Name: Voksellerden Gönderen Bilgi için: Kompleks Elektron Mikroskopi 3D-Data Bölümlere Göre Pratik Rehber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Öğrenin, karmaşık 3D elektron mikroskobu verilerinden özellik çıkarımı için manuel ve otomatik segmentasyon yöntemlerini. Bu rehber araştırmacılara en uygun yaklaşımı seçme konusunda yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

University of California San Francisco'dan Tom Goddard'a Chimera'ya sonsuz yardımları için, Gatan, Inc.'den Joel Mancuso ve Chris Booth'a bakteri veri setinin SBF-SEM veri toplamasına yardımcı oldukları için, Zeiss, Inc.'den Doug Wei'ye epitel hücre veri setinin FIB-SEM veri toplamasındaki yardımları için teşekkür etmek ve teşekkür etmek isteriz. Numune hazırlama, TEM görüntüleme ve tomografi konusunda tavsiyeler için California Üniversitesi Berkeley Elektron Mikroskobu Laboratuvarı'ndan Kent McDonald, kriyo-TEM görüntüsünün alınmasına yardımcı olduğu için Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı'ndan Roseann Csencsits, bitki veri setinin kriyo-kesiti için Elena Bosneaga, utrikül dokusunun diseksiyonu için Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nden Jocelyn Krey, Ulusal Enerji Araştırmaları Bilimsel Hesaplama Merkezi'nden (NERSC) David Skinner ve University of Üniversitesi'nden Jitendra Malik Yazılım altyapısı konusundaki tavsiyeleri için California Berkeley'e ve California Berkeley Üniversitesi'nden Pablo Arbelaez'e bu makalede sunulan özel olarak uyarlanmış komut dosyasına yaptığı kod katkıları için. 
Araştırma, ABD Enerji Bakanlığı, Bilim Ofisi tarafından sözleşme numarası altında desteklenmiştir. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner] ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe No. P01 GM051487 [MA] iç kulak kıl hücresi projesi ve mikroskopi enstrümantasyon kullanımı için.

