Name: Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin, maya büyüme kinetiği kullanarak protein parçalanma oranlarını sistematik olarak analiz etmeyi. Bu yöntem, ubiquitin-proteazom sistemi aracılığıyla proteolizi kantitatif olarak ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Makaleyi eleştirel bir şekilde gözden geçirdikleri için Dr. Yuval Reiss ve Dr. William Breuer'e ve Ura3-GFP ekran testinin geliştirilmesine yardımcı oldukları için Omri Alfassy'ye teşekkür ederiz. Ayrıca plazmitler ve suşlar için Dr. M. Hochstrasser ve Dr. R. Kulka'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilimler Akademisi (hibe 786/08) ve Amerika Birleşik Devletleri-İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı (hibe 2011253) tarafından finanse edilmiştir.

1. Hücre Kültürü
<ol>
	<li>Try467 (Tablo 2) gibi uygun oksotrofik maya hücrelerini, (a) bir URA3-degron füzyonu ve (b) plazmit seçimi ve bakımı için ek bir metabolik belirteç içeren bir plazmit ile dönüştürün. 
	NOT: Uygun bir plazmit örneği YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1-UV)'dir. Bu, immünoblotlama ile tespit için maya transkripsiyon faktörü Mat217, FLAG epitopundan türetilen bir degron olan Deg1, stabil bir ER proteini olan Vma12 ve Ura315,18'den oluşan bir füzyon proteini içeren bir maya bütünleştirici plazmittir (Şekil 3A). (Bu çalışmada kullanılan plazmitler ve uygun plazmitlerin ek örnekleri için Tablo 3'e bakınız.)</li>
	<li>Plazmid seçimi ve bakımı için, hücreleri amino asit seçim belirteçleri19 içermeyen uygun bir Sentetik Tanımlı (SD) ortam altında agar plakalarında tutun (Örneğin, Deg1-UV, SD-LYS seçici ortam altında seçilir ve korunur).</li>
	<li>Sabit bir faza ulaşılana kadar plazmit bakımı için uygun bir seçici SD ortamında 30 ° C'de O / N hücrelerini büyütün. İncelenecek numune sayısına bağlı olarak hücreleri test tüplerinde veya 96 oyuklu bir plakada büyütün (bölüm 2).</li>
</ol>
2. Analiz için Hücre Hazırlama
<ol>
	<li>Az sayıda numune (N≤15) tahlil edilecekse, hücreleri seyreltin ve ortamı aşağıdaki gibi değiştirin:
	<ol>
		<li>Bir O/N kültüründen 50 μl hücreyi, 96 oyuklu bir plakada (açık alt) oyuk başına 150 μl SD ortamı ile seyreltin. Not: İlk örnek boş olarak belirlenmiştir ve yalnızca orta içerir.</li>
		<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak600 oyuklu plakadaki numunelerin OD 96 değerlerini belirleyin.</li>
		<li>OD600 okumasını, boş okumanın değerinin çıkarıldığı seyreltme faktörü (x4) ile çarparak her bir kuyucuktaki gerçek OD600'ü hesaplayın. Beer-Lambert yasasına göre 1 cm'lik hesaplanmış bir yol uzunluğu elde etmek için 0,55'e bölerek elde edilen değerleri normalleştirin. Standart 96 oyuklu bir plakada 200 μl hücrenin OD600'ü ölçülürken bu değerin sabit olduğunu unutmayın.</li>
		<li>0.25'in OD600'üne eşdeğer miktarda maya hücreleri elde etmek için gereken tam hacmi hesaplayın ve bunu bir Eppendorf tüpüne aktarın.</li>
		<li>Hücreleri 1 dakika boyunca yüksek hızda (12.000 x g) döndürün.</li>
		<li>Süpernatanı çıkarın ve 0.25'ten OD600'ü elde etmek için hücreleri uygun seçici ortamın 1 ml'sinde (bkz. bölüm 3.1) yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Seyreltilmiş suşların 200 μl'sini 96 oyuklu bir plakada yeni bir kuyucuğa aktarın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Çok sayıda numune (N>15) test edilecekse, hücreleri seyreltin ve ortamı önceden OD600 ölçümü olmadan aşağıdaki gibi değiştirin:
	<ol>
		<li>96 oyuklu bir plakada O/N büyütülmüş 10 μl sabit hücreleri, uygun seçici besiyerini 190 μl (seyreltme 1:20) içeren yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın (bkz. bölüm 3.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Seçici Koşullar Altında Sıvı Kültürde Büyüme Kinetiği (GiLS)
<ol>
	<li>Ura3-degron raportörünü kullanarak büyüme ölçümleri için aşağıdaki ortamı kullanın:
	<ol>
		<li>Kısıtlayıcı olmayan koşullar altında maya büyümesinin pozitif kontrolleri için, plazmid seçici SD besiyeri kullanın (bkz. bölüm 1.2). Plazmit seçimi gerekmiyorsa, örneğin Deg1-UV gibi bütünleştirici bir plazmit kullanıldığında, gerekli tüm amino asitleri (SD tam) içeren SD ortamı kullanılabilir.</li>
		<li>Kısıtlayıcı koşullar altında büyümeyi ölçen deneysel numuneler için SD-URA ortamını kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Çok modlu bir mikroplaka okuyucuyu şu değere ayarlayın: 30 ° C'lik bir inkübasyon sıcaklığı, 15 dakikalık OD600 ölçüm aralığı ve her yedi dakikada bir 1 dakikalık yörüngesel ve doğrusal sallama döngüleri 
	NOT: Bu çift modlu çalkalama, hücrelerin homojen dağılımını elde etmek için optimize edilmiştir; Bununla birlikte, diğer sallama modları veya hatta sallama olmaması da işe yarayabilir.</li>
	<li>Hücreleri 30 ° C'de bir mikroplaka okuyucu O / N'de veya hücreler sabit faza (12-24 saat) ulaşana kadar inkübe edin.</li>
	<li>Ham verileri bir elektronik tablo dosyasına aktarın.</li>
	<li>Hücrelerin popülasyon boyutlarını iki katına çıkarmaları için minimum süreyi (saat cinsinden) hesaplayan özelleştirilmiş bir yazılım programı olan MDTcalc'ı kullanarak maya büyüme kinetiğini belirleyin (Minimum İki Katına Çıkma Süresi (MDT); ayrıntılar için bölüm 4'e bakın).</li>
</ol>
4. Minimum İki Katına Çıkma Süresinin (MDT) Hesaplanması: MDTcalc Algoritmasının İlkeleri

