Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerin C iki'de karşılaştıkları doğal hücre dışı matrisi taklit etmek amacıyla, tam diferansiye olmuş yetişkin insan hücrelerinin birlikte kültüre edilmesine olanak tanıyan üç boyutlu fazik bir iskele elektro eğirmektedir. Bu işlem, öncelikle rastgele hizalanmış bir mikrolif iskele elektro eğirerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise, rastgele hizalanmış bir nanolif tabakasını doğrudan mikrolif iskelenin üzerine elektro eğirerek bifazik bir iskele oluşturmaktır.

Ardından, ayrı bir hizalanmış nanofiber iskele elektro-eğirme yöntemiyle üretilir. Son adım, her iskeleye ilgili hücre tipinin ekilmesi ve iskelelerin tek bir yapı olarak perfüzyonlu bir biyoreaktör sisteminde birlikte kültüre edilmesidir. Sonuç olarak, medyatör salınımının ölçümü ve immün boyama yoluyla çok hücreli etkileşimler analiz edilebilir.

Konstrüksiyon. Bu tekniğin, 2D transforme edilmiş membranlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, elektriksel iskelelerin fizyolojik olarak ilgili bir morfoloji sağlamak üzere uyarlanabilen 3D lifli bir ortam sunmasıdır. Bu yapı daha gözeneklidir ve birden fazla hücre tipinin ortak kültürlenmesine olanak tanır.

Bu yöntem, in vitro bir model olarak kohortlanmış, hastalıklı veya sağlıklı insan hücrelerini kullanarak kararlı bir platform sağlar. Bu durum, insan hastalıklarıyla olan ilgileri açısından sınırlılığı bulunan hayvan modellerine olan bağımlılığımızı azaltmaya ve deneylerde kullanılan hayvan sayısını düşürmeye yardımcı olacaktır. Bu yöntem astım ve KOAH gibi hastalıklar hakkında bilgi sağlayabilse de, bağırsak inflamatuar hastalıklarının incelenmesi veya kimyasal testler için bir cilt modeli geliştirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Başlamak için, %8, %10 ve %30 PET'i klorometan ve trikloroasetik asidin bire bir karışımları içerisinde çözerek üç farklı 10 mililitrelik PET çözeltisi hazırlayın. PET'in ertesi güne kadar çözünmesi için çözeltileri oda sıcaklığında gece boyunca karıştırın. PET çözeltilerini şırıngalara aktarın ve %8'lik karışımı içeren şırıngaya 23 gauge bir iğne, %10 ve %30'luk PET çözeltilerini içeren diğer iki şırıngaya ise 18 gauge iğneler takın.

Mikrolif iskeleyi hazırlayın. İlk olarak, %30 PET çözeltisi içeren şırıngayı, iğne ucu aşağıya bakacak şekilde şırınga pompasına yerleştirin. Mandreli iğne ucundan 15 santimetre uzaklığa konumlandırın ve iğnenin tamburun merkezine yönlendirildiğinden emin olun.

Pozitif elektrik besleme hattını metalik bir timsah klips kullanarak iğne ucuna bağlayın ve toprak hattını banana sokete bağlayarak manl'ı topraklayın. Motoru çalıştırın ve manl hızını 60 RPMs olarak ayarlayın. Saat başına 2,0 milliliters akış hızı sağlamak için şırınga pompasını açın.

Mikrolif iskeleler oluşturulurken, sistemdeki havayı uzaklaştırarak sistemi hazırlamak amacıyla, çözelti iğne ucundan çıkana kadar pompanın çalışmasına izin verin. Ardından, şırınga pompasındaki pompayı durdurun.

Dışarı atılacak toplam çözelti hacmini iki mililitreye ayarlayın ve pompayı başlatın. Ardından, iğne ile mandrel arasında 14 kilovoltluk bir potansiyel uygulayarak, 30%PET çözeltisinin iki mililitresi elektro eğirme işlemiyle tamamlanana kadar bir saat boyunca elektro eğirme işlemini gerçekleştirin; mikro fiber iskele hala mandrel üzerindeyken voltaj potansiyelini kapatın. Timsah klipsi çıkarın ve 30%PET çözeltisi içeren şırıngayı 8%PET çözeltisi içeren şırınga ile değiştirin.