1. Manuel Düsünce Modeli Üretimi Not: metodolojisinin detayları aşağıda açıklanan Chimera özeldir, ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. Tek amacı yerine nesnelerin hacim şeklinde görüntüleme, geometrik ölçümleri yapmak için bir geometrik model (örneğin, bir top ve çubuk modeli) oluşturmak için, bu yaklaşımı kullanarak. <ol><li> Manuel soyutlanmış model üretimi için uygun bir programa veri hacmi aktarın. <ol><li> Dosya&gt; Aç Haritası Dosya Aç iletişim kutusunu kadar çekin. Istenen haritanın dosya konumuna gidin. </li><li> Farklı render stilleri ile verileri görüntülemek için Volume Viewer (Araçlar&gt; Ses Verileri&gt; Volume Viewer) seçin ve Özellikler&gt; Ekran Stil yukarı çekin. </li><li> Volume Viewer histogramı dikey çubuğunu sürükleyerek ekran için eşik ayarlayınpenceresi. </li></ol></li><li> 3D hacim gezinin (örneğin, dilim dilim) segmentasyon için ilgi alanı seçin ve gerekirse daha küçük alt-hacmini kırpmak için. <ol><li> Volume Viewer iletişim, Axis &#39;i tıklatın, sonra da X, Y, Z veya seçin. </li><li> Volume Viewer iletişim kutusunda,&gt; Planes Özellikler seçeneğini seçin. Soldaki kutuda numaraya karşılık gelen uçağı görüntülemek için Derinlik ayarlamak için One tıklayın ve tüm uçakları görüntülemek için Tümü öğesini tıklatın. </li><li> Volume Viewer iletişim kutusunda seçin Özellikler&gt; Altbölgesi seçimi. <ol><li> Tıklayın ve ilgi bölgenin çevresinde dikdörtgen bir kutu oluşturmak için sürükleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Ilgilenilen özellik işaretleri de yerleştirin ve modeli tamamlanana kadar (genellikle program tarafından otomatik olarak yapılır) uygun bağlayıcılar ile bağlayın. <ol><li> Volume Viewer menü çubuğunda, Araçlar&gt;Ses Tracer iletişim Ses Tracer iletişim kutusunu açmak için. Ses Tracer iletişim kutusunda,&gt; Yeni Marker Set dosya seçin. </li><li> Ses Tracer iletişim kutusunda, veri uçaklar Mouse&gt; yüksek kalite Yer belirteçleri, Yer belirteçleri kontrol ettirin ve işaretçileri yeniden boyutlandırma, Bağlantı yeni bir işaretleyici seçilen işaretleyici ve Bağlantı ardışık işaretçileri seçilir. </li><li> Marker Renk örneğini tıklatın ve bir renk seçin. Bağlantı rengi için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Işaretleyici ve bağlantı model yapı elemanları için yarıçaplarından girin. </li><li> Ses Tracer Penceresinde, [sağ] fare düğmesini kullanarak Yer belirteçleri seçin ve belirteçler ve bağlantılar için yarıçapları yerleştirin. </li><li> Sağ işaretçileri koyan başlamak için hacim verilerine tıklayın. İşaretleyiciler otomatik olarak bağlanacaktır. </li><li> Ses Tracer iletişim kutusunda, Dosya&gt; Geçerli işaretleyici kümesini kaydedin, ardından&gt; Kapat işaretleyici seti Dosya. </li></ol></li&gt; <li> Ilgi istenilen ikinci özelliği haline bir model oluşturmaya başlamak için yeni bir belirteç kümesi (Adım 1.3.1) açın. Özellikleri farklılıkları vurgulamak için işaretleyici setleri arasındaki kontrast renkler yararlanın. </li></ol> İlgi Özellikleri 2. Manuel Takip Not: metodolojisinin detayları aşağıda açıklanan Amira özeldir, ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. Nüfus yoğunluğu nispeten küçük ve özellik çıkarımı doğruluğu çok önemlidir zaman, manuel izleme gibi zaman alıcı bir yaklaşımdır bu yaklaşımı kullanın. <ol><li> Manuel izleme seçenekleri ile bir programa İthalat hacmi verileri. Bu yeteneği ile yazılım genellikle en azından temel bir fırça aracı sunuyoruz. <ol><li> Büyük hacimler veya tomogramları (örneğin, 16-bit 2.048 x 2.048 veya daha büyük rec veya imod içinde mrc oluşturulan tomografi): Seç Open Data&gt; filename.rec&gt; Format sağ tıklayın ...&gt; LargeDiskData olarak Raw seçin </i&gt;&gt; Tamam&gt; Yük. Tamam&gt; başlık bilgisinden uygun Ham Veri Parametreleri seçin. Yeni gibi açar ve katılım <a href="http://filename.am/">filename.am</a> aşağıdaki adımlarda kullanılmak için bir dosya. </li><li> Küçük 3D görüntü yığını dosyalar (örneğin, 3D .tif veya mrc veya REC): Açık Veri&gt; seçin filename.tif veya filename.mrc. Geçiş Kaydet Sağ Tıklama&gt; <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . Bir hata üretilen veya program yanıt vermiyorsa ise, dosya çok büyük olabilir ve Adım 2.1.1 izleyerek açılabilir. </li></ol></li><li> Segmentasyon için bir 3D alt birimini seçmek için dilimler gezinmek ve daha sonra bu ilgi alanında kırpmak. <ol><li> 3D Görüntüleyici penceresinde, resim dosyasını açmak için Orthoslice seçin. Dilimleri arasında gezinmek için alt kaydırma çubuğunu kullanın. </li><li> &gt; Havuz pencerede dosya adı geçiş, LargeDiskData olarak açılan büyük veri kırpmak için sağ&gt; LatticeAccess tıklatın. Enter istenen kutusu boyutu&gt; uygulayın. Yeni dosyayı kaydedin. </li></ol></li><li> Segmentasyon dosyası oluşturun. <ol><li> Sağ&gt; Etiketleme&gt; labelField tıklayınız&gt; Pool penceresinde dosyayı geçiş. Yeni bir dosya oluşturulur ve otomatik Segmentasyon Editör sekmesinde yüklenecektir. </li></ol></li><li> Ilgi ilk özelliği sınırını Trace, sonra elle veya kullanılan yazılım belirli bir komut kullanarak iz doldurun. Tüm dilimlerde ilgi özelliğini izleyin ve manuel izleme segmentasyonu tekrarlayın. Amira kullanarak aşağıdaki komutları kullanın: <ol><li> Boya Fırçası aracını kullanmak için, istediğiniz gibi, daha sonra ilgi özelliğinin sınırını izlemek için fare işaretçisi kullanabilirsiniz fırça boyutunu değiştirmek. </li><li> Kısayol &quot;f&quot; ile takip alanını doldurun. Artı sembolü, ya kısayol &quot;a&quot; ile butonuna tıklayarak seçimini ekle. Gerekirse, basın &quot;u&quot; geri almak için, ve çıkarma ya da silmek için &quot;s&quot;. </li></ol&gt; </li><li> Görselleştirme ve temel kalitatif veya yazılım kullanım kılavuzu talimat başına kantitatif analiz için yüzey render oluşturmak. <ol><li> Object Pool sekmesinde, sağ&gt; SurfaceGen tıklayın&gt; Pool pencerede dosya-labels.am geçiş. </li><li> Uygula&gt; İstediğiniz Yüzey özelliklerini seçin. Yeni bir dosya filename.surf Havuz oluşturulur. </li><li> &gt; Sağ tıklayın&gt; Havuz pencerede filename.surf geçiş, SurfaceView segmentli hacmini görselleştirmek için. </li><li> Taşımak, döndürmek ve 3D hacmindeki yakınlaştırmak için 3dviewer penceresinde araçlarını kullanın. </li></ol></li><li> Tam yoğunlukları ayıklayın ve bu hacim veya yüzey alanı olarak ölçülerini belirlemek. Daha gelişmiş görüntüleme, analiz ve simülasyon için diğer programlara ihracat. <ol><li> 3dviewer penceresinde, uygun seçeneği (2D uzunluğu ve 2D açısını ölçümler için tek bir 2D düzlemde, 3D uzunluğu ve 3D Açısı seçin&gt; Ölçü aracını tıklayın3D birimde ölçümler için). </li><li> İstenilen uzunluk, mesafe ve açıları ölçmek için örgü yüzey tıklayın. Değerler Properties penceresinde listelenir. </li></ol></li></ol> 3. Otomatik Yoğunluk tabanlı Segmentasyon Not: metodolojisinin detayları aşağıda açıklanan Amira özeldir, ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. <ol><li> Ilgi yoğunluklarını çekilme kontrast, canlılık, ya crowdedness herhangi çeşitli veri setleri bu yaklaşımı kullanın. </li><li> Otomatik segmentasyon için eşikleme, sihirli değnek, ya da diğer yoğunluk tabanlı araçlar ile donatılmış bir programa İthalat hacmi verileri. Manuel izleme için yönlerde 2.1-2.1.2 özetlenen adımları izleyin. </li><li> Dilimleri arasında gezinmek ve segmentasyon için alanı seçin. Gerekirse, segmentasyon için küçük bir 3D alt hacme mostra. Manuel izleme için yönlerde 2.2-2.2.2 özetlenen adımları izleyin. </li><li> Yoğunluğunu seçmekBir ilgi bir özellik, genellikle tıklayarak veya özelliği bir işareti veya çapa noktasını koyarak. Yazılım izin veriyorsa, özelliğin piksel yoğunluğunu kapsayan bir sayı aralığı girin ve istediğiniz gibi bu toleransı ayarlamak. Özelliği ait yoğunlukları Çapa&#39;nın piksel veya tolerans değeri yoğunluğuna göre alınacaktır. Amira kullanırken aşağıdaki komutları kullanın. <ol><li> Ayırt marjları ile özellikler için Magic Wand Tool kullanın. <ol><li> Ilgi alanı tıklatın, ardından özellik tam vurgulanır, böylece değerlerin doğru aralığı yakalamak için Ekran ve Gizlemenin sürgüyü ayarlayın. Kısayol &quot;a&quot; ile seçimi ekleyin. </li></ol></li><li> Açıkça ayırt kenar boşluğu olmadan özellikler için Eşik Aracı&#39;nı kullanın. </li><li> Eşik simgesini seçin. Sadece ilgi özellikleri maskeli böylece arzu aralığında yoğunluğunu ayarlamak için kaydırma çubuğunu ayarlayın. Seç düğmesine tıklayın, ardından kısayol ile seçim eklemek220, bir &quot;. </li><li> Bölüm tüm hacim için, seçim eklemeden önce tüm dilim seçin. </li><li> Adaları ve / veya Segmentasyon&gt; Smooth etiketleri&gt; gürültü seçin Kesimlemeyi Kaldırmak için. </li></ol></li><li> Manuel izleme bölümünde 2.6-2.6.2 açıklandığı gibi görselleştirme ve nitel analizler için bir yüzey oluşturur. İstenirse, yeterli 3D ekran, kantitatif analiz ve simülasyonlar için diğer programlara ihracat. </li></ol> 4. Özel tasarlanmış Otomatik Segmentasyon Not: Büyük bir birimden kesin bir yoğunluk model oluşturmak için yeteneği bilgisayar bilimi arka plan tecrübe gerektirir, ama sağlayan otomatik segmentasyon için özelleştirilmiş komut dosyaları oluşturmak için bu yaklaşımı kullanın. <ol><li> Araçlar (MATLAB 27 Shape-denetimli Bölümlemenin Özel Örnek) <ol><li> Görüntü ön-işleme: gerçekleştirin de-noising, arka plan çıkarma ve görüntü geliştirmeAşağıdaki hattını kullanarak: <ol><li> Imread komutunu kullanarak görüntüyü yükleyin. <ol><li> Komut satırında, girin: &gt;&gt; im = imread $ image_path analiz edilecek görüntünün konumu ($ image_path). </li></ol></li><li> Görüntü İşleme Araç kutusundan, bir tahmini veya bilinen Gürültü-güç-sinyal oranı (NSR) kullanılarak Wiener Filtre diyoruz. </li><li> Önce işlenen görüntüsünde, daha sonra, arka plan katmanı tahmin etmek imopen görüntü açma işlevini çağırmak farklı bir maske olarak sonucu ayrılamadı. <ol><li> Komut satırı girin:. &gt;&gt; Plan = imopen (im strel ($ shape_string $ boyutu)), bu yöntemde, $ shape_string boyutu analiz cihazı tarafından verilen değişken $ &#39;disk&#39; eşittir, yani &gt;&gt; background = imopen (im strel (&#39;Disk&#39;, 15)). </li></ol></li><li> Arka plan ile filtre görüntü çıkarın. <ol><li> &gt;&gt; IM2 = - im: komut satırında girinarka plan </li></ol></li><li> Sonuçlarının kalitesine bağlı olarak, birlikte ya da Görüntü İşleme Toolbox fonksiyon imadjust kullanılarak çağrılabilir uyarlanabilir Otsu yöntemiyle 28 olmadan, görüntü normalleştirme gerçekleştirin. <ol><li> Komut satırında, girin: &gt;&gt; IM3 = imadjust (IM2) </li></ol></li><li> Normalize görüntü kırpma ilgi bölgeleri sınırlayan, segmentasyon ilgi özelliklerini hazırlayın. <ol><li> Imtool komutunu kullanarak, kırpılmış için ilgi bölgeyi keşfetmek ve komuta koordinatları sağlar: vektör [x1 y1 x2 y2] tekabül &gt;&gt; im3_crop = imcrop (IM3, [x1 y1 x2 y2]), kare bölge kırpılmış olarak. </li></ol></li></ol></li><li> (Ilgi özellikleri arasında 2D görüntü lineer izlerini) nesnelerin her biri farklı bir kategori için belirli örnekler vererek algoritma eğitin: tanıma / Denetimli şekil sınıflandırma şekil. <ol><li> VLFEAT 29 API başarıyla yüklendiğini kontrol edin ve daha derinlemesine dokümantasyon için VLFEAT sitesini ziyaret edin. </li><li> Komut satırında girin: &gt;&gt; [AĞACI, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K $ NLEAVES) $ K kullanılacak kümenin numarasını veya gözlemci içine verileri düzenlemek istediği sınıfların sayısını, ve $ NLEAVES yaprak kümeleri istenen sayıda yani bir &gt;&gt; [AĞACI, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4.100) </li><li> VLFeat için girdi olarak elle segmente özelliklerini kullanın. NOT: Bu açık kaynak C tabanlı kütüphane veri setleri için iyi çalışmak için seçilen yöntemin türüne bağlı olarak piksel yama, yama kümeleme ve küme merkezi konumlandırma yapacak. Kullanılabilir seçenekler tabanlı texton için k-ortalama kümeleme aralığı 30 yaklaşımlar ve çıkış özellikleri verilen örnekli dayalı istenilen tanımlayan bir sayısal dizidir. </li></ol></li></ol></li><li> Segmentasyon: Bu fu kullanınLly rağmen hesaplama pahalı, otomatik, ileri görselleştirme ve analiz için ayrı ayrı haritalar olarak yazılmış olacaktır aynı anda nesnelerin segmenti birden fazla sınıflar, yaklaşım. <ol><li> Önce oluşturulan rakamı dizisi (model) yükleyin. </li><li> Bir girdi olarak bölütlenecek model ve görüntü kullanılarak, VLFeat içinde destek vektör makinesi (SVM) işlevini çağırın. <ol><li> Komut satırında, girin: &gt;&gt; x orijinal görüntü im2_crop kırpılmış ve y nesnel görüntü, elle segmente edilmiş görüntü olduğunu = vl_svmtrain (x, y, 0.1), [b, w]. Kümeleme tarafından oluşturulan etiketlere göre sonuçları renklendirmek için &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, ETİKETLER) kullanın. NOT: modelin özelliklerine dayanarak, VLFeat sınıfların sayısına baştan atanmış (faiz özelliklerini) görüntüyü sınıflandırmak. Istenilen doğruluk derecesine bağlı olarak, başka yaklaşımlar veya tahmin Clust ile bu yöntemi birleştirmek mümkündürBöyle gövde ve küme merkezleri olarak er parametreleri. SVM algoritmasının çıktı olasılıklı bir modeli ve yeni veri istenen sınıflarının çok ikili maskeler. </li></ol></li><li> &gt;&gt; $ Biçimi &#39;tiff&#39; olduğunu imwrite (im, $ biçimi, $ dosya) ve $ dosya çıktı dosyası için yolu: komutunu girerek sonuçları kaydedin. </li><li> &gt;&gt; Imshow (im): Görüntüleri görselleştirmek için, komutu girin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+cryo-microscopy+as+a+powerful+structural+tool+in+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine.</a> J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).</li>
<li>Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+two-dimensional+crystallization+trials+of+small+membrane+proteins+for+structural+biology+studies+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846(2010).</li>
<li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386(2013).</li>
<li>Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+HIV-1+capsid+assemblies+by+cryo-electron+microscopy+and+iterative+helical+real-space+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041(2011).</li>
<li>Chen, S., McDowall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Cryotomography+of+Bacterial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electron Cryotomography of Bacterial Cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943(2010).</li>
<li>Meyerson, J. R., White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770(2011).</li>
<li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+studies+by+electron+tomography%3A+from+cells+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li>
<li>Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+feature+extraction+and+visualization+of+tomographic+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging.</a> J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).</li>
<li>Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+3D+watershed+algorithm+incorporating+gradient+cues+and+object+models+for+automatic+segmentation+of+nuclei+in+confocal+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks.</a> Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).</li>
<li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+variant+of+the+watershed+transform+for+segmentation+of+electron+density+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps.</a> Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).</li>
<li>Rigort, A., Günther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).</li>
<li>Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Statistical+Approaches+to+Level+Set+Segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Integrating+Color%2C+Texture%2C+Motion+and+Shape.+International+Journal+of+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation.</a> Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).</li>
<li>Lin, Z., Davis, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-based+human+detection+and+segmentation+via+hierarchical+part-template+matching%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Pattern+Anal+Mach+Intell%22%5BJournal%5D)">Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+structure+modeling+from+3D+EM+using+VolRover+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0.</a> Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).</li>
<li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+focused+ion+beam+milling+techniques+for+TEM+specimen+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation.</a> Micron. 30 (3), 197-204 (1999).</li>
<li>Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li>
<li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focussed+ion+beam+milling+and+scanning+electron+microscopy+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588(2011).</li>
<li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+Ion+Beam+%28FIB%29+combined+with+SEM+and+TEM%3A+Advanced+analytical+tools+for+studies+of+chemical+composition%2C+microstructure+and+crystal+structure+in+geomaterials+on+a+nanometre+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Geology%22%5BJournal%5D)">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).</li>
<li>Frangakis, A. S., Hegerl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+reduction+in+electron+tomographic+reconstructions+using+nonlinear+anisotropic+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion.</a> Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).</li>
<li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).</li>
<li>Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+automatic+noise+reduction+of+electron+tomographic+reconstructions+based+on+iterative+median+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering.</a> Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>MathWorks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MATLAB%22">MATLAB</a>. , (2012).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22Systems%2C+Man+and+Cybernetics%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Vedaldi, A., Fulkerson, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVedaldi%2C+A+%22VLFeat%3A+An+Open+and+Portable+Library+of+Computer+Vision+Algorithms%22">VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms</a>. , (2008).</li>
<li>Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+Textons%3F%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">What are Textons?</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li>
<li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li>
<li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+cellular+%26+developmental+biology+journal+of+the+Tissue+Culture+Association%22%5BJournal%5D)">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li>
<li>Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li>
<li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li>
<li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Information+%26+Computational+Science%22%5BJournal%5D)">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

