Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücresel davranışları karakterize etmek için eis olarak bilinen elektrik hücresi substrat empedans algılamasını kullanmaktır. Bu, bir dizi halinde elektrotlar üzerinde hücrelerin büyütülmesi ve endotel bariyeri oluşumunu, olgunlaşmasını ve elektriksel yaralama ve uyarıcıların eklenmesi gibi fonksiyon manipülasyonlarını ölçmek için farklı modlarda ölçümler alarak elde edilir, daha sonra hücre hareketliliğini ve bariyer fonksiyonunu test etmek için yapılır. Hücre bağlanması, proliferasyonu, migrasyonu, endotel geçirgenliğinin tespiti ve hücre, hücre ve hücre substrat temaslarının esis temelli değerlendirilmesini tanımlayan sonuçlar elde edilir.

Bu yöntem, kantitatif verilerin çevrimiçi olarak üretilmesini sağlamak, hücreleri standart hücre kültürü koşullarında doğal birleşme durumlarında karakterize etmek gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, altta yatan teori karmaşık göründüğü ve bir deneye başlamadan önce birkaç temel hususun farkında olmanız gerektiği için mücadele eder. Başlamak için, elektrot kaymasını önlemek, tekrarlanabilirliği iyileştirmek ve sinyal gücü oranını artırmak için diziler temizlenmeli ve stabilize edilmelidir.

Bu nedenle, 15 dakika sonra sekiz kuyulu bir dizinin her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre 10 milimolar EL ine ekleyin Oda sıcaklığında, EL sistinini fosfat tamponları değil, iki ultra saf su yıkaması ile çıkarın. Ayrıca, protein emilimini engelleyebileceğinden, kaplamadan önce elektrotları serum içeren solüsyonlara maruz bırakmayın. Daha sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre ısıtılmış% 1 jelatin ekleyin ve diziyi 37 santigrat derecede yarım saat inkübe edin.

Jelatini çıkarmak için ultra saf su kullanın ve elektrot yüzeylerinin kurumasına izin vermeyin. Daha sonra kuyucukları artık serum içerebilen 400 mikrolitre tam kültür ortamı ile doldurun. Diziyi tutucuya yükleyin.

Dokuz altın kareyi kontrol edin. POGO pinleri ile iletişime geçmelidirler. Bilgisayardaki ayar vidasını sıkarak diziyi elinizle dikkatli bir şekilde yerine sabitleyin.

Ölçüm yazılımını açın. Ayarla'ya basın ve ardından 4.000 hertz'lik varsayılan frekansta her bir kuyucuğun hızlı empedans ölçümünü gerçekleştirmek için veri toplama bölümünün altını kontrol edin. Değerler yorumlar bölümünde saklanacaktır.

Kontrolün, dizi diyagramındaki kuyu yapılandırma bölümü altında kullanılan EIS dizisinin türünü doğru bir şekilde seçtiğinden emin olun. Kırmızı ve yeşil, bağlantıların işlevselliğini gösterir. Temizleme ve kodlama başarılı olduysa, sekiz W bir E sistem dizisi yaklaşık beş ila altı NANOFARAD ve sekiz W 10 E dizisi kaydetmelidir.

Hücre tohumlamadan önce 50 ila 60 nanofarad taban çizgisi direnci bu nedenle yaklaşık 2000 ohm'dur. Verileri RB alpha ve cm kullanarak modellemek için, orta başarısız diziyle bir MFT kaydı başlatın. 15 dakikalık hücresiz veri alın ve hücreleri eklemek için deneyi bitirin.

Şimdi diziyi çıkarın ve her bir kuyucuğa 400 mikrolitre tek hücreli süspansiyon tohumlayın. Hücre büyüme tohumlarını incelemek için, santimetre kare başına 10.000 hücre, santimetre kare başına 60.000 hücre ile başlamak için neredeyse birleşik bir popülasyon tohumu ile. Diziyi tutucuya yükledikten sonra, kuyu konfigürasyonu bölümünün altında, ölçülecek kuyuları seçin.

Ardından veri toplama seçeneklerine gidin ve sabit bir frekansta bir zaman serisi için bir ölçüm modu seçin, SFT'yi seçin ve elektrot kapsamını ölçmek için ölçüm frekansını seçin ve RB ve alfa'yı modelleyin, MFT'yi seçin ve cihaz otomatik olarak ölçüm yapacaktır. Ölçümü mümkün olduğunda çoklu frekans modunda çalıştırın. Bu, mevcut tüm frekanslarda veri gerektirir ve bu nedenle çoğu içgörüyü sağlar.

Mikro hareket analizi için RTC'yi seçin ve örnekleme frekansını ayarlayın. Standart zamansal çözünürlük bir hertz'dir, ancak empedanstaki hızlı değişiklikleri izlemek için artırılabilir. Z teta için değer 25 hertz'e yükseltilebilir.

Mikro hareketi birçok kuyudan sırayla ölçmek için yardım menüsünü seçin. Ardından, uzman araç çubuğu menü öğelerini göster'i seçin ve çok kuyulu RTC'yi edinin. Veri toplama bölümünde, zaman sınırını saat cinsinden belirttiğinizden emin olun.

Bu ayarı kullanırken, yazılım, veri alımı başlatıldıktan sonra döngü sayısını isteyecektir. SFT veya MFT kullanarak veri toplarken, saniye cinsinden belirtilen ölçümler arasındaki zaman aralığını seçin. Maksimum veri alımı için bu seçeneği işaretlemeden bırakın.

Şimdi başlat düğmesine basın ve verilerin nerede saklanması gerektiğini belirtin. Bitir düğmesine basılarak çalışma durdurulur. Duraklat düğmesine bastığınızda veri alımı duracak, ancak deney saati çalışmaya devam edecektir.