Ardından timsah klipsi 23 gauge iğneye yeniden bağlayın. Şırınga pompasının akış hızını saatte 0.5 mililitre olarak değiştirin ve çözelti uçtan akana kadar şırınga pompasını çalıştırarak iğneyi hazırlayın. Mandrel 60 RPM hızla dönmeye devam ederken, iğne ucu ile mandrel arasına 14 kilovolt potansiyel uygulayın ve şırınga pompası tarafından ekstrüde edilecek toplam hacmi iki mililitre olarak ayarlayın.

8% PET çözeltisinin iki mililitresi elektro eğirme işleminden geçene kadar dört saat boyunca elektro eğirme yapın. Elektro eğirme işlemi tamamlandığında, güç kaynağını ve mandreli döndüren motoru kapatın. Mandrel yüzey alanı boyutunda 2B bir iskale tabakası elde etmek için bifazik iskaleyi bir bıçak yardımıyla mandrel genişliği boyunca kesin.

Hizalanmış PET iskeleler hazırlamak için, %10 PET çözeltisi içeren şırıngayı, iğne ucu alta gelecek şekilde şırınga pompasına yerleştirin. Ardından, timsah klipsini iğneye bağlayın. Akış hızını saatte 0.5 milliliters olarak ayarlayın ve iğneyi PET çözeltisi ile doldurarak havasını alın.

Ardından motoru çalıştırın ve mandrel dönüş hızını 2000 RPM olarak ayarlayın. Sonra, şırınga pompasını açın. Voltaj kaynağını 14 kilovolt'a ayarlayın ve iki mililitre çözelti elektro eğirme işlemiyle çekilene kadar güç kaynağını dört saat boyunca çalıştırın.

Elektro eğirme işlemi tamamlandığında, güç kaynağını ve motoru kapatın. Hizalanmış 2 boyutlu bir iskale tabakası elde etmek için iskeleyi mandrel genişliği boyunca bir bıçakla kesin. Elektrostatik yükü azaltmak için elektro eğirme ile üretilen iskeleleri alüminyum folyoda saklayın.

SPU tabakalardan bifazik veya hizalanmış iskale diskleri çıkarmak için 0,8 milimetre çapında bir biyopsi kalemi kullanın. Ardından, bifazik iskale diskini toksik olmayan akvaryum yapıştırıcısı kullanarak bir contaya yapıştırın. Contaları ve iskaleleri 12 kuyucuklu bir doku kültürü plağına yerleştirin.

Contaları ve iskeleleri, iskelelerin her iki tarafına 30 dakika boyunca ultraviyole I radyasyonu uygulayarak sterilize edin. Ardından, bir gece boyunca 4 °C'de %20'lik antibiyotik antimikotik solüsyonunda bekletin. İskeleleri 3 kez PBS ile yıkayın ve kullanılana kadar 4 °C'de PBS içinde saklayın.

Bifazik iskeleleri PBS'den taze bir 12 kuyucuklu plakaya aktarın ve %10 FCS ile desteklenmiş DMEM besiyerinde 37 °C'de bir saat boyunca ısıtın. Desteklenmiş DMEM besiyerini uzaklaştırın ve iskelelerin mikro fiber fazının üzerine, fibroblastların iskeleye nüfuz etmesine yardımcı olmak için 30 µL desteklenmiş DMEM besiyeri içinde 15.000 MRC-5 fibroblast hücresi ekleyin. Plakayı bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve iskeleleri iki saat boyunca 100 RPM hızında çalkalayın.

Ardından, her bir iskale iki mililitre DMEM takviyeli besiyeri ekleyin ve iskaleleri 37 °C'de %5 karbondioksit ile gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, besiyerini kuyucuklardan uzaklaştırın ve iskalelerin nanofiber fazı apikal yöne bakacak şekilde iskaleleri ters çevirin. Daha sonra, %10 FCS ile takviye edilmiş 30 mikrolitre DMEM-F12 besiyeri içindeki 30.000 Calu-3 epitel hücresini iskalenin nanofiber fazına ekleyin.