3D EM hacimleri ilgili özelliklerin çıkarılması için etkili stratejiler acilen son zamanlarda biyolojik görüntüleme vurdu veri tsunami yetişmek için ihtiyaç vardır. Veri saat veya gün içinde oluşturulabilir iken, derinlemesine 3D hacimleri analiz aylarca sürer. Bu nedenle, görüntü analiz bilimsel buluşlar için darboğaz haline gelmiştir açıktır; Bu sorunlar için yeterli çözümler olmadan, görüntüleme bilim adamları kendi başarısının kurbanı. Bu durum, aynı zamanda, yüksek veri karmaşıklığı ve tipik olarak proteinler ve protein kompleksleri sınır bir tane ve esas gri tonlama yoğunluklarda oluşan sürekli bir gradyan olarak görünür biyolojik hücrelerde bulunan yüksek moleküler kalabalık ötürüdür. Sorun numune hazırlama ve görüntüleme kusurları ile komplike, ve bazı durumlarda görüntü rekonstrüksiyonu eserler, önde gelen tam otomatik bir yaklaşım sorunlar oluşturabilmektedir mükemmel daha az hacimsel verilere edilires. En önemlisi, ancak, numune hazırlama, görüntüleme, ve biyolojik yorumlanmasında uzmanlar nadiren iyi hesaplamalı bilim usta, ve böylece etkili bir özellik çıkarma ve analiz yaklaşımı konusunda rehberlik gerektirir olmasıdır. Bu nedenle, çeşitli örnekler aracılığıyla, protokol segmentasyon verileri, yanı sıra manuel soyutlanmış modeli üretimi, otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon, ilgi özellikleri manuel izleme ve özel-uyarlanmış otomatik segmentasyon için adımlarını nasıl hazırlanacağını açıklar. Prosedür özetlenen manuel ve otomatik yaklaşımlar burada sözü bunlardan bazıları segmentasyon yazılımı, büyük bir çeşitlilik bulunabilir, ancak diğerleri benzer işlevleri yerine ve eşit derecede uygundur. Sonuçlar 3B bölütleme yaklaşımların her birinin etkinliği veri setlerinin her farklı tip için farklılıklar olduğunu göstermektedir. Hatta s farklı yaklaşımlar niteliksel üretilen olsaimilar 3D render nihai ürün olarak, zaman ve çaba miktarı önemli ölçüde değişmiştir segmentasyon işlemi sırasında her geçirdi. Uygun görüntü özellikleri ve segmentasyon başına yaklaşım kişisel amaçlar için öneriler ayrıca aşağıdaki dört alt bölümlerde açıklandığı Şekil 5, özetlenmiştir. Bu kriterler Şekil 6 karar akış şemasında gösterildiği gibi Şekil 5 rağmen., Altı veri setlerine uygulanmış ve 6 yalnızca Her veri kümesi için bir gerekçe sağlamak içindir ve kriterlerin her karar verme sürecinde ağırlıklı nasıl, Onlar kusursuz bir rehberlik değil, bir başlangıç ​​noktası yoktur. Karar verme sürecini etkileyen pek çok kriter sadece vardır: diğerleri gibi istenen bir hedef olarak daha öznel ölçütleri, oysa bazı tür bir veri seti özellikleri gibi objektif kriterler vardır. Bu yüksek lev gösterdikleri veri setleri söylemek güvenli olduğunukeskin net sınırları ile kontrast el, iyi ayrılmış ve (çok çeşitli değil) nispeten homojen ve nesnelerin çok sayıda için bir yoğunluk modeli görüntüleme amacı ile işlenen özelliklere sahip, otomatik yaklaşımlar, üstün olacaktır için değil eğer manuel yaklaşımlar sadece kaynak (zaman) -prohibitive olacağını gerçeği. Kontrast düşükse Öte yandan, veriler bulanık ve böylece, nesneler kalabalık ve özellikleri yüksek bir çeşitlilik göstermektedir ve dolayısıyla heterojen olan bir uzman bilgisi gerektirir, bir manuel özellik çıkarımı dışında başka seçeneğim yok olabilir / segmentasyon. Manuel Düsünce Modeli Üretimi Manuel soyutlanmış modeli izleme, lineer elemanları segmentlere otomatik (sopa) bağlanabilir tohumlar noktaları (topları) sağlamada etkilidir. Bu tür topları ve sopalarla-modelleri uzunluğu a ölçmek için çok güçlü olabilirnd bu modelin yönelimi ve nitel muayene ve kantitatif analiz hem de yeterli derecede soyutlanması modeli sunar. Analizine harcanan kaynakların en aza indirilmesi yaygın biçimde kullanılmaktadır Manuel soyutlanmış model üretme orijinal veri şekilleri mutlak sadakat daha önemlidir. Bu ilgi doğrusal ve homojen özellikler (örneğin, filamentler, borular) ile en başarılı olduğunu. Veri kontrast, netlik ve kalabalığımızın sürece insan gözü ilgi nesnesi tanımadığı gibi, bu yöntemin başarısını belirlemede önemli bir rol oynamaz. Bazen bu tür modelleri de segment bir iskelet iskelet çevresindeki bir bölgede 3 boyutlu harita olarak kullanılabilir. Anahtar modeli yerine tam bir yoğunluk yansıma olmasına rağmen, 3B yoğunluk skeletonize versiyonunu temsil eder ve bu şekilde karışık olmayan bir görüntüleme ve kalitatif analizi sağlar. Uzunluk gibi sayısal ölçümler de yaklaşık modelinden belirlenebilir. Bir içinmanuel soyutlanmış modeli nesil yazılım örneği, online Chimera ayrıntılı kullanım kılavuzunu ziyaret edebilirsiniz <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html</a> . İlgi Özellikleri Manuel Takip Manuel fırça izleme hemen hemen tüm veri özellikleri ile iyi çalışır, ama aynı zamanda yöntemini en zaman alıcı olduğunu. Bazen, bu tür ince ve kıvrık hücre zarı gibi özellikler, büyük bir çeşitlilik içeren karmaşık bir görüntü kümesinden ilgilendiren önemli bir özelliği ayıklamak için tek tekniktir. Ilgi özelliği sorunsuz değiştirdiğinde bazı programlarda mevcut yararlı bir araç aralıklı segmentlere dilimleri arasında enterpolasyon sağlar. Veri berrak ve yüksek kontrast ortam maddesine sahip olan, elle izleme en verimli şekilde tatbik edilebilir, fakat aynı zamanda kullanılabilirkullanıcı sürece daha zorlu veri setleri, ilgi nesnesi ile tanıdık. Veri karmaşıklığı nesneleri yakından dolu karmaşık ve kalabalık veri setleri, ayrık nesneler değişebilir. Otomatik yaklaşımlar genellikle segment istenilen hacmi mücadele ve çok fazla veya çok az ayıklamak gibi ikinci durumda, manuel segmentasyon, tek seçenek olabilir. Böyle dolambaçlı levhalar veya hacimleri gibi zor özelliği Morfolojileri, ayrıca bu yöntemle elde edilebilir. Ilgi özellikleri yüksek nüfus yoğunlukları segmentasyon zaman engelleyici olur gibi ilgi özelliklerin nüfus yoğunluğu, düşük Ancak, kullanıcının birkaç zor özelliklere sahip bir veri seti sadece segmente edilebilir akılda tutmak gerekir. Manuel takibi ile bir yazılım, örneğin, online Amira detaylı kullanım kılavuzunu ziyaret edebilirsiniz <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guid</a>e.pdf. Otomatik Yoğunluk tabanlı Segmentasyon Manuel tekniklerinin aksine, otomatik yaklaşımlar genellikle görüntüleri büyük bir yığını segmentlere dikkate alınması gereken önemli bir faktör daha az zaman alıcı vardır. Ancak, basit eşikleme olarak doğru olmayabilir, ve çok daha fazla zaman otomatik olarak bölümlenmiş hacmi arıtma ve kürasyonunda harcanan olabilir. Otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon tüm segmentasyon gerektiren ilgi benzer özelliklere sayıda gösterilecek veri kümeleri üzerinde en iyi çalışır. Veri daha karmaşık ise, bu otomatik teknikleri hala bir ilk adım olarak hizmet edebilir, ancak ilgi özelliğini içeren bir subvolume belirtmek için satır aşağı bazı manuel müdahale gerektirir. Bu strateji genellikle doğrusal morfolojilere veya kıvrık birimlerde iyi çalışıyor, ama bunun gibi ince kıvrık yaprak ile nadiren başarılıhücre zarları. Yüksek sadakat karşılığında zaman gibi birkaç kullanıcı kaynakları sokmaksızın ise otomatik yaklaşımları ile en az kullanıcı müdahalesi, büyük veya küçük hacimlerde yoluyla segmentasyon sağlar. Otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon ile bir yazılım, örneğin, online Amira detaylı kullanım kılavuzunu ziyaret edebilirsiniz <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf</a> . Özel-Tailored Otomatik Segmentasyon Özel tasarlanmış otomatik segmentasyon, belirli bir veri kümesi için algoritmalar güç özelleştirme sağlar, ancak genellikle önemli özellik sınırlı sayıda uygun veri seti veya veri türü, özeldir ve kolayca genelleştirilmiş olamaz. Burada görücüye prosedürü, havza daldırma ve diğer düzeyi gibi genel otomatik segmentasyon yaklaşımları farklıdır<html> Bu tohum noktalardan hızlı yürüyen küp