NOT: SD tam ortamda yetiştirilen Try467 maya hücrelerinin (Tablo 2) temsili bir örneğini kullanan MDTcalc algoritmasının ilkeleri, sırasıyla bir veri elektronik tablosu ve büyüme grafikleri gösteren Tablo 1 ve Şekil 1'de gösterilmektedir.

<ol>
	<li>Numune kuyucuğunda elde edilen okumaların her birinden ilgili kuyuda elde edilen OD600 boş değerlerini çıkarın. Işık yolu uzunluğunu düzeltmek için ortaya çıkan farkları 0,55'e bölün (96 oyuklu plakalar için). Gerçek maya büyüme eğrisini (OD600 / saat) üretmek için nihai değerleri (Tablo 1, Çev.) zamana karşı çizin (Şekil 1A).</li>
	<li>Logaritmik büyüme fazını doğrusal bir eğriye dönüştürmek için dönüştürülen değerlerin her biri için günlük2'yi (OD600) hesaplayın (Şekil 1B).</li>
	<li>0 zamanında başlayan ve N<10'a kadar her seferinde bir zaman noktası hareket eden 10 zaman puanı aralığının (N = 10) eğimini hesaplayın (Tablo 1, Eğim; Şekil 1C).</li>
	<li>Hücre popülasyonunun iki katına çıkması için gereken süreyi elde etmek için her eğimin ters değerini hesaplayın (Tablo 1, 1/Eğim; Şekil 1C). MDT'yi belirlemek için minimum 1/Eğim değerini hesaplayın (Tablo 1, siyah dikdörtgen; Şekil 1C). Örnekteki hücreler için hesaplanan MDT'yi çıkarın (Tablo 1, 1/Eğim, siyah dikdörtgen) seçilen zaman aralığından (Tablo 1, kırmızı dikdörtgenle özetlenmiştir, Şekil 1B, 1D). 
	NOT: SD-URA ortamındaki hücre büyüme hızı, MDT ile ters orantılıdır.</li>
</ol>
5. MDTcalc'ı kullanma
<ol>
	<li>Eklenen program dosyalarını bilgisayarda belirlenmiş bir klasöre kopyalayın.</li>
	<li>Büyüme verilerini içeren elektronik tablo dosyasının kaydedildiğinden ve kapatıldığından emin olun. Başlangıç ekranının görüntülendiğini görmek için MDTcalc uygulama programını açın.
	<ol>
		<li>Şekil 2'de gösterildiği gibi gerekli bilgileri girin:
		<ol>
			<li>"Dosya yolu"nun altında, e-tablo dosyasını bulmak için sağdaki dikdörtgeni tıklayın.</li>
			<li>"Sayfa adı" altında, ham verilerin bulunduğu e-tablo adını yazın.</li>
			<li>"Başlangıç konumu" altında, ilk örneğin 0. zamanının elektronik tablo koordinatını girin.</li>
			<li>'Zaman sütunu' altında, zaman noktası sütununun konumunu tanımlayan harfi ekleyin (zaman saniye cinsinden sağlanmalıdır).</li>
			<li>'Boş sütun' altında, boş sütunun konumunu tanımlayan harfi ekleyin (genellikle, ancak 96 oyuklu plakanın A1 kuyusuna değil).</li>
			<li>'OD değeri' altında, MDT hesaplamasının başlatılması için gereken minimum dönüştürülmüş OD600 değerini seçin (genellikle 0,15-0,25). Bu değerin ayarlanması, aşırı seyreltme nedeniyle gecikme fazındaki kültürler için MDT hesaplamalarını önler, böylece MDT yalnızca tanımlanan OD600 değerine veya daha yüksek değere ulaşan numuneler için hesaplanır.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Son değer girildikten sonra, ekranın altındaki 'hesapla' düğmesine basın. Sağdaki ilerleme çubuğunun kademeli olarak yeşile döndüğünden emin olun. Hesaplama işlemi sırasında elektronik tablo dosyasını açmayın.</li>
		<li>MDT hesaplaması tamamlandığında ekranda otomatik olarak görünen iki veri kümesini bir elektronik tabloya aktarın. Verilerin şunları içerdiğinden emin olun: (a) minimum OD değeri testini geçen her kuyu için MDT değeri (bölüm 5.2.1.6'da ayarlandığı gibi) ve (b) MDT'nin hesaplandığı aralığın başlangıç zaman noktası (Başlangıç zamanı).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li>
<li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li>
<li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+the+cell+cycle%3A+with+this+RING+I+do+thee+destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li>
<li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT%CE%B12+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li>
<li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica.%2C+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li>
<li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li>
<li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms%3A+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li>
<li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope%2Fendoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li>
<li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li>
<li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li>
<li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator%3A+the+yeast+2+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li>
<li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li>
<li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuthrie%2C+C+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. 194, Academic Press. (1991).</li>
<li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li>
<li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li>
<li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li>
<li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li>
<li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, 'Seçici koşullar altında Sıvı kültürde büyüme kinetiği' (GiLS) olarak adlandırılan, nispi protein bozunma oranlarını belirlemek için hücre büyümesine dayalı bir tahlil açıklıyoruz. GiLS testinin çeşitli avantajları vardır: Kurulumu basittir, veri toplama ve analizi basittir ve son derece modülerdir. Sonuç olarak GiLS, yüksek verimli uygulamalar için otomasyona uyarlanabilen, kullanıcı dostu çok kuyulu plaka formatında birden fazla numuneye aynı anda uygulanabilir. En önemlisi, GiLS yüksek oranda tekrarlanabilir, ...

