Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık
22 Eylül 2015
Bir Kartezyen biyoyazıcı, hassas, tekrarlanabilir geometrilerde çok malzemeli biriktirmeye izin verirken aynı zamanda çevresel faktörlerin kontrolüne de izin verecek şekilde tasarlanmış ve üretilmiştir. Üç boyutlu biyo-yazıcıyı kullanarak, karmaşık ve uygulanabilir yapılar basılabilir ve kolayca çoğaltılabilir.
Bu prosedürün genel amacı, 3D Biyoyazıcı kullanarak karmaşık geometriye sahip, canlı hücre yüklü konstrüktlar oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle kültürden insan adipoz doku stromal hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından hücreler, taze olarak hazırlanmış oksitlenmiş RGD konjuge alginat biyo mürekkebi ile karıştırılır.
Son adımda, biyomalzeme içindeki hücre LA, biyobaskı aracılığıyla ekstrüde edilir. Nihayetinde, biyobaskı ile yerleştirilen hücrelerin canlılığı, proliferasyonu ve migrasyonu analiz edilmek için konfokal mikroskopi kullanılır. Bu prosedürün, iskale oluşturma ve hücre ekimi gibi mevcut prosedürlere göre temel avantajı, prosedürümüz sayesinde hücreleri ve hücre agregatlarını, dokuyu oluşturmak için tam olarak bulunmaları gereken yere doğrudan yerleştirebilmenizdir.
Bugün prosedürü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Sarah Grace Dennis uygulamalı olarak gösterecek. Hücre kültür inkübatöründe genişletme yapmak üzere, işlem görmüş bir T 75 flask içerisine 15 mililitre düşük glukozlu TMEM içinde 350.000 insan adipoz doku stromal hücresi ekerek başlayın. Kültür %80 konfluense ulaştığında, medyumu uzaklaştırın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre DPBS ile durulayın.
Ardından hücreleri beş mililitre tripsin ve DPBS içinde 37 °C'de iki dakika inkübe edin; hücreler ayrıldığında, enzimatik reaksiyonu üç mililitre hücre kültüre ortamı ile durdurun ve hücreleri 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peleti iki mililitre hücre kültüre ortamında yeniden süspande edin. Daha sonra hücreleri sayın, 1,3 × 10⁶ hücrelik bir alikotu 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve hücreleri tekrar çöktürün.
Hücrelerin sulu aljinat çözeltisi boyunca homojen bir şekilde dağılmasına dikkat ederek, peleti bir mililitre taze hazırlanmış biyo mürekkep içinde süspanse edin. Ardından hücreleri, steril ve yazıcıyla uyumlu üç mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve steril 22 gauge plastik uç takın. Şimdi biyoyazıcıyı, dağıtıcı bilgisayarların her birini ve sirkülasyonlu su banyosunu açın.
Banyo sıcaklığını manuel olarak 4 °C'ye ve ilgili dispenser bilgisayarındaki her bir dispenser için yazdırma parametrelerini ayarlayın. Dispense hacmini 230 nanolitrelere, geri adım sayısını sıfıra ve dispense hızını 10 µL/s'ye ayarlayın. Ardından, bilgisayarda tasarım yazılımını ve USB kamera görüntüsünü izlemek için kullanılan programı açın.
Ardından, damlalar arasında 2,4 mm boşluk olacak şekilde beş çarpı beşlik bir nokta dizisi için koordinatları manuel olarak girin. Programı kaydedin ve robota gönderin. Daha sonra, jelatin titanyum dioksit içeren bir Petri kabını 4 °C'lik yazıcı tablasına yerleştirin, hazne kapısını kapatın ve kilitleyin.
Programlanabilir mantık denetleyiciyi kullanarak, hazneyi sterilize etmek için ultraviyole ışık kaynaklarını başlatın. 90 saniye sonra hazneyi açın ve insan adipoz doku stromal hücre süspansiyonu içeren şırıngayı birinci tabancaya yerleştirip hazne kapısını kapatarak kilitleyin ve fan sistemini çalıştırmak için programlanabilir mantık denetleyiciyi kullanın. İç basıncın dengelenmesi için 30 saniye bekleyin ve ardından yazdırma işlemi boyunca geometrik yolu ve yazdırma parametrelerini içeren programı çalıştırın.
Doğru ve üniform bir basımı onaylamak için bilgisayardaki USB kamera ekranını izleyin. Biyobasılmış yapıların canlılığını nicelleştirmek için, yapıları taze hazırlanmış boyama çözeltisine daldırın. Ardından, boyanın sabitlenmesi için yapıları 15 dakika boyunca karanlıkta buzdolabında bekletin.
Ardından, konfokal mikroskop görüntüsü kullanılarak; boyanmış yapılar eğer hücreler sarı veya yeşil görünüyorsa canlı, kırmızı görünüyorsa ölü olarak sınıflandırılır. Bu sonuçların gösterdiği üzere biyobasım, bilgisayarlı yazılım kullanarak hücrelerin ve hidrojellerin belirli üç boyutlu konumlara doğru ve tutarlı bir şekilde yerleştirilmesini kolaylaştırır. Bilgisayar yazılımı, her bir damlanın yerleşimini belirler ve dağıtımla ilgili birçok parametreyi kontrol eder.
Başarılı bir biyobasım tekniğinin gerekliliklerinden biri, hücrelerin canlı kalmasıdır. Az önce gösterildiği üzere, alginatik biyomürekkep ile basılan hücreler, basımdan bir saat ve sekiz gün sonra analiz edilmiş; sıfırıncı günde hücrelerin %98'i, sekizinci günde ise %95'i yeşil ve canlı görünmüştür. Kırmızı boyamanın gösterdiği üzere, her iki zaman noktasında da çok az ölü hücre gözlemlenmiş, bu da alternatif mürekkebin biyobasım için uygunluğunu doğrulamıştır.
