hESC orta (hayır ROCK inhibitörü) 1 ml bundan sonra günlük hücreleri besleyin. </li></ol> 5. Pluripotency Markers için İmmünofloresan Boyama <ol><li> Boyama Millipore gelen kit &quot;ES Hücre Marker örnek Kiti&quot; kullanılarak ve üreticinin protokolü takip yapıldı. </li></ol> 6. INTEG eksizyonunominal STEMCCA Vektör <ol><li> Kaset yeniden programlanması eksizyonu Kre-IRES-Puro ifade vektörü ve transfeksiyon sonrasında 6 tarif edildiği gibi kısa puromisin seçim kullanılarak elde edilir. </li></ol>

<ol><li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li>
<li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li>
<li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34%28-%29+cells%2C+outweighing+the+contribution+of+CD34%28%2B%29+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, yeni toplanmış periferik kan birkaç mililitre izole edilen mononükleer hücreler insan iPSCs oluşturmak için STEMCCA lentiviral vektörünün kullanımı açıklanmaktadır. Protokol ayrıca uzak bir yerde alınan verici hücreleri kullanılarak, dondurulmuş zaman PBMC&#39;ler (buffy coat doğrudan elde), önemli pratik etkileri bir ayrıntı yeniden programlanması için de kullanılabilir. Yeniden programlama indüksiyonundan önce izole PBMC&#39;ler nükleer reprogramming daha makul hücrelerin sağlıklı çoğalan nüfus kılan kritik bi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp sodyum sitrat </td><td> BD Biosciences </td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 Kök Hücre Orta </td><td> Kalite Biyolojik </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> Nakavt Serum Değiştirme </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-am-2 </td><td></td></tr><tr><td> Kalem / Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Temel Olmayan Amino Asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> MP Biomedicals </td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 286-EP </td><td></td></tr><tr><td> Deksametazon </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES Hücre Marker Numune Seti </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

stemcca lentiviral vektör kullanma Çevresel blood İnsan İsteyerek pluripotent kök hücre Üretimi

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Dört transkripsiyon faktörleri, Oct4, Klf4 ve ektopik ekspresyonu ile, Sox2 ve cMyc, insan somatik hücre sözde indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSCs) 1-4 üreten, bir pluripotent durum için dönüştürülebilir. Hastaya özel iPSCs embriyonik kök hücreler (EKH) çevreleyen ve olası immün red baypas edecek etik kaygılar yoksundur. Böylece, iPSCs hastalığı modelleme çalışmaları, farmakolojik bileşikler tarama ve rejeneratif tedaviler 5 için oldukça dikkat çekmiştir. Bu Yamanaka faktörler 6 kodlayan bir tek vergilendirilebilir polisistronik lentiviral Kök Hücre Kaseti (STEMCCA) kullanılarak farklı akciğer hastalıkları olan hastalardan alınan transgeni içermeyen insan iPSCs üretimi göstermiştir. Bu IPSC çizgiler deri fibroblastları, yeniden programlanması için en yaygın olarak kullanılan hücre tipinden elde edildi. Normal olarak, fibroblastlar elde hücrenin genişlemesi punch biyopsi ardından bir cilt gerektirirBirkaç pasajlar için kültür s. Önemli olarak, grup halinde iPSCs 7-9, insan periferik kan hücrelerinin yeniden programlanması bildirilmiştir. Bir çalışmada, STEMCCA vektörünün bir Tet indüklenebilir versiyon kan hücreleri eşzamanlı olarak ters tetrasiklin Transaktivatörü kodlayan bir yapısal olarak aktif lentivirüs ile enfekte edilmesi için gerekli olan, 9 kullanılmıştır. Fibroblastlar tersine, periferik kan hücrelerinin büyük ölçüde hastanın rahatsızlık ve sıkıntı azaltarak, minimal invazif yoluyla toplanabilir. Kurucu bir tek vergiye tabi vektör kullanarak kan hücreleri yeniden programlama için basit ve etkili bir protokol daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknolojisi uygulama hızlandırabilir. Bundan başka, periferal kan hücrelerinin yeniden programlanması deri biyopsileri kaçınılmalıdır (örn. Anormal yara) ya da bağlı olarak önceden var olan hastalık durumlannın preventi için gereken bireyler dan iPSCs üretilmesine olanak tanırpunch biyopsi için ng erişim. Burada yapısal 4 faktörleri ifade eden bir tek floxed-vergiye tabi lentiviral vektörü kullanılarak periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) insan iPSCs üretimi için bir protokol göstermektedir. Yeni toplanmış ve çözülmüş olan PBMC STEMCCA lentivirüs ile transdük önce olduğu gibi ortam içeren askorbik asit, 10,11 tarif 9 gün, SCF, IGF-1, IL-3 ve EPO için genişletilir. Hücreler daha sonra MEFS üzerine kaplanır ve ESC gibi koloniler iki hafta sonra enfeksiyon canlandırılabilir. Son olarak, seçilen klonlar genişletildi ve pluripotency işaretleri SSEA-4, Tra-1-60 ve Tra-1-81 ekspresyonu açısından test edilmiştir. Bu protokol kan kolayca erişilebilir 4 ml insan iPSCs üretimi için güvenilir bir yöntem sağlayan, basit, güçlü ve son derece tutarlıdır.