yayılımı takip kritik başlangıç ​​vokseli bir programlanmış belirlenmesine dayanan grubu yöntemler,. Bu tema üzerine bir varyasyon gradyan vektör bilgilerini özellik sınırlarını bildirir sınır segmentasyon, olduğunu. Aksine, burada kullanılan özelleştirilmiş komut kullanıcı manuel olarak birkaç örnek izleri bir eğitim sahnede dayanır. Makine öğrenme yoluyla, belirli algoritmalar algılamak ve daha sonra bağımsız tutarlı izleri bulunan özellikleri ve veri özelliklerini tanımayı öğreneceksiniz. Algoritmaları yeniden eğitmek ve örnek daha dahil ederek segmentasyon doğruluğunu artırabilir uzman bir kullanıcı özelliği kriterleri daha büyük bir dizi sağlamak için izler. Curation sadece manuel izleme gibi yoğun emek olarak olabilir Genel olarak, eşikleme ve ilgili yaklaşımlar, hatta müşteriye özel yaklaşımlar, organellere veya şekillerin karmaşık çeşitliliği ile bir görüntünün ilgi tek bir özelliği ayıklamak için yararlı olmayabilir. &quot;&gt; Veri triaging ve Segmentasyon Yaklaşımı seçimi için Stratejiler Şekil 5, Şekil 4 ve uygun veri setleri özetinde gösterilen subjektif ve objektif kriterler dikkate alındığında, Şekil 6&#39;da karar verme düzeni veri setlerinin büyük bir çeşitlilik için özellik çıkarma stratejileri etkili bir değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Veri setleri, Şekil 4&#39;te sunulan dört ilgili hedefleri yanı sıra, iki öznel kriterlere herhangi birini içerebilir, her biri dört ardışık karardan içinde yanıtlanması edilir. Bir örnek olarak, Şekil 6, altı, her veri triaging için rasyoneldir setleri Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Kuşkusuz, orada bir tek, benzersiz bir yol değildir, ancak her bir veri seti için t yol açabilir karar verme için değişik kriterler aşağıdaki Bu matris boyunca oldukça farklı yollarıveri segmentasyonu için aynı veya farklı bir öneri o. Her veri seti tahmin edilemez özellikleri, kendi seti var olsa da, altı örnekler her tercih özellik çıkarma / segmentasyon yaklaşımın arkasındaki mantığı bir açıklama ile eşleştirilmiş, verilir. Çoğu da alternatif bir rota karar aynı veya farklı bir bölümleme yaklaşımın kullanımı ya sonuçlar (Şekil 6) için bir teklif içermektedir. Kinocilium otomatik yaklaşımlar daha olası başarılı kılan açıkça tanımlanmış sınırları, seti net veridir. Tüm ilgi özellikleri de yine otomatik bir yaklaşım lehine, ayrılır. Buna ek olarak, söz konusu özellikleri, özel olarak uyarlanmış segmentasyon için nispeten homojen bir veri seti ideal hale getirir, birbirine benzer. Son olarak, amaç, bir yarı otomatik yaklaşımlarla, bütün özelliği elde etmek olmuştur. Sonuç olarak, bundan, otomatik bir eşik (Katı yeşil hat) yanı sıra özel tasarlanmış (örneğin,) denetimli segmentasyon şekil yaklaşımı (noktalı yeşil hat) hem bu veri kümesi üzerinde de yapmak olasıdır. Karar verme ağda farklı bir sırayla yerleştirilir, ancak benzer kriterler, bakteriler durumunda uygulanır. Bu veri seti çok büyük oldu çünkü kişiye özel yaklaşım bölümünde tavsiye edilir; dolayısıyla, sınırlı kaynaklar, emek-yoğun manuel müdahale / segmentasyon yaklaşımı yasaklamaktadır. Eşikleme kabul edilebilir sonuçlar vermiştir isterken, özel olarak tasarlanmış bir yaklaşım bakteri-arasında veya hemen yanında bakteri ya bulunan hücre dışı metal yataklarının, gelen yuvarlakça bakteri şekilleri ayırmak için çalışmanın temel hedeflerinden yürütmek başardı, ve bu nedenle kişiye özel bir yaklaşım tercih edilmiştir. Stereocilia veri setleri için, önceliğiniz istenen hedefidir: hedefi tüm yoğunluğunu göstermek için olabilir, yaveya geometrik modeller oluşturmak için. Ilgi hacmi kalabalık bir alanı oldu ve objektif segmente sonradan vb yardımcı oldu uzunlukları, sayılar, mesafeler, oryantasyon, dahil kantitatif hacimsel analizini yürütmek için ayrılmış nesneleri gibi nesnelerin çok sayıda olduğu bir nesneler faiz ağırlıklı olarak lineer vardı ve bu seçim yöntemini izleme geometrik modelini yaptı. Ancak, bunun yerine objektif bir otomatik eşikleme protokol mümkün kılacak keskin tanımlı sınırları ile tüm yoğunluğu, daha sonra doğrusal özelliği morfolojisini yanı sıra nispeten yüksek kontrast göstermek olmuştur eğer. Hücre zarları ve mitokondri veri olgu özelliği morfoloji kendi kategorilerine otomatik yaklaşımlara karşı çıkıyor: kıvrık yaprak ve hacimleri, sırasıyla. Amaç doğru hücre ya da mitokondri anahat iz olduğunu, ancak bunu yapmak için sadece sonlu kaynaklar vardır. Inter Buna ek olarak, özelliklerest karmaşıktır ve mitokondri veri muhtemelen daha fazla özelleştirme ile tatbik edilebilir bakteri için alınan özel komut dosyası yaklaşımı setleri için rağmen, kolayca otomatik olarak algılanır veya şekil kodlanmış olamaz. Neyse ki, zar ve mitokondri kendilerini sadece bütün hacminin bir kısmını teşkil eder, ve bu nedenle, mekanik izleme zaman alıcı bir yaklaşım olsa bir basittir. Kontrast oldukça düşüktür ve sınırları oldukça bulanık olduğunda Manuel izleme ayrıca veri setleri için tercih edilen bir yöntemdir. Onlar veri setlerinin önemli bir bölümünü teşkil bile Sonuç olarak, bu tür dolambaçlı yaprak elle basitçe nedeniyle daha iyi bir alternatif olmadığı için, takip edilmelidir. Amaç segmenti yoğun aralıklı ve kalabalık bir sahne oluşturan tüm nesneleri, oldu, çünkü bitki veri seti kendi zorlukları poz verdi. Yoğunluğu gösteriliyor as-is şekli ve nesnelerin organizasyonu, ama b hakkında ölçümleri sağlayacakecause elle her ipliksi nesne, otomatik eşikleme yerine çok masraflı istihdam edildi edilir segmentlere. 3D modeli oluştururken çeşitli aşamalar ve ilgili sonuçları burada görüntülenir edilmiştir, ama daha da önemlisi, bulunan veri özellikleri ve kişisel kriterler segmentasyon iyi yolu da izah edilmiştir belirlenmesinde önemli olması. Görüntü verilerinin kendisi önemli özellikleri aksine, kalabalık, canlılık ve farklı şekil ya da (örneğin, organeller, filamentler, membran gibi) özelliklerin sayısı olarak burada açıklanan bir yer alır. Subjektif kriterler (ölçüm / sayma, iskeletize temsil veri / 3D renderings hacimleri görüntüleme), ilgilenilen özellik morfolojik özellikleri (doğrusal, uzun ağ, karmaşık, dolambaçlı), yoğunluğu segmentasyon amacı istenen dahil düşünün bütün hacmi (olan nesnelerin fraksiyonuna göre ilgi özellikleriönemli ve) ayıklanması gereken ve orijinal veri segmentasyon sadakat kaynakları sokmaksızın tradeoffs ve kaynakların önemli ölçüde daha yüksek tahsisi için artan iyileştirmeler sonuçlanan yatırım azalan getiri dengeleme. Görüntü segmentasyonu alanı anlamlı son yıllarda olgunlaştı, henüz gümüş kurşun, hepsini yapabilirsin hiçbir algoritma ya da program var. Veri seti boyutları rutin onlarca gigabayt megabayt yüzlerce büyüdü, ve şimdi neredeyse imkansız manuel segmentasyon yaparak, terabayt aşan başlıyor. Böylece, daha fazla kaynak, insan karar verme süreci taklit zeki ve zaman etkin özellik çıkarma yaklaşımları yatırım gerekir. Bu tür çabalar (Google Earth benzeri) anlamsal hiyerarşik veri tabanları, (2) veri soyutlama teknikleri (yani, geçiş tabanlı (1) coğrafi bilgi sistemi (CBS) ile kombine edilmesi gerekecektirBilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı sık sık kullanılan olarak, (3) simülasyon teknikleri, önemli ölçüde veri miktarını azaltmak ve böylece daha büyük hacimli 35 görüntü sağlayan amacıyla uyumlu geometrik / hacimsel gösterimi için bir vokselin) den mühendislik disiplinleri gibi (oyun endüstrisi için geliştirilen ne benzer) sinek-yoluyla animasyonlar dahil (4) gelişmiş animasyon ve film yapma yeteneklerini,. Açıkçası, verimli özellik çıkarma ve segmentasyon, farklı veri türleri için alınmış hücresel yüksek çözünürlüklü görüntüleme önümüzdeki devrimin kalbinde daha iyi yaklaşımlar her zaman ihtiyaç olacaktır olurken, ve, ilkeler Burada sunulan, yanı sıra ne yaklaşım örneklerini yatıyor almak için yaklaşım hangi bir karar için bazı değerli bilgiler sağlayacaktır.

