Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için In Vitro Havayolu Wall Modeli

Bu prosedürün genel amacı, bu hücrelerin C iki'de karşılaştıkları doğal hücre dışı matrisi çoğaltmak için tamamen farklılaşmış yetişkin insan hücrelerinin birlikte kültürlenmesine izin veren üç boyutlu bir fazik iskeleyi elektro döndürmektir. Bu, rastgele hizalanmış bir mikrofiber iskele olan ilk elektro eğirme ile gerçekleştirilir. İkinci adım, rastgele hizalanmış bir nanofiber tabakayı doğrudan mikrofiber iskele üzerine elektro eğirerek iki fazlı bir iskele oluşturmaktır.

Daha sonra, ayrı bir hizalanmış nanofiber iskele elektros bükülür. Son adım, her bir iskeleyi kendi hücre tipiyle tohumlamak ve iskeleleri tek bir yapı olarak yoğun bir biyoreaktör sisteminde birlikte kültürlemektir. Sonuç olarak, çok hücreli etkileşimler, aracı salınımının ölçülmesi ve immün boyamanın ölçülmesi yoluyla analiz edilebilir.

Yapı. Bu tekniğin 2D dönüştürülmüş membranlar gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, elektrikli iskelelerin fizyolojik olarak ilgili bir morfoloji sağlamak için uyarlanabilen 3D lifli bir ortam sağlamasıdır. Daha gözenekli bir yapıdır ve çoklu hücre tiplerinin çekirdek kültürüne izin verir.

Bu yöntem, in vitro model olarak kohortlu, hastalıklı veya sağlıklı insan hücrelerini kullanan stabil bir platform sağlar. Bu, insan hastalıklarıyla ilgilerinde bir sınırlama olan hayvan modellerine olan bağımlılığımızı azaltmaya ve deneylerde kullanılan hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olacaktır. Bu yöntem astım ve KOAH gibi hastalıklar hakkında bilgi verebilse de, bağırsağın enflamatuar hastalıklarının incelenmesi veya kimyasal testler için bir cilt modelinin geliştirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Başlamak için, %8 ve %10 PET'i bire bir kloro, metan ve trikloroasetik asit karışımlarına çözerek üç farklı 10 mililitrelik PET çözeltisi hazırlayın. Ertesi gün PET'i çözmek için çözeltileri gece boyunca oda sıcaklığında karıştırın. PET solüsyonlarını şırıngalara aktarın ve %8'lik karışımı içeren şırıngaya 23 gauge iğne ve %10 ve %30 PET solüsyonlarını içeren diğer iki şırıngaya 18 gauge iğne takın.

Mikrofiber iskeleyi hazırlayın. İlk olarak, %30 PET solüsyonunu içeren şırıngayı, iğne ucu altta olacak şekilde şırınga pompasına yükleyin. Manl'ı iğne ucundan 15 santimetre uzağa yerleştirin ve iğnenin tamburun ortasına doğrultulduğundan emin olun.

Pozitif elektrik besleme hattını metalik bir timsah klipsi kullanarak iğne ucuna takın ve topraklama hattını muz soketine bağlayarak manlı topraklayın. Motoru çalıştırın ve manl hızını 60 RPM'ye ayarlayın. Saatte 2.0 mililitre akış hızı sağlamak için şırınga pompasını açın.

Mikrofiber iskeleleri oluştururken. İğnedeki havayı çıkararak sistemi astarlamak için iğne ucundan çözelti ekstrüde edilene kadar pompanın çalışmasına izin verin. Ardından şırınga pompasındaki pompayı durdurun.

Dışarı atılacak toplam çözelti hacmini iki mililitreye ayarlayın ve pompayı çalıştırın. Daha sonra, iğne ile mandrel elektro dönüşü arasına bir saat boyunca 14 kilovoltluk bir potansiyel uygulayın,% 30 PET çözeltisinin iki mililitresi mikrofiber iskele hala mandrel üzerindeyken elektro bükülene kadar voltaj potansiyelini kapatın. Timsah klipsini çıkarın ve% 30 PET çözeltisi içeren şırıngayı% 8 PET çözeltisi içeren şırınga ile değiştirin.

