Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, protein bozunma oranlarındaki varyasyonları, bunları sıvı kültürdeki maya büyümesinin kinetiğine bağlayarak sistematik bir şekilde belirlemektir. Bu, uygun bir seçici ortamda gece boyunca durağan faza bir metabolik belirteçle birleştirilmiş bir bozunma sinyalinden oluşan bir raportör proteini eksprese eden ilk büyüyen hücreler tarafından gerçekleştirilir. Daha sonra, hücrelerin büyüme kinetiğini belirlemek için hücrelerin optik yoğunluğu ölçülür ve daha sonra log fazı sırasında hücrelerin minimum iki katına çıkma süresi, belirlenmiş bir yazılım programı kullanılarak büyüme kinetiğinden hesaplanır.

Sonuç olarak, hesaplanan minimum ikiye katlama süresi, protein bozunma kinetiğindeki varyasyonları tanımlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin, siklamat veya nabız kovalama bozunma testleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, tekniğimizin kurulumunun basit olduğunu ekledi. Veri toplama ve analizi basittir ve makale tasarımı son derece modülerdir.

Bu yöntem, ubikitin saksı sistemi tarafından yanlış katlanmış tencere tanıma için hangi elementlerin gerekli olduğu gibi, pot bozunması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk olarak, ubikitin çıkarılmasını içeren proteinleri alt kümelerinden tanımlamak için bir tarama yapmak istediğimde aklıma geldi. Bu yüzden birden fazla örneği karşılaştırmanın basit bir yolunu buldum: Hücreleri analize hazırlamak için.

TRY 4 67 gibi uygun oks atrofik maya hücrelerini, bir U, üç Deron füzyonu ve plazmit seçimi ve bakımı için ek bir metabolik belirteç içeren bir plazmit ile dönüştürerek başlayın. Plazmid seçimi ve bakımı için, hücreleri amino asit seçim belirteçleri olmayan uygun bir sentetik tanımlı ortam altında agar plakaları üzerinde büyütün, hayatta kalan kolonileri yamalara aktarın, hücreleri yamalardan sıvı ortama aktarın ve sabit bir faza ulaşılana kadar gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra 15 numune veya daha azı için, gece boyunca kültürden 50 mikrolitre hücreyi oyuk başına 150 mikrolitre sentetik tanımlı ortam ile seyreltin.

Şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakada, numunelerin OD 600 değerlerini belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Daha sonra, 0.25'lik bir OD 600'e eşdeğer bir miktarda maya hücreleri elde etmek için gereken tam hacmi hesapladıktan sonra, hücreleri 12.000 kez G'de bir dakika boyunca döndürün ve oda sıcaklığında, hücreleri uygun seçici ortamın bir mililitresinde yeniden süspanse edin 0.25'lik bir OD 600 elde etmek ve seyreltilmiş suşun 200 mikrolitresini, 15'ten büyük olduğunda yeni bir 96 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın Numuneler test edilecektir. Seçici koşullar altında dönüştürülmüş maya hücrelerinin büyüme kinetiğini ölçmek için, gece boyunca büyütülen sabit hücrelerin 10 mikrolitresini, 190 mikrolitre uygun seçici ortam içeren yeni bir 96 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın.

Ardından, çok modlu bir mikroplaka okuyucuyu 30 santigrat derece OD 600 inkübasyon sıcaklığına, 15 dakikalık ölçüm aralıklarına ve her yedi dakikada bir dakikalık yörüngesel ve doğrusal sallama döngülerine ayarlayın. Daha sonra hücreleri Mikroplaka okuyucuda 30 santigrat derecede 12 ila 24 saat inkübe edin. Hücreler durağan faza ulaştığında, MDT Calc kullanarak maya büyüme kinetiğini belirlemek için ham verileri bir elektronik tablo dosyasına aktarın.

Büyüme verilerini içeren elektronik tablo dosyasının kaydedildiğinden ve kapatıldığından emin olun. Ardından dosya yolu altında MDT Calc uygulama programını açın. Elektronik tablo dosyasını sayfa adı altında bulmak için dikdörtgene tıklayın.