Geleneksel olarak, elektron mikroskobu (EM) alan 1) yüksek ve süper yüksek çözünürlüklü TEM kullanarak yapısal biyoloji dalı ayrılmıştır, genellikle örtülü veya açık veri ile makromoleküler komplekslerin üç boyutlu (3D) yapısını araştırmak için ortalama ile kombine tanımlı bir bileşim ve tipik olarak nispeten küçük boyutlu 1-4 ve bütün sahneleri hücresel 1,5,6 görselleştirilir, 2) hücresel görüntüleme dalı. Yapısal biyoloji dalı son dört yılda muhteşem bir gelişme geçirmiş olsa da, hücre biyolojisi şube çoğunlukla, çoğu az-daha-iyi şekilde korunmuş örnekleri üzerinde, iki boyutta sınırlandırılmıştır. Sadece son on yılda elektron tomografisi gelişine tipik hücresel sahnelerine ve böylece ilgi özellikleri olarak yapılamaz ortalama üçüncü boyut 5,7, içine genişletti hücre biyolojik Ultrastrüktürel görüntüleme sahiptir, genellikle benzersizdir. Görüntülenmiştir hücresel sahneler sık ​​sık göze çarpıcı olsa da, tam olarak protein bileşiminin, genellikle bilinmemektedir, çünkü, bu tür yüksek ilgi ve kompleks hücresel hacimlerinin sonraki kantitatif analiz özellikleri etkin bir ekstraksiyon dolayısıyla bu hücresel yorumlamak için daha zor bir hale getirmektedir, kısmen, geride 3D hacimleri. Bu tarihe kadar, geniş bir biyolojik uzmanlık çoğu kez karmaşık tomogram yorumlama, ya da 3 boyutlu hacim önemli bölgeleri ve temel bileşeni tanımlamak için gereklidir. Bir diğer komplikasyon olarak, 3D hacimlerinin görselleştirme derece saçmadır olmayan. 3D hacimleri düşündüm ve böylece 2B görüntülerin yığınları olarak görülebilir. Sıralı 2D görüntülerin dilim-dilim muayene karmaşıklığını azaltır, ama aynı zamanda sınırları iki boyutlara çıkarma ve dolayısıyla kantitatif analiz bulunmaktadır. Ancak, çoğu 3D nesneler için, 3D hacimlerinin tasviri olarak sadece ardışık uçaklarının bir yığın eksik bir yol açarBelirli bir sistemin 3D doğanın içine d çarpık bakış açısı. Görsel denetim alternatif modları bir hücresel genellikle yoğun doğasını-verilen ya hacim görüntülemesini veya yüzey işleme gerektiren hacim-can böylece interaktif manuel segmentasyon zorlaştırır, kolayca iç içe nesneleri bir engel görünümüne yol veya tamamen bir kullanıcı korkutur. Bu engelleri, otomatik özellik çıkarımı büyük bir çeşitlilik giderilmesi için (segmentasyon) yaklaşımlar tipik density- veya gradyan tabanlı 8-10 ya olduğu geliştirilmiştir. Bazı yeni yöntemler ilgi belirli bir özelliği hedefleyebilir rağmen Ancak, bu yöntemleri gibi aktin filamentler 11 gibi, ne olursa olsun alanları veya özellikleri uzman ilgilendiren hangi segmentine tüm hacmi eğilimindedir. Buna ek olarak, otomatik bir segmentasyon yürütme programları, bazen, örneğin, su havzası immersio olup, (alt miktarlar çok sayıda üretilmesiyle sonuçlanabilirgenellikle ilgi tüm özelliğini içeren ya da daha fazla segmentasyon tabi manuel olarak geri birleştirilecek gerekir n segmentasyon). Bu nedenle çoğu render bilgisayar algoritmaları genellikle istenen bir bölümlenmiş hacmi üretmek için gerekli olan bir uzman tarafından, sadece sadakat ile ilgi özelliklerini ve önemli curation çabaları ayıklamak için veremiyoruz, özellikle karmaşık ve kalabalık veri setleri için de geçerlidir. Ayrıca, oldukça belirli bir probleme özel çözümler genellikle onları geniş olması konusunda bir vurgu ile küçük bir bilimsel toplantı kağıdı olarak yayınlanan ve matematik, bilgisayar bilimi ve / veya alanların samimi bilgiye sahip değilsiniz araştırmacılara kapsamlı araçları erişilebilir edilir bilgisayar grafikleri. Görüntü analizi kütüphanelerin bir dizi içeren bir özelleştirilebilir programlama yazılımı ortamı, kullanıcıların verimli, doğru segmentasyon için kendi modülleri yazmak için izin güçlü bir araç seti olabilir. Ancak, bu yaklaşım ext gerektirirensive eğitim ve birçok özellikleri veya görüntü analizi için yeteneklerinden yararlanmak amacıyla bilgisayar bilimi arka plan. Bir çevrelerini 12,13 ilgi nesneleri ayırmak için &quot;şablonlar&quot; eşsiz geometrisine bağlı güçlü şekil-tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, örneğin özellikleri daha seyrek olan bazı veri setleri, böyle çok yönlü bir yazılım ortamında çalışabilir . Bilgisayar grafik görselleştirme paketleri adil çeşitli interaktif manuel segmentasyon ve model bina var. Kaliforniya San Francisco Üniversitesi Chimera 14, Colorado imod 15 Üniversitesi ve University of Texas Austin VolumeRover 16: diğerleri akademik kökenli ve gibi, ücretsiz dağıtılan Bazı paketler piyasada mevcuttur. Ancak, bu programlar sahip özellikleri ve yetenekleri geniş ve karmaşıklığı ea için öğrenme eğrisi dikleşirch. Bazı görüntüleme programları gibi topları ve karmaşık 3D hacminin basitleştirilmiş bir modeli oluşturmak amacıyla yoğunluk haritaları içine konabilir çeşitli boyutlarda, sopalarla gibi basit geometrik modelleri sağlamak. Bu modeller daha sonra basit geometrik ve hacimsel ölçümleri ve bu nedenle sadece &quot;güzel bir resim&quot; ötesine izin verir. Nesnelerin tür el izleme nesnelerin sadece az sayıda takip ve ekstre edilmesi için gereken miktarlar için iyi çalışır. Ancak, kullanarak büyük hacimli 3D mikroskobik görüntüleme son gelişme ya odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobu (FİB-SEM) 17-20 veya seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) 21 3D veri büyüklüğünün ek komplikasyon sunar setleri onlarca gigabayt ve gigabayt yüzlerce ve hatta terabayt kadar uzanabilir. Bu nedenle, büyük 3D hacimleri manuel özellik çıkarımı için neredeyse erişilemez ve dolayısıyla verimli bir kullanıcı güdümlü yarı-otomatik Feature çıkarma öngörülebilir gelecekte 3D hacimlerin verimli analizi için darboğazları biri olacak. Rutin biyolojik görüntü türleri geniş bir yelpazede kullanılan dört farklı segmentasyon yaklaşımdan burada sundu. Bu yöntemler daha sonra biyologlar kendi verilerin etkin özellik çıkarımı için iyi segmentasyon yaklaşımı ne olabilir karar vermenize yardımcı olacak bir rehber haline bir derleme izin veri setleri farklı türleri için kendi etkinliği için karşılaştırılmıştır. Ayrıntılı kullanım kılavuzları açıklanan programların çoğu için mevcut olduğundan, amaç bu özel paketlerinden herhangi biri ile potansiyel kullanıcılar aşina yapmak değildir. Bunun yerine, amaç farklı özelliklere sahip altı örnek veri setleri bunları uygulayarak bu farklı segmentasyon stratejileri ilgili güçlü ve sınırlamaları göstermektir. Bu karşılaştırma ile, bir kriter dizisi ya da bir nesnel görüntü özelliklerine dayanmaktadır geliştirilmiştirÖrneğin segmentasyon için istenen amaç olarak subjektif değerlendirmeler, veri aksine, canlılık, kalabalık ve karmaşıklık, ya da sap gibi 3 boyutlu veri setleri, özellikleri morfolojileri kısmını yani, ilgi özelliklerinden nüfus yoğunluğu, bölütlenecek ilgi özelliği ve nasıl gelinir optimal böyle bir zaman ve personel durumu gibi sonlu kaynaklarla tarafından işgal hacmi. Bu farklı bir örnek veri setleri bu objektif ve subjektif kriterler veri setleri belirli türleri ile belli özellik çıkarma yaklaşımları eşleştirme elde kombinasyonlar çeşitli sıralı olarak uygulanabilir nasıl göstermektedir. Umarım acemiler yardımcı olacak verilen tavsiyeler segmentasyon seçenekleri büyük bir çeşitlilik ile karşı karşıya kendi 3D hacim için en etkili segmentasyon yaklaşımı seçin. Bu çalışmanın odak noktası veri toplama ve ön-işleme verilere özellik çıkarımı, dikkat iken verimli s için çok önemlidiregmentation. Çoğu kez numune boyama düzensiz olabilir ve bu nedenle, potansiyel boyama eserler bölütleme prosedür dikkate alınmalıdır. Ancak, leke genellikle daha yüksek sinyal-gürültü verir, ve bu nedenle daha az filtreleme ve potansiyel olarak da eserler neden olabilir hücresel hacimleri, diğer matematiksel tedavi gerektirir. İlgili ham görüntü veri setleri 3D hacim içine, doğru kontrast ve kamera piksel ayarlarında edinilen hizalanmış ve yeniden inşa edilmesi gerekiyor. Tomografi için hizalanır görsel ağırlıklı geri-yansıtma kullanılarak, tipik olarak yeniden edilir ve daha sonra bu veri kümesi, genellikle, doğrusal olmayan bir anizotropik difüzyon 22, iki taraflı filtre 23 ya da 24, filtreleme yinelemeli algoritmalar medyan denoising tabi tutulur. FIB-SEM ve SBF-SEM görüntüleme verileri gibi ImageJ 25 gibi XY kullanan programlarda çapraz-ilintisi ardışık kesit hizalanır. Kontrast geliştirme ve filtreleme özelliklerini artırmak için uygulanabilirfaiz ve böylece görüntü yığınını gürültü de için. Filtreleme yaklaşımlar hesaplama pahalı olabilir Filtreleme, seçimi veya seçilen hacimler üzerinde subvolume önce tüm birimdeki ya yapılabilir. Veri önemli görülen çözünürlüğü ile karşılaştırıldığında örneklenmiş olması durumunda aşağı örnekleme zaman gürültü azaltma ve / veya dosya büyüklüğü azaltılması için kullanılan verileri (kutulamanın), ve, sadece önerilir. Gürültü azaltma sonra, işlenmiş görüntüler daha sonra çeşitli yöntemlerle göre segmente edilebilir ve bu çalışmada odak aşağıdaki dört üzerinde: bir top-ve-sopa modeli yaratarak (1) manuel soyutlanmış modeli nesil (2) manuel izleme Projeye özel segmentasyon için bir komut dosyası aracılığıyla ilgi, (3) otomatik eşik tabanlı yoğunluk ve (4) özel uyarlanmış otomatik segmentasyon özellikleri. Sınır segmentasyon 8 ve sürükleyici havza segmentasyon 10 basit eşikleme için daha iyi alternatifler vardır, ama they aynı kategorideki aittir ve bu tartışmada açıkça dahil edilmemiştir. Yoğunluk elle izleme dilim-dilim-ilgili alt-alanlarında hücresel orijinal yoğunluğa tutulmasını sağlar, söz konusu özellikleri de ortaya gerektirir. Bu yaklaşım segmentasyonu sürecinde maksimum kontrol sağlar, ama sıkıcı ve emek-yoğun bir işlemdir. Bir algoritma kullanıcı tanımlı parametreleri bir dizi dayalı pikselleri seçer nerede otomatik eşik tabanlı (ve ilgili) yoğunluk segmentasyon yaklaşımlar, yarı otomatik vardır. Böyle ucsf Chimera, imod, Fiji 26 ve VolumeRover gibi çeşitli akademik (ücretsiz) görselleştirme paketleri, paketler (ücretli lisans gerektiren) mevcuttur, yanı sıra, ticari, ve her iki tip genellikle bu segmentasyon yaklaşımlardan birini veya daha fazlasını içerir. Bu farklı yöntemler göstermek için bu çalışmada kullanılan yazılım paketleri hem ticari programları ve akademik açık s katmakelle soyut bir modelini, yanı sıra manuel ve otomatik yoğunluk segmentasyonu üretmek için ource programları. Ancak, açık kaynak yazılım bazen özelleştirme olanağı ile daha gelişmiş seçenekler sunabilir. Veri setleri farklı türleri kullanarak bu tekniklerin karşılaştırılması bilgilerimize henüz yayınlanmamış olan çeşitli biyolojik veri 3D ciltlik segmentasyon nasıl yaklaşılması üzerine aşağıdaki kurallar sunumu ve rehberlik yol açtı. Böylece, bu ilk sistematik farklı yaklaşımların karşılaştırılması ve farklı amaçlarla kullanıcılar için özelliklerinin değiştirilmesi ile veri setleri onların kullanışlılığı.