Ubikitin-proteazom bozunma sistemi, tüm ökaryotlarda protein homeostazının sürdürülmesinde rol oynayan önemli bir düzenleyici makinedir. UPS başlangıçta birden fazla ubikuitin molekülünü bir hedef proteine konjuge eder, ardından poli-ubikuitin etiketli protein 26S proteazomu tarafından bozunur. Çoğu durumda, ubikitin aracılı bozunma için hız sınırlayıcı adım, E2 konjuge edici enzimler ve E3 bağlayıcı enzimlerin (E3 Ligazlar) aracılık ettiği substrat ubikitilasyonudur1. Sonuç olarak, spesifik proteinlerin hücre içi stabilitesi, ubikitin konjugasyonuna karşı duyarlılıklarını ve aynı kökenli ubikitilasyon enzimlerinin aktivitesini yansıtır.
E3 ligazları, UPS'in temel substrat tanıma bileşenleridir. Bu nedenle, bu enzimler, kararlı muadillerinde bulunmayan veya maruz kalmayan substratları içindeki degronları tanır 2. Örneğin, hücre döngüsünün birçok düzenleyicisi, hücre döngüsünün ilerlemesini düzenli tutmak için zamansal olarak belirli bir şekilde sentezlenmeli ve parçalanmalıdır. Bu proteinlerin bozunması genellikle hücre sinyalizasyonu ile düzenlenmiş kinazların aracılık ettiği fosforilasyon ile kontrol edilir 3,4. Öte yandan, anormal şekilde katlanmış proteinler, kriptik degronlar aracılığıyla tanınır. Bunlar normalde yerel yapıda gizlenen ve yapı bozulması üzerine açığa çıkan bölgelerdir. Bu tür degronlar, hidrofobik alanlar 5-7 ve içsel olarak düzensiz segmentler8'i içerir. 
Retikülosit lizatları9'da protein bozunması ve temellerinin karakterizasyonu için ubikitin sisteminin ufuk açıcı keşfinden bu yana, maya genetiği, ubikitin sistemi10'un birçok bileşeninin keşfedilmesinde etkili oldu. KGK tarafından protein bozunmasının sistematik analizi için bir model organizma olarak mayanın başarısı, esas olarak UPS'in tüm ökaryotlarda4 yüksek oranda korunmuş olması ve deneysel bir sistem olarak uygunluklarından kaynaklanmaktadır. Gerçekten de, maya bazlı sistemler, ubikitilasyon mekanizmasının etki mekanizmalarını deşifre etmek için yaygın olarak kullanılır.
Biyokimyasal yollarla protein yıkımını incelemek genellikle hücre ekstraktlarının hazırlanmasını gerektirir. Hayvan hücresi proteinleri, protein etkileşimlerini ve işlevini koruyan nispeten hafif koşullar altında ekstrakte edilebilirken, maya11'de sağlam bir hücre duvarının varlığı, protein geri kazanımını etkileyebilecek önemli ölçüde daha sert bozulma koşulları gerektirir. Gerçekten de, maya hücresinin bozulması için farklı prosedürler, nispi hücresel bolluklarını doğru bir şekilde temsil eden miktarlarda bozulmamış proteinleri geri kazanma kapasitelerinde önemli ölçüde farklılık gösterir. Spesifik proteinlerin bozunma oranlarını belirlemek için kullanılan farklı yöntemlerde daha fazla yanlışlık vardır: Spesifik proteinleri12 izole etmek için metabolik etiketlemeye dayalı 'nabız kovalama' deneyleri ve ardından immünopresipitasyon genellikle kesin olarak nicel değildir. Bu nedenle, protein bozunması bu yöntemle karşılaştırıldığında, sonuçların yorumlanmasında ekstra dikkatli olunmalıdır. Bu dezavantajı aşmak için alternatif bir sikloheksimid (CHX) kovalama testi kullanılabilir12. Bu tahlilde, translasyon inhibitörü hücre kültürlerine eklenir ve daha sonra protein kararlı durum seviyelerindeki zamansal değişiklikler izlenir. Bununla birlikte, CHX'in kullanımı, protein sentezinin uzun süreli inhibisyonu sitotoksik olduğundan, nispeten kısa yarılanma ömrüne (< 90 dakika) sahip proteinlerle sınırlıdır. Özellikle, yukarıda belirtilen tahlillerin her ikisi de, her zaman mevcut olmayan proteine özgü antikorların kullanılmasını gerektirir.