Başlangıç konumu altında ham verilerin bulunduğu elektronik tablo adını girin. Zaman sütununun altına ilk örneğin sıfırı olacak şekilde elektronik tablo koordinatını girin. Boş sütun altına zaman noktası sütununun konumunu saniye cinsinden tanımlayan harfi girin, boş sütunun konumunu tanımlayan harfi girin.

Örneğin, 96 kuyulu plakanın A bir kuyusu. Önümüzdeki. OD değeri altında, MDT hesaplamasının başlatılması için gereken en düşük dönüştürülmüş OD 600 değerini seçin. MDT'nin yalnızca tanımlanan D 600 değerine veya daha yükseğe ulaşan numuneler için hesaplandığından emin olmak için genellikle 0,15 ila 0,25.

Son değer girildikten sonra, hesapla düğmesine tıklayın ve sağdaki ilerleme çubuğunun kademeli olarak yeşile döndüğünü onaylayın. Son olarak, MDT hesaplaması tamamlandığında ekranda otomatik olarak görünen iki veri kümesini yeni bir elektronik tabloya aktarın. Verilerin, minimum OD değeri testini geçen her kuyu için MDT değerini ve bu temsili deneyde MDT'nin hesaplandığı aralığın başlangıç zamanını içerdiğini onaylayın.

Yabani tip ve çeşitli mutant suşlar arasındaki protein bozunma kinetiğindeki nispi farklılıklar karşılaştırıldı: başlangıçta yabani tip U, BBC altı, delta UBC yedi delta veya D bir VMAU üç eksprese eden DOA 10 delta hücreleri, sentetik tanımlı tam ortamda büyütüldü. Daha sonra solungaçları ölçmek için hücreler yıkandı ve sentetik tanımlı ortamda inkübe edildi. İncelenen genlerden herhangi birinin silinmesinin hücre büyümesini etkileme olasılığı hariç olmak üzere, sentetik tanımlı tam ortamda yetiştirilen tüm suşlar için eksi urasil benzer büyüme eğrileri ve hesaplanan MDT gözlendi.

Buna karşılık, sentetik tanımlı ortam eksi urasil'deki inkübasyon, vahşi tip hücrelerin zayıf büyümesine neden olurken, mutant suşlarda sadece küçük bir büyüme kusuru gözlendi. UBC yedi, DEG bir VMAU üç bozunması için kesinlikle gereklidir ve çeşitli E iki mutantının kısmi etkilerinin bile doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Buna göre, aktif bölge mutantları ile UBC yedi eksprese eden hücrelerde hızlı büyüme kinetiği gözlenir, C 89 s ve N 81 A.In ilavesi, DEG bir VMA ETH'yi dolaylı olarak engellediği tahmin edilen iki mutantın üç bozunması V 20 5G ve H 90 4K'nın da vahşi tip UBC yediye kıyasla hücre büyümesini arttırdığı bulundu, aktif site mutantlarından daha az derecede de olsa.

Bu nedenle, solungaç yöntemi, çeşitli bozunma faktörlerinin bir raportör substratın stabilitesine nispi katkısının doğru bir şekilde ölçülmesi için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, protokolün protein bozunma oranlarındaki küçük farklılıklara karşı hassas olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu bir avantajdır, ancak aynı zamanda bu prosedürün ardından kullanılacak Deron'un tasarımında ve doğrulanmasında dikkatli olunması gerektiği anlamına gelir.

Yüksek verimli floresan mikroskobu gibi diğer yöntemler, raportör proteinlerin agregasyon eğilimi nedir gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, muhabire bir GFP etiketi de eklemek iyi bir fikirdir. Bu videoyu izledikten sonra, bir MİKROPLAKA okuyucu ve belirlenmiş yazılım programımızı kullanarak protein bozunma hızındaki değişiklikleri sistematik bir şekilde nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.