Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Bu prosedürün genel amacı, osteoklastları fare kemik iliğinden çok sayıda izole etmektir. Bu, ilk olarak ötenazi uygulanmış farelerden kemiklerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hücreler kemik iliğinden bir havan topu ve havan tokmağı kullanılarak kemikleri gerçek tamponda ezmek için serbest bırakılır.

Daha sonra kemik iliği çözeltisi, yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı üzerine katmanlanır ve yoğunluk gradyan hücre ayrımı gerçekleştirilir. Son olarak, ilgilenilen hücreleri içeren tabaka aspire edilir ve hücreler kemik iliği mikrofaj indüksiyon ortamına yerleştirilir. Sonuç olarak, tuzak boyama, çok sayıda osteoklastın varlığını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin etkileri, hematopoez için bir kemik iliği boşluğu oluşturulamamasına bağlı ölümcül yenidoğan hastalığından, osteoporoz gibi patolojilerle daha sık karşılaşmaya kadar ciddiyeti değişebilen değişmiş osteoklast fonksiyonu ile ilişkili hastalıklara kadar uzanır, çünkü fare kemik iliğinden çok sayıda osteoklastı izole etmek için güvenilir bir yöntem üretir. Başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayrımını, orta ila oda sıcaklığına getirin. Yoğunluk gradyanlı hücre ayırma ortamıyla birlikte kullanılmak üzere oda sıcaklığında 50 mililitrelik bir faks tamponu yerleştirin.

Metin protokolüne göre ek ortam hazırladıktan ve bir C 57 siyah altı fareye ötenazi yaptıktan sonra, fareyi bir diseksiyon tahtasına yerleştirin ve %70 etanol kullanın. Püskürtmek için fera, tibia, hum, göz ve omurgayı hasat edin. Sonra kemikleri buz üzerine tampon içine yerleştirin.

Daha sonra, temiz kağıt mendil kullanarak, kas ve yumuşak dokuyu kemiklerden çıkarın. Kemikleri bir havan içine koyun ve üç mililitre gerçek tampon ile havaneli havan tokmağı yapın ve hafifçe ezin. Daha sonra kan lekeli sıvıyı aspire edin ve 70 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe geçirin.

Ezilmiş kemiğe beş mililitre daha efekt tamponu ekleyin ve sıvıyı süzgeçten 50 mililitrelik tüpe aktarmadan önce daha fazla ezin. Kemik iliğini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 Gs'de peletlemeden önce sıvı artık kırmızı lekelenmeyene kadar bu işleme devam edin. Bir gradyan ayrımı yapmak için, süpernatanları hücre peletinden aspire edin ve yeniden canlandırmak için 10 mililitre faks tamponu kullanın.

Peleti askıya alın, oda sıcaklığında yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamının konik tüpünü yaklaşık 30 dereceye kadar eğin ve pipetin ucu tüpün iç üst yüzeyine doğru elektrikli bir pipet kullanın. Kemik iliği solüsyonunu, hızlanma veya yavaşlama olmadan oda sıcaklığında bir santrifüj kullanarak yavaşça ortama katmanlayın. Degradeyi 15 dakika boyunca 200 Gs'de döndürün.

Ardından, ilgilenilen hücreleri içeren bulanık orta tabakayı aspire edin ve bunları yeni bir konik tüpe aktarın. Hücreleri yıkamak için 20 mililitre buz gibi soğuk faks tamponu ekleyin. Ardından, hücre sayımını takiben son hücre peletini yeniden süspanse etmek için bir mililitre kemik iliği mikrofaj uyarıcı ortam kullanın.

24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna iki mililitre mikrofaj uyarıcı ortam yerleştirildi. Daha sonra her bir oyuğa 200.000 hücre ekleyin, bu da yeterli in vitro osteoklast kültürünü sağlayacak bir hücre yoğunluğudur. Plakayı nazikçe çalkalayın ve ortamı üç gün boyunca değiştirmeden 37 santigrat derecede inkübe edin.

Üçüncü günden sonra, ortamı kemik iliği osteoklast indüksiyon ortamı olarak değiştirin ve beş ila yedi gün boyunca günlük olarak değiştirmeye başlayın. Bu noktada büyük çok çekirdekli osteoklastlar görünür olmalıdır. Burada görüldüğü gibi boyama ve rezorpsiyon testi için metin protokolüne bakın.

Tartarat dirençli test kullanılarak yüksek sayıda osteoklast doğrulanabilir. Osteoklastları boyayan fosfotatlar, bu videoda gösterilen protokol kullanılarak çok çekirdekli büyük mor hücreler olarak görselleştirilir. Hücre başına 30 adede kadar çekirdeğe sahip osteoklastları izole etmek yaygındır.

Mineralize bir yüzey kullanmak, in vitro osteoklast rezorptif aktivitesini değerlendirmek için altın standart yöntem olarak kabul edilir. Bu şekilde, 10 x büyütmede parlak alan mikroskobu, osteoklast rezorptif kapasitesinin belirlenmesine izin veren, siyahla belirtildiği gibi oluşturulan mineralize yüzey veya rezorptif çukurların bir yüzdesini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, fare kemik iliğinden çok sayıda osteoklastın nasıl güvenilir bir şekilde izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.