Ardından timsah klipsini 23 gauge iğneye yeniden bağlayın. Şırınga pompasının akış hızını saatte 0,5 mililitre olarak değiştirin ve çözelti uçtan akana kadar şırınga pompasını çalıştırarak iğneyi doldurun. Mandrel 60 RPM'de dönmeye devam ederken, iğne ucu ile mandrel arasına 14 kilovolt potansiyeli uygulayın ve şırınga pompası tarafından ekstrüde edilecek toplam hacmi iki mililitre olacak şekilde ayarlayın.

% 8'lik PET çözeltisinin iki mililitresi elektro döndürülene kadar dört saat boyunca elektro dönüş. Elektro eğirme işlemi tamamlandığında, güç kaynağını ve mandreli döndüren motoru kapatın. Mandrel yüzey alanı boyutunda 2B bir iskele tabakası oluşturmak için bifazik iskeleyi mandrel genişliği boyunca bir bıçakla kesin.

Hizalanmış PET iskeleleri hazırlamak için, %10 PET çözeltisi içeren şırıngayı, iğne ucu altta olacak şekilde şırınga pompasına yükleyin. Ardından timsah klipsini iğneye bağlayın. Akış hızını saatte 0,5 mililitreye ayarlayın ve iğneyi PET solüsyonu ile astarlayın.

Ardından motoru açın ve mandrel dönüş hızını 2000 RPM'ye ayarlayın. Ardından, şırınga pompasını açın. Voltaj beslemesini 14 kilovolta ayarlayın ve iki mililitre çözelti elektro döndürülene kadar dört saat boyunca güç kaynağı elektro dönüşünü açın.

Elektro eğirme tamamlandığında, güç kaynağını ve motoru kapatın. Hizalanmış bir 2B iskele tabakası oluşturmak için iskeleyi mandrel genişliği boyunca bir bıçakla kesin. Elektrostatik yükü azaltmak için elektro eğrilmiş iskeleleri alüminyum folyoda saklayın.

SPU tabakalarından bifazik veya hizalanmış iskele disklerini delmek için 0,8 milimetre çapında bir biyopsi kalemi kullanın. Daha sonra bifazik iskele diskini toksik olmayan akvaryum tutkalı kullanarak bir contaya yapıştırın. Contaları ve iskeleleri 12 oyuklu bir doku kültürü plakasına yerleştirin.

İskelelerin her iki tarafında 30 dakika boyunca ultraviyole I radyasyon kullanarak contaları ve iskeleleri sterilize edin. Daha sonra ertesi gün dört santigrat derecede gece boyunca% 20'lik bir antibiyotik antimikotik solüsyona batırın. İskeleleri PP S3 ile 3 kez yıkayın ve iskeleleri kullanılıncaya kadar dört santigrat derecede PBS'de saklayın.

Bifazik iskeleleri PBS'den yeni bir 12 Kuyulu plakaya aktarın ve bunları 37 santigrat derecede bir saat boyunca% 10 FCS ile desteklenmiş DMEM ortamında ısıtın. DMEM takviyeli ortamı çıkarın ve fibroblastların iskeleye nüfuz etmesine yardımcı olmak için her bir iskeleye 30 mikrolitre DMEM takviyeli ortam içinde 15.000 MRC beş fibroblast hücresi içeren iskelelerin mikrofiber fazını yerleştirin. Plakayı bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve iskeleleri iki saat boyunca 100 RPM'de çalkalayın.