Tek bir lentiviral vektörü kullanılarak, insan PBMC&#39;leri iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Şekil 1A protokol şematik bir temsilini gösterir. Kan BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp sodyum sitrat ile toplanır ve santrifüj sonrasında, mononükleer hücreler polyester jel ve plazma (buffy coat) (Şekil 1B) arasındaki arayüz alınabilir. İzole PBMC&#39;ler sonra 9 gün boyunca kültürü yayılmaktadır. Şekil 2 hücreleri belirgin bölünmesi oldu...

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Dört transkripsiyon faktörünün (Oct4, Klf4, Sox2 ve cMyc) ektopik ekspresyonu aracılığıyla, insan somatik hücreleri pluripotent bir duruma dönüştürülebilir, ...

Bu protokol, dört mililitre periferik kandan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini göstermektedir. Sıfırıncı günde, periferik kan örneğinden mononükleer hücreleri izole edin ve genişletin. Primer hücreleri yeniden programlama kök ko-vektörü ile transdüse edin.Dokuzuncu günde, transduce edilmiş hücreleri inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları üzerine ekimi gerçekleştirin ve yaklaşık üç hafta boyunca kültüre edin. Ekspansiyon ve karakterizasyon için HESC benzeri kolonileri seçin. SSEA-4, TRA-1-60 ve TRA-1-81 gibi pluripotensi belirteçlerinin ekspresyonuna yönelik immünofloresan boyama sonuçları.İndüklenmiş insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde üretimini gösterin. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri üretmek için kök hücre antiviral vektörünün kullanımı, mevcut diğer yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Belki de en çekici olanı, donör dokusuna kolay erişim gerektirmesi —bu noktada kolayca elde edilebilen periferik kan örneklerini kastediyorum— nedeniyle yaklaşımın genel basitliğidir.Bu yöntemin en önemli özellikleri, yeniden programlama verimliliği ve elde edilen IPS hücre klonlarının kalitesidir. Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Andrea January Summer ve George Murphy'nin laboratuvarındaki lisansüstü öğrencisi Sarah Rozellele gerçekleştirecektir. Hepsi sıfırıncı günde.Sodyum sitrat içeren bir vakuteyner hücre hazırlama tüpüne dört mililitre periferik kan çekin. Tüpü, kan alımından sonraki iki saat içinde sekiz ila 10 kez altüst ederek karıştırın. Mononükleer hücreleri toplamak için örneği oda sıcaklığında 1, 800 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Plazmayı aspire ederek uzaklaştırın ve jel bariyeri ile plazma arasındaki hücre tabakası olan buffy coat'u pipetle çekin. Buffy coat'u steril 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve toplam hacmi steril PBS ile 10 mililitreye tamamlayın. Tüpleri birkaç kez altüst edin ve 300 G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Hücre peletini 10 mililitre steril PBS içinde yeniden süspanse edin, hücre sayımı gerçekleştirin ve ardından 1 ila 2 x 10⁶ hücreyi steril 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri santrifüjasyonla toplayın ve peleti iki mililitre genişletme medyumunda yeniden süspanse edin. Ardından, izole edilen mononükleer hücreleri 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna ekimleyin ve 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında kültüre edin.Kalan hücreleri santrifüj ile toplayın ve üçüncü ve altıncı günlerde, %10 DMSO içeren FBS içinde şişe başına yaklaşık iki x 10⁶ hücre olacak şekilde stoklar dondurun. Hücreleri steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yapışık hücreleri toplamak için kuyucuğu bir mililitre QBSF 60 kök hücre besiyeri ile bir kez yıkayın.Hücreleri santrifüj ederek hasat edin ve hücre peletini iki mililitre em içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücre süspansiyonunu 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve dokuzuncu günde kültürü inkübatöre geri koyun. Hücreleri steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yapışmış hücreleri toplamak için kuyucuğu bir mililitre QB SF 60 kök hücre medyumu ile bir kez yıkayın; kültürü 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, hücre peletini, bir ila 10 MOI için mililitrede beş mikrogram poly brain ve STEM lentivirus içeren bir mililitre taze EM içinde yeniden süspande edin. Daha sonra süspansiyonu 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve 25 °C'de 90 dakika boyunca 2.250 RPM'de santrifüjleyin. Toplam iki mililitre EM elde etmek için, mililitrede beş mikrogram poly brain içeren ek bir mililitre taze EM ekleyin ve plakayı 10. günde hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Hücreler daha önce gösterildiği şekilde hasat edildikten sonra, hücre peletini iki mililitre EM kültüründe tekrar süspanse edin. 11. günde, 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğundaki transduksiyona uğramış hücreler için, altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarını %0,1 jelatin ile kaplayın, ardından inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastlarını meth medyumunda kuyucuk başına iki x 10⁵ hücre olacak şekilde ekleyin. Enfeksiyon başına üç kuyucuk hazırlayın.Ertesi gün, daha önce gösterildiği gibi transduse edilmiş mononükleer hücreleri hasat edin. Santrifüjasyonun ardından hücre peletini, BFGF, askorbik asit ve büyüme faktörleri içeren üç mililitre meth medyumunda yeniden süspanse edin.Şimdi MES plağındaki her kuyucuktan bir mililitre MC'li OFM medyasını aspire edin. Ardından 1,5 mililitre tamamlanmış meth medyası ekleyin ve plağı 25 °C'de 30 dakika boyunca 500 RPM'de santrifüjleyin. Daha sonra, 14. günden itibaren iki gün boyunca 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında kültüre edin.Besiyerini, her iki günde bir, 10 ng/mL BFGF ve 50 µg/mL askorbik asit içeren ancak büyüme faktörü içermeyen 2,5 mL meth besiyeri ile yenileyin. Yaklaşık 20. günde, küçük kolonlar göründüğünde, 30. ve 40. günler arasında hücreleri her gün iki mililitre insan embriyonik kök hücre besiyeri ile besleyin. Her bir kolonu seçin ve bir mililitre HESC besiyeri ile ROCK inhibitörü içeren inaktive edilmiş maths ile ön işlem görmüş 12 kuyucuklu bir plağın ayrı kuyucuklarına aktarın; hücreleri günlük olarak besleyin.Ardından, rock inhibitörü içermeyen bir mililitre HESC medyumu ile, insan monosit türevli pluripotent kök hücreleri artık pluripotens belirteçlerinin immünofloresan boyaması ve ayrıca entegre yeniden programlama kasetinin çıkarılması için hazırdır. Bu protokol sırasında hücreler, P BMC'lerden insan iPSC üretimine kadar çeşitli morfolojik değişiklikler geçirir. Sıfırıncı günde, periferik kandan izole edilen mononükleer hücreler dokuz gün sonra genişletme medyumunda kültüre edilir.Hücrelerin sağlıklı olduğu ve transdüksiyon öncesinde çoğaldığına işaret eden, hücre kümeleri şeklinde üzüm salkımlarına benzer yapılar gözlemlenir. Hücrelerin MA'lara ekilmesinden yaklaşık 21 gün sonra koloniler oluşur. 30. günde, iPSC kolonileri tipik insan embriyonik kök hücresi benzeri morfoloji sergiler.PBMC'lerden üretilen iPSC'lerin bu immünofloresan analizi, pluripotens belirteçleri SSEA-4, TRA-1-60 ve TRA-1-80 ekspresyonunu göstermektedir. iPSC'ler ayrıca alkali fosfataz için pozitif boyanma göstermektedir. Bu görüntüler, Summers ve ark. 2010'da açıklandığı üzere, CRE rekombinaz ve bir purimisin direnç geni eksprese eden bir plazmid ile transfeksiyon yoluyla transgen içermeyen iPSC'lerin üretilme adımlarını göstermektedir; transfeksiyon öncesindeki iPSC'lerle karşılaştırıldığında hücre ölümü gözlemlenmektedir.İki günlük purmisin seleksiyonunun ardından, transfeksiyondan yaklaşık 10 gün sonra dirençli hücrelerden yeni koloniler oluşur; seçilen koloniler üzerinde yapılan Southern blot analizleri, transgenin eksize edildiğini doğrular. 1, 3, 5 ve 7. şeritler, eksize edilmeden önceki iPSC klonlarında transgenin varlığını göstermektedir. Transgenin eksize edilmesinin ardından 2, 4, 6 ve 8. şeritlerde bu bantlar görülmez. Bu videoyu izledikten sonra, herhangi bir bireyden alınan az miktardaki periferik kandan, yüksek kaliteli, normal veya hastalığa özgü insan iPS hücrelerini tutarlı ve güçlü bir şekilde üretebilmeniz gerekir.Bu yaklaşım, rep programlama sürecini basitleştirerek onu kök hücre topluluğu için yaygın olarak erişilebilir kılar. Aynı zamanda, daha homojen kök hücre hattı popülasyonlarının oluşturulması için bir temel sağlar.

generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için bir protokol öneriyoruz. Transdüksiyon kan hücrelerini santrifüjleme ile matris kaplı plakalara kaplayarak, iPSC'ler yüzen hücrelerden başarılı bir şekilde indüklenir. Bu teknik, PBMC'ler ve CBMC'ler gibi hücreler için basit ve etkili bir yeniden programlama protokolü önerir.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Öğrenin, çevresel kan örneklerinden tek bir lentiviral vektör kullanarak insan iPS hücreleri üretme yöntemini. Bu protokol, kök hücre teknolojisini araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirir.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Daha fazla video keşfet