Şimdi diziyi çıkarın ve laminer bir akış başlığı altında kuyuları manipüle edin. Diziyi tutucuya geri döndürdükten sonra, elektrik bağlantılarını doğrulamak için Bağlantıyı kontrol et'e tıklayın ve ardından veri toplamaya devam etmek için deneye devam edin. Manipülasyondan sonra hücrelerin steril olması gerekmiyorsa, trombin gibi bir uyaran veri toplama sırasında doğrudan bir kuyuya eklenebilir.

Tanıtılan bu tür varyasyonlar, işarete basılarak ve bir yorum eklenerek deneysel saat üzerinde işaretlenebilir. Diğer bir seçenek, hücreleri elektriksel olarak sarmaktır. Bunun için ayarlar, kısa yaralama süresine ulaşmak için biraz ince ayar gerektirir ve çok uzun süre etkili değildir ve elektrotlara zarar verebilirsiniz.

Yazılımın sağladığı varsayılan ayarlarla başlayın ve oradan devam edin. Yara elektro geçit töreni kurulum bölümüne gidin ve yarayı etkinleştirin. Şimdi kuyu konfigürasyonu altında sarılacak kuyuları seçin.

Sadece kontrol edilen kuyular yaralanacaktır. Etkinleştir'e tıklamak, yaralamayı istemek için bir açılır pencere açar. Yaraladıktan sonra, sinyalin neredeyse hücresiz bir elektrot değerine düştüğünü kontrol edin.

Verilerle çalışmak için genellikle yaralamayı tekrarlamadıysa, verileri dışa aktar seçeneğini kullanın ve Excel'i seçin. Bununla birlikte, RB ve alfa modellemesi, yazılım içinden yapılabilir. MFT verilerinden, modellemenin yalnızca birleşim hücresi katmanlarında geçerli olduğunu unutmayın.

Ve hücresiz referansı eklemeyi unutmayın. Frekans taraması, modelleme ve analiz bölümü altındaki bul işlevini kullanarak hücresiz bir referansı otomatik olarak seçerek başlayın. Set ile değeri kabul edin.

Ardından, hesaplamaları başlatmak için modele basın. Bu işlem birkaç dakika sürerse paniğe kapılmayın. Tipik bir deney sırasında, hücreler bir büyüme aşamasından bir plato aşamasına geçer.

Birleştiklerinde, bu işlem sırasında görüntüler doğrudan elektrottan elde edilir. Bir sonraki aşama, EC bariyerinin oluşumu ve olgunlaşmasıdır. Elektrik yaralanması daha sonra hücre göçünü incelemek için kullanılır.

Sinyalin taban çizgisine karakteristik bir düşüşünü, birleşme durumunun yeniden kurulması takip eder. Son olarak, uyaranlara verilen yanıt gerçek zamanlı olarak takip edilir. Buraya vazoaktif ajan trombin uygulandı.

Bu, hücresel kasılmaya ve dolayısıyla bariyerde küçük boşlukların geçici olarak açılmasına neden oldu, bu da empedans direncinde bir düşüşe neden oldu ve kapasitans ölçümleri, en hassas ölçümde hücre yapışması ve büyüme direnci hakkında ücretsiz bilgi verir. Frekans, hücre bariyerinin kalitesini ve işlevini temsil eder ve paraselüler ve hücreler arası Akım akışına karşı direnci dikkate alır. Hücreler elektrotlara bağlandığında, akım akışını kısıtlarlar ve kapasitans orantılı olarak düşer.

Bu faz, elektrot kapsamının genel bir ölçümünü sağlar ve en iyi şekilde 40 kilohertz'den daha yüksek bir frekansta kapasitans kaydedilirken ölçülür. Direnç, iyi hücrelerin akım akışını nasıl engelleyebileceği ve dolayısıyla hücre bariyerinin kalitesi hakkında net bir fikir verir. Bu nedenle, farklı geçitlere ve farklı tiplere sahip hücreler farklı dirençlere sahiptir.

RB ve alfa, hücre hücresi ve hücre matrisi adezyonları arasında ayrım yapmaya yardımcı olur. RB, hücre hücresi temaslarının akım akışına direnci veya geçirgenliğin ters bir ölçümüdür. Alfa, hücre elektrot bağlantılarından gelen empedans katkıları için bir ölçüdür.

RB ve alfa değerlerinin her ikisi de ISIS yazılımı içinden hesaplanabilir. Direnç sinyalindeki küçük dalgalanmalar, birleşme hücresi katmanındaki ince hareketlerden veya mikro hareketten kaynaklanabilir. En hassas frekansta bir E dizisi ile ölçülebilir ve EIS'ler içinde hızlı Fourier dönüşümü ile analiz edilebilirler, hücresel davranış hakkında bilgi veren yazılım manipülasyonları hassas bir şekilde yapılabilir.

Örneğin, hücre göçünü incelemek için birkaç saat içinde kapanacak 250 mikronluk bir elektrik yarası yapmak mümkündür. Empedans spektroskopisi, eklenen maddelerin etkisini analiz etmek için de çok uygundur. Daha önce belirtildiği gibi, trombin, ARO kinaz inhibitörü ile bazal hücre gerginliğini düşürerek hücre bariyerini hipergeçirgen hale getirir, trombinin etkisi azaltılabilir Bu prosedürü denerken, ESIS'in hücre ortamındaki sıcaklık, pH, orta tükenme vb. gibi değişikliklere karşı son derece hassas olduğunu hatırlamak önemlidir.

Geliştirildikten sonra. Bu teknik, bilim alanındaki araştırmacıların, vazoaktif ajanların birleşme hücre kültürleri üzerindeki eğilimlerini ve etkilerini gerçek zamanlı olarak incelemelerinin yolunu açtı.