Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Bu prosedürün genel amacı, doğal bağırsak dokusundaki diğer epitel hücreleri arasında dağılmış belirli bir bağırsak duyu hücresinin tam ultra yapısını belgelemektir. Bu, önce bağırsaktan 300 x 50 mikronluk bir doku segmenti elde edilerek gerçekleştirilir. Daha sonra segmentin optik Z yığınları konfokal mikroskopi kullanılarak elde edilir.

Daha sonra konfokal veriler, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu veya SBE kullanarak dokuyu işlemek ve görüntülemek için bir kılavuz görevi görür. Son olarak, SBEM verileri, belirli bir bağırsak sensörü hücresinin ultra yapısını 3D olarak oluşturmak için bölümlere ayrılmıştır. Sonuçta korelasyon konfokal mikroskopi ve seri blok yüz taraması.

Elektron mikroskobu, belirli bir hücreyi doğal dokusunda göstermek ve ultra yapısını 3 boyutlu olarak ortaya çıkarmak için kullanılır. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanında, ışık mikroskobu düzeyinde başka türlü görselleştirilemeyen spesifik hücreden hücreye etkileşimler gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemi kullanarak, daha önce duyusal enter endokrin hücreleri ile enter ggl arasında gizli bir fiziksel kimyasal ilişki olduğunu bildirmiştik.

Fare kolonunu izole ettikten sonra, metin protokolüne göre, güzel soğuk PBS'ye yerleştirin ve suya batırılmış durumdayken dokuyu mezsentary boyunca kesin, dokuyu bir diş balmumu tabakası üzerinde birkaç damla PBS'ye aktarın ve bir neşter kullanarak distal kolondan yaklaşık altı küçük doku segmenti. PBS'de %5 düşük erime noktalı aros hazırladıktan sonra, doku segmentlerini standart boyutlu doku teknolojisi kriyo kalıbı gibi küçük bir plastik kaba gömmek için kullanın, gömülü bölümleri titreşimli bir bıçak mikrotomuna monte edin ve tampon tepsisini doldurmak için buz gibi soğuk PBS kullanın. Daha sonra saniyede 0.8 genlik ve 0.04 milimetre hızında 300 mikron doku şeritleri kesin.

300 mikronluk doku şeritlerini aros içinde tarayın ve bıçağa dik olarak bir mikroton üzerine monte edin. Daha sonra, blokları PBS'de dört santigrat derecede saklamadan önce ayrıntılar için metin protokolüne atıfta bulunarak 50 mikron kalınlığında doku şeritleri kesin. Doku bloklarını görüntüledikten sonra, doku kesitlerini reçineye sızmak ve gömmek için metin protokolüne göre konfokal mikroskopi kullanarak.

Dokuyu PBS'den çıkarın ve her biri beş dakika boyunca üç kez durulamak için 0.1 molar kokoat tamponu kullanın. Reçine hazırlandıktan ve dokular elektron mikroskobu için boyandıktan sonra, metin protokolüne göre, doku blokları gömüldükten sonra sıvı bir ayırıcı madde ile kürlenmiş cam slaytlar arasında doku bloklarını sandviçlemek için kullanın, blokları 60 santigrat derecede 48 saat daha düz bir şekilde sertleştirin. Daha sonra, blokları bir diseksiyon kapsamı altında serbest bırakmak için slaytları ayırın, reçineye gömülü doku bloklarının yönünü konfokal mikrograflarınkiyle eşleştirin.

İlgilenilen hücreleri içeren bölgelerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, bloğu iletken bir epoksi içeren bir pim üzerine düz bir şekilde monte edin ve 30 dakika kurutun. Daha sonra bloğu düz bir yüzeye koyun ve ertesi gün gece boyunca 60 santigrat derecede kurutun. Bloğu kolloidal gümüş sıvı ile kaplayın.

Seri blok yüzü ile konfokal mikrografların korelasyonunu kolaylaştırmak için bloğun doğru açıda dilimlenmesini sağlamak için doku kesitlerini düz tutun. Metin protokolüne göre taramalı elektron mikroskobu yaptıktan sonra, Fiji'de 0.8 Gauss bulanıklık filtresi kullanarak SPEM görüntülerini ham DM üç formatından sekiz bit TIFF görüntülerine dönüştürün. TIFF görüntülerini filtreleyin.

Veri kümesini orijinal boyutun %25'ine kadar küçültün ve çeviri modunda eleme ile Fiji eklentisi doğrusal yığın hizalaması ile veri kümesini işlemek için gereken RAM belleği miktarını en aza indirmek için bir TIFF yığını olarak kaydedin. SPEM görüntü yığınını hizalayın ve kırpmak için kırpma 3D eklentisini kullanın. Verileri işlemek için, ilgilenilen hücreyi manuel olarak bölümlere ayırmak ve hacim oluşturmak için çizim modunda yüzeyler aracını ve 50 milisaniyelik çizim modunda kontur seçeneğini kullanın.

Daha düzgün işleme için hücrenin her diliminde veya daha hızlı işleme için her beş dilimde bir konturları izleyin. P-Y-Y-G-F-P fareyi kullanarak son görüntüleri 300 DPI veya daha yüksek bir çözünürlükte dışa aktarmak için anlık görüntü aracını kullanın. İnce bağırsağın distal kısmındaki tüm enteroendokrin hücreler burada gösterildiği gibi SBEM için tanımlanır ve işlenir.

Seçilen bir doku segmenti, optik olarak bir mikron aralıklarla yerleştirilmiş Zack görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi ile görüntülendi. Doku bloklarının boyutlarının optimize edilmesi, konfokal ve SBEM verileri arasındaki topografik korelasyon için kritik öneme sahiptir. Farenin ileumundaki bir enteroendokrin hücrenin bu hacimsel görüntüsü, yaklaşık 60 mikron epitel hücrelerinin altına uzanan belirgin bir nöro podu göstermektedir.

Konfokal Z yığınlarını tüm blok yüzünün bir SBEM görüntüsü ile ilişkilendirerek, ilgilenilen hücre burada A-P-Y-Y-G-F-P farenin distal kolonundan bir blokta tanımlanır. SBEM görüntülerindeki optik dilimlerle eşleşmesi için bloğun yönünü mümkün olduğunca düz tutmak önemlidir. Hücre tanımlandıktan sonra, salgı slelerini ve diğer hücre organellerini tanımlamak için yeterince yüksek bir çözünürlük olarak SBEM görüntülemesi yapılır.

Bu video, enteroendokrin hücrenin 3D görüntüsünü içerir. Veri seti, doku derinliğinin 45 mikronunu kapsayan 643 görüntü içerir. Hücre, salgı lezlerinin yanı sıra mikrovilluslarla dolu bir nöro kapsül içerir.

Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir bağırsağın tam ultra yapısını nasıl belgeleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız Duyusal hücre, ilgilenilen hücreyi veya hücreleri tanımlamak ve dokuyu seri blok faz taramalı elektron mikroskobu için işlemek için bir kılavuz olarak floresan kullanarak doğal bağırsak dokusundaki diğer epitel hücreleri arasında dağılır.