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>FEI Görselleştirme Bilimleri Grubu</td><td></td><td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td></tr><tr><td>Chimera</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık</td><td></td> Enstitüsü <td>http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Hücrelerin</td><td>3D Elektron Mikroskobu için IMOD Boulder Laboratuvarı</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td></tr> <tr><td>Photoshop,</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</td></tr>, <tr><td>MATLAB</td>, <td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>VLFeat</td><td>, VLFeat</td><td></td><td>http://www.vlfeat.org/</td></tr></tbody></table>

voksellerden gönderen bilgi için: kompleks elektron mikroskopi 3d-data bölümlere göre pratik rehber

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D elektron mikroskobu yaklaşımlar son böyle yapışma kompleksleri, yanı sıra yüksek-nizam yapılarda, örneğin hücre iskeleti gibi ve hücresel organellere gibi büyük makromoleküler makineleri, görselleştirme sağlayan hücrelerin ve dokuların 3D ultrastrüktürel örgüte görülmemiş içgörü sağladı onların ilgili hücre ve doku bağlam. Hücresel hacimlerinin doğal karmaşıklığı göz önüne alındığında, ilk olarak 3D organizasyon görselleştirme, ölçme ve bu nedenle kavrama sağlamak için ilgili özelliklerini elde etmek için gereklidir. Her bir veri seti verilerin farklı özellikleri, örneğin, sinyal-gürültü oranı, zindelik (keskinlik) tarafından tanımlanan, özellikleri, özellikleri, varlığı veya kolay tanımlanması için izin karakteristik şekiller olmaması kalabalığımızın ve yüzde heterojen ilgi, belirli bir bölge işgal hacminin tamamının. Tüm bu özelliklerinin dikkate alınması gerekirkarar verirken segmentasyon için almak hangi yaklaşım. Üç farklı görüntüleme elde edildi sunulan altı farklı 3D ultrastrüktürel veri setleri yaklaşımlar: reçine gömülü lekeli elektron tomografisi, iyon beam- ve seri blok yüz-taramalı elektron mikroskobu (FİB-SEM, SBF-SEM) odaklı hafif lekeli ve ağır lekeli örneklerinin sırasıyla. Bu veri setleri için, dört farklı segmentasyon yaklaşım uygulanmıştır: (1) tam manuel model bina (3) yarı-otomatik yaklaşımlar takip yüzey sunumuna takip verileri (2) manuel izleme segmentasyon, model görselleştirme yalnızca tarafından takip yüzey işleme, veya yüzey işleme ve kantitatif analizleri takiben (4) otomatik bir özel tasarlanmış segmentasyon algoritmaları tarafından. Veri seti özelliklerin kombinasyonuna bağlı olarak, bu dört kategorik yaklaşımlar tipik olarak bir diğerlerinden daha iyi performans olduğu bulunmuştur, ancak kriterlerin tam diziye bağlı olarak, morfolinYeniden fazla yaklaşma başarılı olabilir. Bu verilere dayanarak, farklı veri setlerinin analizi için objektif veri seti özelliklerini ve öznel kişisel kriterleri hem kategorize eden bir triyaj düzeni öneriyoruz.

Hücresel 3D elektron mikroskobu için darboğaz oldukça karmaşık 3D yoğunluk haritalarında özellik çıkarma (segmentasyon) &#39;dir. Biz dolayısıyla etkili segmentasyon için bir başlangıç ​​noktası sağlayan, segmentasyon yaklaşımı (manuel, yarı otomatik veya tam otomatik) farklı veri türleri için en uygun olduğu konusunda rehberlik sağlamaktadır kriterleri bir dizi geliştirdik.

Voksellerden Gönderen Bilgi için: Kompleks Elektron Mikroskopi 3D-Data Bölümlere Göre Pratik Rehber

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelerin ve dokuların 3D organizasyonlarını analiz etmek için karmaşık 3D elektron mikroskopisi veri setlerinden ilgilenilen özellikleri segmente etmektir. Bu işlem, tekil elektron mikroskopisi görüntülerinden oluşan bir veri setinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ham 2D veriler daha sonra bir 3D hacme yeniden yapılandırılır ve gürültüyü azaltmak ve ilgilenilen özellikleri belirginleştirmek için filtrelenir; ikinci bir adım olarak, segmentasyon için en iyi yöntem seçimini bilgilendirmek amacıyla verilerin objektif ve subjektif özellikleri değerlendirilir.Ardından, ilgilenilen özelliklerin çıkarılması için manuel soyutlama, model oluşturma, özelliklerin manuel takibi, otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon veya özel olarak hazırlanmış otomatik segmentasyon yöntemlerinden biri uygulanır. Sonuçlar, görüntü karakteristiklerinin değerlendirilmesine ve optimal segmentasyon yaklaşımını seçmeye yönelik kişisel amaçlara dayalı olarak, ilgilenilen özelliklerin nihai 3B segmente edilmiş modellerini göstermektedir.Farklı veri setleri için farklı yaklaşımların karşılaştırılması, doğru segmentasyon stratejisinin seçilmesine yardımcı olacaktır. İlgilenilen özelliklerin çıkarılması için farklı yöntemler sunmaktayız. Subsellüler elektron mikroskobu hacimlerinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, her yaklaşımın kendine özgü avantajları ve sınırlamaları bulunmaktadır.Genel olarak, segmentasyona yeni başlayan kişiler, farklı veri setleri için en iyi yaklaşımı belirlemek her zaman net olmadığı için zorluk çekebilirler. Lisansüstü öğrencilerin şikayetlerinin yanı sıra, Tai'nin prosedürü uygulamayı göstermesi bir doktora sonrası araştırmacı olarak faydalı olacaktır.Laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Amit Hassan ve bilgisayar sistemleri mühendisi Joaquin Korea ile birlikte, tek amacın geometrik ölçümler yapmak için geometrik bir model oluşturmak olduğu durumlarda manuel soyutlanmış model oluşturma yöntemi kullanılır. Başlamak için, veri hacmini uygun bir programa aktarın. Bu gösterimde manuel soyutlanmış model oluşturma için kymera yazılımı kullanılmıştır.Öncelikle, dosya açma iletişim kutusunu getirmek için "select file" ve ardından "open" seçeneğine tıklayın ve istenen haritanın bulunduğu dosya konumuna gidin. Daha sonra, hacim görüntüleyiciyi (volume viewer) açın ve verileri farklı görselleştirme stillerinde görüntülemek için "features display style" seçeneğini seçin. Hacim görüntüleyici penceresindeki histogramda bulunan dikey çubuğu sürükleyerek görüntüleme eşiğini ayarlayın.Segmentasyon için ilgilenilen alanı seçmek üzere 3B hacim içinde gezinin ve gerekirse daha küçük bir alt hacim kırpın. Hacim görüntüleyici iletişim kutusunda, özellikler (features), alt bölge seçimi (subregion selection) seçeneklerini seçin, ardından ilgilenilen bölgenin etrafında dikdörtgen bir kutu oluşturmak için tıklayıp sürükleyin. Son olarak, model tamamlanana kadar ilgilenilen özelliğin boyunca işaretçiler yerleştirin ve uygun yerlerde bunları bağlayıcılarla birleştirin.Hacim görüntüleyici menü çubuğundan bunu gerçekleştirmek için araçlar (tools) ve ardından hacim izleyici (volume tracer) iletişim kutusunu seçin. Buradaki hacim izleyici iletişim kutusunu açmak için dosya (file) ve yeni işaretleyici seti (new marker set) seçeneklerini belirleyin. Hacim izleyici iletişim kutusunda; fare (mouse), yüksek yoğunluklu bölgelere işaretçiler yerleştir (place markers on high density), verilere işaretçiler yerleştir (place markers on data), düzlemleri taşı ve işaretçileri boyutlandır (planes move and size markers), yeni işaretleyiciyi seçili işaretleyiciye bağla (link new marker to selected marker) ve ardışık seçilen işaretleyicileri bağla (link consecutively selected markers) seçeneklerini işaretleyin.Ardından, hacim izleyici penceresinde sağ fare düğmesiyle işaretleyici yerleştirme seçeneğini belirleyin ve işaretleyiciler ile bağlantılar için yarıçap değerlerini girin. Sonrasında, işaretleyicileri yerleştirmeye başlamak için hacim verisinin üzerine sağ tıklayın. İşaretleyiciler, hacim izleyici iletişim kutusunda otomatik olarak birbirine bağlanacaktır.Dosyayı seçin, mevcut işaretleyiciyi kaydedin. Ardından dosya kapatma işaretleyicisini ayarlayın. Ayarlayın. İlgilenilen ikinci bir özelliğe yönelik model oluşturmaya başlamak için yeni bir işaretleyici seti açın.Özelliklerdeki farklılıkları vurgulamak için işaretleyici setleri arasında zıt renkler kullanın. İlgi duyulan özelliklerin manuel olarak izlenmesi, popülasyon yoğunluğunun nispeten düşük olduğu ve özellik çıkarımının doğruluğunun kritik önem taşıdığı durumlarda kullanılan, zaman alan bir yaklaşımdır. Başlamak için, hacim verilerini manuel izleme seçenekleri sunan bir yazılıma aktarın.Bu yetenekle birlikte genellikle temel bir fırça aracı sunulur. Bu gösterimde, büyük tomogramlar için Amira yazılımı kullanılmıştır. "open data" (verileri aç) seçeneğini belirleyin ve rec dosya adına sağ tıklayın.Ardından format'a tıklayın, büyük disk verisi (large disc data) olarak raw seçeneğini belirleyin. Tamam'a tıklayın ve yükleyin. Başlık bilgilerinden uygun raw veri parametrelerini seçin ve tamam'a tıklayın.Değiştirin ve yeni bir dosya adı olarak kaydedin. am dosyası. 3D görüntü dizisi için, veri aç seçeneğini belirleyin ve tiff dosya adını veya dot mrmc dosya adını seçin.Ardından geçiş yapın, sağ tıklayın ve dosya adını am olarak seçip kaydedin. 3D görüntüleyici penceresinde, görüntü dosyasını açmak için orto kesiti seçin. Daha sonra, büyük disk verileri olarak açılan geniş verileri kırpmak için kesitler arasında gezinmek amacıyla alttaki sürgüyü kullanın.Havuz penceresindeki dosya adına tıklayarak seçin, sağ tıklayın ve lattice access seçeneğini seçin. İstenen kutu boyutunu girin, kutuyu istenen alana taşıyın ve apply düğmesine tıklayın. Yeni dosyayı kaydedin.Ardından, havuz penceresindeki dosyayı değiştirerek bir segmentasyon dosyası oluşturun. Daha sonra sağ tıklayıp "labeling label field" seçeneğini seçin. Yeni bir dosya oluşturulacak ve hem segmentasyon editörü sekmesine hem de nesne havuzuna otomatik olarak yüklenecektir.İlgilenilen ilk özelliğin sınırlarını belirlemek için fırça aracını kullanın. Fırça boyutunu isteğinize göre ayarlayın ve ardından ilgilenilen özelliğin sınırlarını çizmek için fare imlecini kullanın. Çizilen alanı F kısayoluyla doldurun. Artı sembollü düğmeye tıklayarak seçimi ekleyin.İlgilenilen özelliği tüm kesitler boyunca takip edin ve manuel izleme segmentasyonunu tekrarlayın. Yazılım kullanıcı kılavuzu talimatlarına göre, nesne havuzu sekmesindeki dosya adı etiketlerini havuz penceresinde açarak görselleştirme ve temel kalitatif veya kantitatif analiz için bir yüzey oluşturma gerçekleştirin. Ardından sağ tıklayıp "surface gen" seçeneğini belirleyin.İstenen yüzey özelliklerini seçin ve uygula (apply) butonuna tıklayın. Havuzda "surf" adında yeni bir dosya oluşturulacaktır. Segmentlere ayrılmış hacmi görselleştirmek için havuz penceresindeki "surf" dosyasını etkinleştirin.Ardından sağ tıklayın ve yüzey görünümünü (surface view) seçin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde görselleştirme ve kalitatif analiz için bir yüzey oluşturun. Her türlü kontrast, netlik veya yoğunluğa sahip veri setlerinde, ilgilenilen yoğunlukları ayıklamak amacıyla otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon kullanılır; böylece hacim verilerinin, eşikleme sihirli değneği (thresholding magic wand) veya otomatik segmentasyon için diğer yoğunluk tabanlı araçlarla donatılmış bir programa aktarılması sağlanır.İlgi çekici özelliklerin manuel izleme tekniğinde yapıldığı gibi, bu demonstrasyonda belirgin sınırları olmayan özellikler için Amira yazılımı kullanılmıştır. Eşikleme simgesini seçerek eşikleme aracını kullanın. Sadece ilgi çekici özelliklerin maskelenmesi için kaydırıcıyı kullanarak yoğunluğu istenen aralığa ayarlayın.Seçim düğmesine tıklayın, ardından artı sembollü düğmeye veya kısayola tıklayarak bir seçim ekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi, görselleştirme ve kalitatif analiz için bir yüzey oluşturun. Tüm bunlar dördüncü bir yaklaşımdır.Özel olarak yapılandırılmış otomatik segmentasyon, büyük veri setlerini verimli bir şekilde segmente etmek için kullanılabilir, ancak MATLAB gibi programlarda bilgi sahibi olmayı gerektirir. Bu yönteme ilişkin adım adım talimatlar için lütfen özel yapılandırılmış segmentasyon hakkındaki ek videoya bakınız. Altı örnek veri seti dört yaklaşımla segmente edilmiştir. Manuel soyutlanmış model oluşturma, ilgilenilen özelliklerin manuel izlenmesi, otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon ve özel yapılandırılmış otomatik segmentasyon; manuel soyutlanmış model oluşturma yöntemi reçine için etkili olmuştur.Stereosilyaların gömülü boyanmış tomografisinin amacı, bir bitki hücre duvarının reçineye gömülmüş boyanmış tomografisi için kesin yoğunluklar çıkarmaktan ziyade, nicel amaçlar için bir model oluşturmaktı. Çok sayıda kesit üzerinden selülozu hızlıca çıkarmak için otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon en etkili yöntem olmuştur. Manuel yöntemler, verilerin yalnızca birkaç kesitinde daha fazla çaba gerektirmiştir.Kinocilium evre tomografisinde mikrotübül tripletleri manuel özetlenmiş model oluşturma ile üretilirken, iki otomatik yaklaşım yoğunlukları daha hızlı bir şekilde çıkardı ve bu nedenle odaklanmış iyon demetleri ile meme epitel hücrelerinin taramalı elektron mikroskobi görüntülerindeki mitokondri şekilleri nedeniyle tercih edildi. Manuel izleme en temiz sonucu verdi ve düşük popülasyon yoğunluğu hızlı segmentasyona olanak sağladı. Segmentasyonu gereken hacmin büyüklüğü göz önüne alındığında, seri blok yüzü taramalı elektron mikroskobi bakteri verilerini segmentlere ayırmak için özel olarak tasarlanmış otomatik segmentasyonun en verimli yöntem olduğu kanıtlandı.Odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobu ile elde edilen meme epitel hücresi membranlarının çıkarılması için tek yöntem, zaman alıcı olmasına rağmen, manuel izleme yöntemidir. Segmentasyon yaklaşımlarının geliştirilmesi, yapısal hücre biyolojisinin bu yükselen alanındaki araştırmacıların; çok çeşitli hücre kültürleri, organoid kültürleri veya model organizmalarda makromoleküler kompleksler, organeller ve hücreler düzeyindeki hücresel 3D mimariyi keşfetmelerine ve belirlemelerine olanak sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, veri setiniz için en uygun segmentasyon yaklaşımını nasıl seçeceğiniz ve uygulayacağınız konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