İskeleleri, %70 DMEM/F12 ve %30 DMEM takviyeli besiyeri karışımına daldırmadan önce 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında iki saat inkübe edin; ardından havayolu düz kas hücrelerini kültüre etmek için statik inkübasyona 12 saat daha devam edin. Öncelikle, hizalanmış iskeleleri PBS'den taze bir 12 kuyucuklu plakaya aktarın ve hem iskeleleri hem de DMEM takviyeli besiyerini 37 °C'de bir saat boyunca ısıtın. DMEM takviyeli besiyerini uzaklaştırın ve her bir iskeleye 30 µL DMEM takviyeli besiyeri içinde 25.000 havayolu düz kas hücresi ekleyerek 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında iki saat boyunca inkübe edin.

Yapıştırma işlemi tamamlandıktan sonra, iskeleleri DMEM takviyeli besiyerine daldırın. Biyoreaktörde üçlü kültür kurulumunu yapmadan önce iskeleleri inkübatöre geri yerleştirin ve gece boyunca bekletin. Ertesi gün, bifazik ekimli iskeleyi, epitelyal fazı oda içerisine bakacak şekilde yukarıya gelecek şekilde biyoreaktör odasına yerleştirin.

Ardından, hizalanmış iskalele, bifazik iskalenin mikrofiber fazına bitişik olacak şekilde bifazik iskalenin altına yerleştirin. Biyoreaktörün iki bölmesini birbirine kilitleyin. Sonra, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi bir inkübatör içinde iki perfüzyon akış devresi kurun ve bir hafta sonra peristaltik bir pompa kullanarak iki devre boyunca yaklaşık 0.1 milliliters per minute hızla medya pompalayın.

Besiyerini apikal odacıktan ve kültürden uzaklaştırın. Epitel hücrelerini, biyoreaktördeki iki haftalık sürenin ardından analizden önce bir hafta daha hava-sıvı arayüzünde kültüre edin; burada gösterilen üçlü kültür iskelesi, konstrüktün her üç katmanına yayılmış hücre çekirdeklerini göstermek amacıyla fikse edilmiş ve kesit alınmıştır; hücre çekirdekleri DPI ile boyanmış olup mavi görünürken, iskele materyali gri görünmektedir. Burada, sırasıyla epitel hücreleri, fibroblastlar ve düz kas hücrelerinin ekilmesi için hazırlanan elektro eğirme nanofiber, mikrofiber ve hizalanmış iskelelerin taramalı elektron mikroskop görüntüleri yer almaktadır.

Her üç hücre tipi de iki haftalık süre boyunca kendi iskeleleri üzerinde kültüre edildiğinde canlılıkta bir artış göstermiştir. Bunların her biri, iki haftalık kültür süresinden sonra da hücre tipine özgü proteinleri eksprese etmeye devam etmiştir. Bu prosedürü uygularken, elektrospun liflerle yeniden oluşturmaya çalıştığınız doğal hücre dışı matrisi araştırmayı hatırlamak önemlidir.

Hücreler, farklı 3D topografyalara tutunduklarında farklı davranışlar sergilerler. Örneğin, epitel hücreler yalnızca nano lifler üzerinde kültüre edildiklerinde fonksiyonel bir bariyer oluştururlar. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik bir kültür ortamı içindeki hücreler arası etkileşimlerin incelenmesinde kullanılabilecek çok katmanlı bir ko-kültür sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, akış hızı ve voltaj gibi elektro eğirme parametrelerini kullanmayı planladığınız polimer ve çözücü sistemine uygun şekilde ayarlamanın önemli olduğunu unutmayın. Bu, istenen fiberlerin üretilmesi açısından kritik bir öneme sahiptir. Ayrıca, çözücülerin düzgün bir şekilde tahliye edilmesini sağlamak için elektro eğirme işlemini havalandırmalı bir çeker ocak veya dolap içerisinde gerçekleştirmeyi unutmayın.