Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.

Bu yöntem, kök hücre mühendisliği alanında, hücresel mikro çevrenin hücresel fenotipleri ve işlevi nasıl değiştirdiği gibi önemli bir soruya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, mikro temaslı plakada geleneksel bir yöntemle gerçekleştiremeyeceğiniz tek bir plakadaki hücreler için çoklu yapay olarak oluşturulmuş ortamı sağlamasıdır ve bu prosedürü laboratuvarımızdan Koki Yoshimoto ve Risako Sakai teknisyenleri gösterecektir. Metin protokolüne göre mikroakışkan yapılardan nano fiber diziler ve kalıplar için maskelerin 3D görüntülerini oluşturduktan sonra.

Maskeleri ve kalıbı yazdırmak için bir 3D yazıcı kullanın. Elektro eğirme için polimer çözeltileri hazırlamak için, yüzde 13 PMGI sıvısını tetrahidrofuran ile yüzde dokuza seyreltin. 0.08 gram PS'yi THF'nin dimetilformamide bire bir hacim oranında çözün ve hacmi, hacim PS çözeltisi başına ağırlığın yüzde sekizlik son bir mililitresine getirmek için sıvı bir regent kullanın.

0.1 gram GT'yi su, asidik asit ve etil asetat içinde çözün ve hacmi hacimce yüzde 10 GT çözeltisinin son bir mililitresine getirmek için karışık çözücü çözeltisini kullanın. Daha sonra, bir magnetron püskürtme makinesi kullanarak, elektro eğirme kurulumunda bir katot görevi gören bir polistiren taban plakası üzerine beş nanometre kalınlığında bir platin tabaka yerleştirin. Her polimer çözeltisini 23 gauge paslanmaz çelik künt iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırıngaya yükleyin.

Daha sonra şırıngaları, elektro eğirme cihazının kollektöründen 12 santimetre uzakta bir şırınga pompasına sabitleyin. Şırınga iğnesini yüksek voltajlı bir güç kaynağına bağlayın ve 11 kilovolta ayarlayın. Ardından pompalama hızını saatte 20 mililitreye ayarlayın ve sıcaklık ve nemi sırasıyla 30 santigrat derecede ve hacimce yüzde 30'un altında tutun.

Şimdi maskeyi taban plakasına yerleştirin. Daha sonra maskenin deliklerinden, elektro eğirme süresini değiştirerek taban plakası üzerinde farklı yoğunluklarda nano lifler üretin. Maskeyi taban plakasından çıkarın ve nano fiber üretimini tekrarlayın.

Dizi tamamlandığında, kalan çözücüyü buharlaştırmak için 16 saat boyunca 25 santigrat derecede bir desikatöre koyun. GT nano fiberleri çapraz bağlamak için, bunları etanol içinde 0.2 molar EDC ve 0.2 molar NHS ile muamele edin. Ve numuneleri dört saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

GT nano fiberleri durulamak için iki kez yüzde 99,5 etanol kullanın ve plakaları 16 saat boyunca 25 santigrat derecede vakumla kurutun. Mikroakışkan yapıları imal etmek için 2 gram PDMS kürleme maddesi ve 20 gram PDMS bazını karıştırın. Daha sonra ön PDMS karışımını fabrikasyon kalıba dökün.

Bir desikatörde, ön PDMS karışımını 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Daha sonra ön PDMS karışımını 16 saat boyunca 65 santigrat derecede bir fırında kürleyin. Macme dizilerini monte etmek için, kürlenmiş PDMS yapısını kalıptan soyun ve temizlemek için yüzde 70 etanol kullanın.

Daha sonra PDMS yapısının alt tarafındaki atmosferik koronayı boşaltın. PDMS yapısını nano fiber dizisi ile hızlı bir şekilde birleştirin. Daha sonra düzeneği iki gün boyunca 65 santigrat derecede fırında pişirin.

DPBS kullanarak, 35 milimetrelik bir tabakta kültürlenmiş H9HESC'leri yıkayın. Daha sonra tabağa 0,5 mililitre rekombinant tripsin hafif proteaz ekleyin ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Süpernatan proteaz karışımını dikkatlice aspire edin.

Hemen HPSC ortamını ekleyin ve hücreleri ayırmak için ortamı tekrar tekrar tabak yüzeyine nazikçe dağıtın. Daha sonra ayrılan hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü üç dakika boyunca yerçekiminin 200 katı santrifüjleyin.

Süpernatanı aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış HPSC ortamında askıya alın. Daha sonra her bir mikroakışkan odaya 12 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Hücreleri metin protokolüne göre floresan olarak etiketledikten sonra, PDMS mikroakışkan yapısını Macme dizisinden soyun.

Ardından, kalan PBMS'yi Macme dizisinden çıkarın, lekeli hücrelere PBS'de yüzde 90 gliserol ekleyin ve bir örtü fişi uygulayın. Son olarak, plakayı ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu tablasına baş aşağı yerleştirin. Ve 12 bit renkli görüntüler elde etmek için mikroskop görüntüleme yazılımını kullanın.

Burada, jelatin nano lifler üzerinde yüksek ilk tohumlama yoğunluğunda kültürlenen ve 3 hücresel fenotipik belirteç ile boyanan H9HPSC'lerin immünofloresan görüntüleri gösterilmektedir. Her bir veri setindeki dört fenotipik belirteç için ifade seviyelerinin homojenliğini ve heterojenliğini karşılaştırmak için yüksek boyutlu çoklu parametrik veri setlerini düşük boyutlu 2D haritalara dönüştürmek için SOM analizi kullanıldı ve SOM düğümleri için denetimsiz hiyerarşik kümeleme yapıldı. Burada belirtildiği gibi, tüm gruplar bazal membran jel matrisi veya MG'de gözlenenden daha yüksek OCT4 ekspresyonu sergiledi. Birinci grup, çoğu hücrenin aktif olarak çoğaldığını gösteren yüksek EdU sinyalleri gösterdi.

Bu nedenle, birinci gruptaki mikro ortamlar HPSC bakımı için uygundu, çünkü farklılaşmamış HPSC'ler, hücre döngüsü boşluğu fazları kısaldığında hızla çoğalır. İkinci grup, yetersiz bir başlangıç yoğunluğunda tohumlanan hücreleri ve HPSC'nin kendini yenilemesini desteklemeyen 2D GT iskelelerinde yetiştirilen hücreleri içeriyordu. Örneğin, bu numunenin EdU sinyali kayboldu ve annexin V seviyeleri hafifçe arttı, bu da hücrelerin köklerini kaybettiğini ve yavaş yavaş apoptotik hale geldiğini gösteriyor.

PMGI nano fiber matrislerini içeren mikro ortamları temsil eden üçüncü gruptan PMGI MidNF HighCD, diğer koşullara kıyasla OCT4 ve EdU sinyallerinde daha büyük varyasyonlar gösterdi. Geliştirildikten sonra, bu teknik, KÖK hücre alanındaki araştırmacının doku mühendisliğini ve ileri taramayı keşfetmesinin yolunu açtı.