Bu teknik sınırlamaların üstesinden gelmek için, araştırmacılar hücre ekstraksiyonu ve doğrudan protein kullanımı gerektirmeyen çeşitli yaklaşımlar geliştirdiler. Bir yaklaşım, esansiyel metabolik enzimleri kodlayan genlerin silinmesiyle elde edilen oksotrofik maya suşlarının kurulmasına dayanır. Bu tür genler, amino asit biyosentezi için gerekli enzimleri kodlayan HIS3, LEU2, LYS2 ve TRP1'in yanı sıra, pirimidin ribonükleotid biyosentezinin temel bir enzimi olan OMP dekarboksilazı (Ura3) kodlayan URA3'ü içerir. Ura3, protein bozunma çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tahlillerde, Ura3'ün yapısal ekspresyonu, urasil eksikliği olan ortamda13 ura3 hücrelerinin büyümesini kurtarır. Sonuç olarak, bir degronun füzyonu yoluyla Ura3'ün dengesizleştirilmesi, urasil içermeyen minimal ortamda hücre büyümesini azaltabilir. Bu yöntem, bozunma belirleyicilerinin5, E3 ligazlarının14 ve yardımcı ubikitilasyon faktörlerinin15 tanımlanması ve yeni UPS degronların16 keşfi dahil olmak üzere çeşitli protein bozunma çalışmalarında kullanılmıştır. Bu yöntemlerin tümü, tahlil okuması olarak agar plakaları üzerinde hücre büyümesini kullandı. Bununla birlikte, büyüme kriteri (pozitif/negatif büyüme), sağlam ve verimli olsa da, çoğunlukla kalitatiftir ve bir degronun gücünü veya çeşitli yardımcı bozunma faktörlerinin göreceli katkısını değerlendirmek için önemli olan nicel bilgi sağlamaz.
Bu nedenle, URA3-degron füzyon sistemi tarafından protein bozunmasının sistematik ve kantitatif analizini sağlayan maya vektörleri ve tarama yöntemleri geliştirdik ve kullandık. Protokol, Seçici koşullar (GiLS) altında Sıvı kültürde Büyüme kinetiğini ölçen kullanımı kolay bir teste ve standart büyüme eğrilerinin oluşturulmasına dayanmaktadır. Maya büyüme kinetiği üç ana faz ile karakterize edilir - gecikme, üstel (log) ve durağan faz. Ura3-degronun ekspresyon seviyeleri ile belirlenen seçici koşullar altında log fazı sırasında maya replikasyon kinetiğinin hesaplanması, protein bozunmasının tarafsız bir kantitatif ölçümünü sağlar. Bu yöntem, birden fazla suşta ve çeşitli koşullar altında aynı anda birden fazla UPS alt tabakasının bozunma oranlarının ölçülmesi ve karşılaştırılması için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Difco mayası nitrojen bazı, amino asitler ve amonyum sülfat içermez</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>SD minimal ortamda maya büyümesi için. Tedarik edilecek amino asitler şunlardır: Arginin, Histidin, İzolösin, Lösin, Lizin, Metiyonin, Fenilalanin, Treonin, Triptofan</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Adenin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Urasil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>En Yüksek Amino asitler</td><td> saflık mevcut&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Başka herhangi bir uyumlu marka kullanılabilir</td></tr><tr><td>Sikloheksamsid&nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>Çalışma konsantrasyonu 0.5 mg / ml</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO serisi</td><td>Tecan</td><td></td><td>Maya inkübasyonu ve OD600 ölçümleri için. Başka herhangi bir uyumlu sıcaklık kontrollü okuyucu kullanılabilir.</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>Deneysel yazılım</td></tr></tbody></table>