from-voxels-to-knowledge-practical-guide-to-segmentation-complex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu arasında köprü kurarak belirli bir hücrenin doğal dokusundaki üst yapısını ortaya çıkarmak için bir yöntem olan cocem3D'yi tanıtıyoruz.

Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Segmentasyon birçok görüntüleme teknikleri üç boyutlu veri analizi karmaşık biyolojik sistemlerin büyük bir darboğaz var. Burada, biz SuRVoS tezgah yarı otomatik olarak çeşitli uzunluk-ölçeklerde hacimsel veri kesimi için nasıl kullanılacağını açıklar örnek veri kümeleri cryo-elektron tomografi, soguk yumuşak x-ışını tomografi ve faz kontrast x-ışını tomografi teknikleri kullanarak.

Birim segmentasyon ve SuRVoS (süper bölge birim segmentasyon) tezgah kullanarak biyolojik malzemelerin analizi

Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.

Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Burada, seri blok yüz ve odaklanmış iyon ışını tarama elektron mikroskobu ile ilgi alanını hedefleyen bir protokolü etkin bir şekilde birleştirmek için bir protokol sıyoruz. Bu, üç boyutlu olarak verimli arama yapılmasına ve geniş bir görüş alanında nadir olayları bulmanızı sağlar.

Seri Blok Yüz ve Odaklanmış Iyon ışını Scan Elektron Mikroskobu Kullanılarak Yapılan Hedefli Çalışmalar

Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.

Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları

Bu, bir tomogramın bir kısmını eğitim girdisi olarak kullanarak kriyo-elektron tomogramlarının çok sınıflı segmentasyonu için çok dilimli bir U-Net'i eğitmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu ağın diğer tomogramlara nasıl çıkarılacağını ve subtomogram ortalaması ve filament izleme gibi daha ileri analizler için segmentasyonların nasıl çıkarılacağını açıklıyoruz.

Kriyo-Elektron Tomogramlarının Derin Öğrenme Tabanlı Segmentasyonu

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel üst yapının nanometre çözünürlükte 3D görselleştirilmesini sağlar, ancak manuel segmentasyon zaman alıcı ve karmaşık olmaya devam etmektedir. Kriyo-ET tomogramlarını segmentlere ayırmak için gelişmiş sanal gerçeklik yazılımını entegre eden ve memeli hücrelerinde mitokondrinin segmentasyonu yoluyla etkinliğini gösteren yeni bir iş akışı sunuyoruz.

Kriyo-elektron tomografi verilerinin sürükleyici segmentasyonu ve analizi için sanal gerçeklikten yararlanma

Biz en çok yansıyan ışık mikroskopları uyacak şekilde tasarlanmış düşük maliyetli kriyojenik sahne imalat göstermektedir. Bu laboratuvar dahili kriyojenik aşamada cryo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu arasındaki verimli ve güvenilir bir bağlaşık görüntüleme sağlar.

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

Basınç koşulları fizyolojik ve patolojik kalp kapakçığı dokusu tabi yapabilen bir siklik basınç biyoreaktör dizayn edilmiştir. LabVIEW programı, kullanıcıların basınç büyüklüğü, genlik ve frekans kontrol etmenizi sağlar. Bu cihaz, kalp kapakçığı dokusu veya izole hücrelerin mechanobiology incelemek için kullanılabilir.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

in vivo görüntüleme için floroforların kullanımı, opsonizasyon, hızlı klirens, düşük saptama hassasiyeti ve konakçı üzerindeki sitotoksik etkiler nedeniyle büyük ölçüde sınırlanabilir. Floroforların lipozomlardaki film hidrasyonu ve ekstrüzyon ile kapsüllenmesi, floresan söndürme ve korumaya yol açar, bu da yüksek algılama hassasiyeti ile in vivo görüntülemeyi mümkün kılar.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme İn Vivo Optik Görüntüleme

Öğrenin, karmaşık 3D elektron mikroskobu verilerinden özellik çıkarımı için manuel ve otomatik segmentasyon yöntemlerini. Bu rehber araştırmacılara en uygun yaklaşımı seçme konusunda yardımcı olur.

Voksellerden Gönderen Bilgi için: Kompleks Elektron Mikroskopi 3D-Data Bölümlere Göre Pratik Rehber

Daha fazla video keşfet