Daha sonra her iskeleye iki mililitre DMEM takviyeli ortam ekleyin ve iskeleleri gece boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin. Ertesi gün, ortamı kuyulardan çıkarın ve iskelelerin nanofiber fazı apikal olarak bakacak şekilde iskeleleri ters çevirin. Daha sonra, iskelenin nanofiber fazına% 10 FCS ile desteklenmiş 30 mikrolitre D-M-E-M-F 12 ortamında 30.000 Cali üç epitel hücresi tohumlayın.

İskeleyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat inkübe ettikten sonra, iskeleleri 70 30 D-M-E-M-F 12 ve DMEM takviyeli ortam karışımına batırın ve hava yolunu kültürlemek için 12 saat daha statik inkübasyona devam edin. Düz kas hücreleri ilk olarak, hizalanmış iskeleleri PBS'den 12 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve bunları ve DMEM takviyeli ortamı 37 santigrat derecede bir saat boyunca ısıtın. DMEM takviyeli ortamı çıkarın ve her bir iskeleye 30 mikrolitre DMEM takviyeli ortamda 25.000 hava yolu düz kas hücresi ekleyin ve bunları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat inkübe edin.

Takıldıktan sonra, iskeleleri DMEM takviyeli ortama batırın. Onları inkübatöre geri koyun ve biyoreaktörde bir tri kültür kurmadan önce bir gece bekletin. Ertesi gün, bifazik tohum iskelesini, epitel fazı odaya bakacak şekilde biyoreaktör odasına yerleştirin.

Ardından, hizalanmış iskeleyi, bifazik iskelenin mikrofiber fazına bitişik olacak şekilde bifazik iskelenin altına yerleştirin. Biyoreaktörün iki odasını birbirine kilitleyin. Ardından, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi bir inkübatör içinde iki perfüzyon akış devresini birleştirin ve bir hafta sonra peristaltik bir pompa kullanarak medyayı dakikada yaklaşık 0.1 mililitre hızla iki devrenin etrafına pompalayın.

Ortamı apikal odadan ve kültürden çıkarın. Biyoreaktörde iki hafta sonra analizden önce bir hafta daha hava sıvı arayüzündeki epitel hücreleri, burada gösterilen tri kültür iskelesi sabitlendi ve yapı hücresi çekirdeğinin üç katmanının tümüne dağılmış hücre çekirdeklerini gösterecek şekilde bölümlere ayrıldı DPI ile boyandı ve iskele malzemesinin gri göründüğü yerlerde mavi görünür. İşte sırasıyla epitel hücrelerini, fibroblastları ve düz kas hücrelerini tohumlamak için hazırlanan elektros eğrilmiş nanofiber mikrofiber ve hizalanmış iskelelerin taramalı elektron mikroskobu görüntüleri.

Her üç hücre tipi de, iki haftalık bir süre boyunca kendi iskelelerinde kültürlendiğinde canlılıkta bir artış gösterdi. Her biri ayrıca iki haftalık kültür periyodundan sonra hücre tipine özgü proteinleri eksprese etmeye devam etti. Bu prosedürü denerken, elektros lifleri ile yeniden oluşturmaya çalıştığınız doğal hücre dışı matrisi araştırmayı unutmamak önemlidir.

Bir hücre, farklı 3B topografyalara bağlandığında farklı davranacaktır. Örneğin, epitel hücreleri sadece nano lifler üzerinde kültürlendiğinde fonksiyonel bir bariyer oluşturacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik bir kültür ortamında hücreler arası etkileşimlerin incelenmesi için kullanılabilecek çok katmanlı bir ko-kültür sisteminin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü gerçekleştirirken kullanmayı düşündüğünüz polimer ve solvent sistemine uyacak şekilde akış hızı ve voltaj gibi elektro eğirme parametrelerinizi uyarlamanın önemli olduğunu unutmayın. Bu, istenen liflerin üretilmesinde çok önemlidir. Ek olarak, çözücülerin düzgün bir şekilde çıkarılmasına izin vermek için havalandırmalı bir başlık veya dolap döndürmeyi seçmeyi unutmayın.