protein parçalanabilirliklerinin sistematik analizi muhabiri tabanlı büyüme deneyi

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Ubikitin-proteazom sistemi (UPS) tarafından protein bozunma bütün ökaryot protein homeostazı için önemli bir düzenleyici mekanizmadır. Hücre içi protein parçalanmasını belirleme standart yaklaşım protein düşüş kinetiğe için biyokimyasal deneyleri dayanır. Bu yöntemler, genellikle, zahmetli ve zaman alıcı ve birden çok alt-tabakalar ve ayrıştırma koşulları değerlendirme amaçlı deneyler bu nedenle uygun değildir. Bir alternatif olarak, hücre büyümesi dayalı tahliller kantitatif protein seviyelerindeki azalma şeklinde tespit edemez bunlar genellikle geleneksel biçimi, son-nokta deneylerde, olduğu, geliştirilmiştir. Burada sadakatle maya hücresi büyüme kinetikleri olarak bağlanarak protein yıkımı oranlarındaki değişiklikleri belirleyen bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem URA3 ürasil oksotrofi maya hücreleri bir dışsal olarak ifade raportör protein tarafından kurtarıldı -silinmesi kurulmuş bir seçim sistemine dayanır, Temel URA3 geni ve bozunma belirleyici (degron) arasında bir füzyon oluşturulmuştur. Raportör proteini, bozulma oranı degron belirlenir kaydıyla, sentez oranının sabit olacağı şekilde tasarlanmıştır. Urasil-eksikli ortam hücre büyümesi URA3 nispi seviyelerine orantılı olduğu için, büyüme kinetikleri, raportör protein degradasyonu tamamen bağlıdır. Bu yöntem doğru bir hücre içi protein yıkımı kinetik değişiklikleri ölçer. (A) E2 bağlayıcı enzim yapı-fonksiyon (c) tanımlanması ve yeni degrons karakterizasyonu analizleri proteoliz (b) bilinen ubikuitinden conjugating faktörlerin göreceli katkısını Değerlendirme: Bu uygulanmıştır. Aynı zamanda diğer hücresel yolların fonksiyonlar ile ilgili bir protein seviyelerinin izlenmesini değişikliklere adapte edilebilir degron- URA3 merkezli bir sistemin uygulanması, protein degradasyon alanını aşar.

Bir raporlayıcı substratın yıkımında Doa10 yolu enzimlerinin rolünün araştırılması
GiLS yönteminin geçerliliğini test etmek için geleneksel bir degredasyon analizi ile karşılaştırması yapılmıştır. Bu deney, ER membranına lokalize olan Doa10 E3-ligaz kompleksinin20,21 bileşenlerinin, protein kalite kontrol raporlayıcı substratı Deg1-VU'nun degredasyonuna olan göreceli katkısını değerlendirmektedir (Şekil 3A). Deg1-VU plazmidi, w...

Burada, ubikitin-proteazom sistemi tarafından nispi proteoliz oranını ölçmek için sağlam bir biyolojik testi açıklıyoruz. Tahlil okuması, temel bir metabolik belirteçle kaynaşmış bir bozunma sinyali içeren bir raportör proteinin hücresel seviyelerine bağlı olan sıvı kültürdeki maya büyüme hızıdır.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Bu prosedürün genel amacı, protein bozunma oranlarındaki varyasyonları, bunları sıvı kültürdeki maya büyümesinin kinetiğine bağlayarak sistematik bir şekilde belirlemektir. Bu, uygun bir seçici ortamda gece boyunca durağan faza bir metabolik belirteçle birleştirilmiş bir bozunma sinyalinden oluşan bir raportör proteini eksprese eden ilk büyüyen hücreler tarafından gerçekleştirilir. Daha sonra, hücrelerin büyüme kinetiğini belirlemek için hücrelerin optik yoğunluğu ölçülür ve daha sonra log fazı sırasında hücrelerin minimum iki katına çıkma süresi, belirlenmiş bir yazılım programı kullanılarak büyüme kinetiğinden hesaplanır.Sonuç olarak, hesaplanan minimum ikiye katlama süresi, protein bozunma kinetiğindeki varyasyonları tanımlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin, siklamat veya nabız kovalama bozunma testleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, tekniğimizin kurulumunun basit olduğunu ekledi. Veri toplama ve analizi basittir ve makale tasarımı son derece modülerdir.Bu yöntem, ubikitin saksı sistemi tarafından yanlış katlanmış tencere tanıma için hangi elementlerin gerekli olduğu gibi, pot bozunması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem içi

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Canlı hücreler içinde ubiquitin-proteasome etkinliğini izlemek için bir yöntem tarif edilmektedir. A degron-İstikrarsızlaşmış GFP-(GFP-DGN) ve bir sabit GFP-dgnFS füzyon proteini oluşturulur ve bir lentiviral ifade vektörü kullanılarak hücre içine transdüksiyon ile uygulanır. Bu teknik, ubiquitin-proteasome etkinlik kolaylıkla Epifloresans ya da akış sitometrisi kullanılarak ölçülebilir hangi bir sabit GFP-dgn/GFP-dgnFS eksprese eden hücre soyu üretmek için olanak sağlar.

Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Bu videoda, proteazom aktivitesini bloke eden, yanlış katlanmış, mutant proteinlerin, bir floresan etikete kaynaşmış, ubikitine bağımlı proteazomal bozunmaya uğramasını önleyen proteazom inhibitörleri kullanılarak hücre bazlı bir protein agregasyon testini gösteriyoruz, bu da hücre sitoplazması içinde birikmelerine yol açar. Protein agregatları daha sonra floresan mikroskobu ile görselleştirilir ve ölçülür.

Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, deterjan fraksiyonlaması ile birlikte sikloheksimid muamelesi kullanılarak yanlış katlanmış proteinler için bir bozunma testi açıklanmaktadır. Bu yöntem, yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemeye ve protein döngüsünün derinlemesine mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine ​​bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

Genetik raportör testi, DNA dizileri ve gen düzenleyici aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemek için iyi kurulmuş ve güçlü bir araçtır. Aday düzenleyici elemanların, tanımlayıcı dizi etiketlerini taşıyan raportör genlere bağlanması, bu tahlillerin büyük ölçüde paralelleştirilmesini sağlar.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.

HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Öğrenin, maya büyüme kinetiği kullanarak protein parçalanma oranlarını sistematik olarak analiz etmeyi. Bu yöntem, ubiquitin-proteazom sistemi aracılığıyla proteolizi kantitatif olarak ölçer.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Daha fazla video keşfet