Ayrıca, RGD konjuge alginat mürekkebi, hücrelerin basılı yapılara tutunmasını artırarak, hidrojelin üç ayrı bölgesinde sıfırıncı ve sekizinci günlerde nicelendirildiği üzere, gelişmiş hücre yayılımı ve proliferasyonuna yol açar. Burada, sekizinci günde Ginnet biyomürekkebi üzerindeki RGD peptid konjugasyonunun kalitesi, yalnızca Ginnet biyomürekkebi kullanımıyla karşılaştırılmıştır. RGD konjuge Ginnet boyalı örnekte gözlemlenen hücre yayılımı, peptidin Ginnet'e başarılı bir şekilde dahil edildiğini göstermiş olup; bu durum, konjuge edilmemiş biyobasım örneklerinin gelişiminden sonra belirgin şekilde gözlemlenmemiştir.
Bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, yaşayan mühendislik yapıları oluşturmanın bir yolu olarak eklemeli imalatı keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir 3D biyoyazıcı kullanarak karmaşık geometrilere sahip canlı hücre yüklü konstrüktlerin üretilmesi için bir prosedür sunmaktadır. Yöntem, insan adipoz doku stromal hücrelerinin izole edilmesini ve biyoyazıcı aracılığıyla ekstrüzyondan önce bir biyo mürekkep ile karıştırılmasını içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyobasım
- Hücre biyolojisi
- Doku mühendisliği
Arka Plan
- 3B biyobasım, hücrelerin hassas bir şekilde yerleştirilmesine olanak tanır.
- Geleneksel yöntemler, iskele oluşumu ve hücre ekimini içerir.
- Hücrelerin doğrudan yerleştirilmesi, doku oluşumunu artırabilir.
- Hücre canlılığının analizi için konfokal mikroskopi kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- 3B biyoyazıcı kullanarak kompleks ve canlı konstrüksiyonlar oluşturmak.
- Doku mühendisliğinde hücre yerleştirme doğruluğunu artırmak.
- Biyoyazdırılmış hücrelerin yazdırma sonrası davranışlarını analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan adipoz doku stromal hücrelerinin izolasyonu.
- Okside RGD konjuge alginat biyo mürekkebinin hazırlanması.
- Hücre yüklü biyomalzemenin biyobaskı yoluyla ekstrüzyonu.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak hücre canlılığı, proliferasyonu ve migrasyonunun analizi.
Temel Sonuçlar
- Canlı hücre yüklü yapıların başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla hücre yerleşimi üzerinde geliştirilmiş kontrol.
- Biyobasılı hücrelerin canlılığının ve proliferasyonunun kanıtlanması.
- Konfokal mikroskopi ile hücre göç modellerinin doğrulanması.
Sonuçlar
- 3D biyoyazıcı, hücrelerin hassas ve tekrarlanabilir şekilde yerleştirilmesine olanak tanır.
- Bu yöntem, doku mühendisliği uygulamalarını potansiyel olarak geliştirebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, bu biyobasım tekniğinin diğer uygulamalarını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Bu biyobaskı yöntemi, hücrelerin karmaşık 3D geometriler içinde hassas bir şekilde uzamsal olarak organize edilmesini sağlayarak, rejeneratif tıp ve hastalık modellemesi için doku mühendisliğindeki temel bir zorluğu çözmektedir. Yüksek hücre canlılığını koruyan ve proliferasyonu destekleyen bu yaklaşım, fizyolojik olarak ilgili konstrüktlarda terapötik adayların değerlendirilmesi için tekrarlanabilir bir platform sunar. Bu yetenek, biyoaktif ajanların tanımlanmış mikroortamlara doğrudan yerleştirilmesine olanak tanıyarak, erken aşama hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Biyomimetik mimarilerde uzamsal olarak kontrollü hücre yerleşimi aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Basılmış yapılar içinde hücre canlılığını (sekizinci günde >%95) ve proliferasyonu koruyarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Bileşik taraması için doğal doku benzeri organizasyonu replike ederek hedef etkileşimine olan güveni artırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Konfokal mikroskopi aracılığıyla canlılık, proliferasyon ve migrasyon için ölçülebilir çıktılara sahip, standartlaştırılmış, canlı hücre yüklü konstrüktlar üretir.
- Operasyonel Değer: Kontrol edilebilir baskı parametreleri ve bilgisayar destekli tasarım üretimi sayesinde analiz tekrarlanabilirliği sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Hassas damlacık yerleşimi ve çevresel kontrol yoluyla, sonraki aşamalardaki bileşik değerlendirmeleri için platformun yeniden kullanımını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: RGD-konjuge alginat biyomürekkepte hücre fonksiyonunu koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya geçişi destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: RGD peptid konjugasyonu sayesinde gelişen hücre adezyonu ve yayılımı ile öngörü güvenilirliğini artırır.
- Hastalıkla İlişkili Sistem: Doğal hücre dışı matris organizasyonunu yakından taklit eden biyomimetik doku konstrüktleri oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, mühendislik ürünü dokularda tekrarlanabilir ve nicelendirilebilir biyolojik okumalar sağlayarak, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Hücrelerin ve hidrojellerin belirlenmiş 3D konumlara hassas yerleşimi aracılığıyla hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış yapı üretimi ve hücre davranışının kantitatif konfokal görüntülemesi yoluyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Boyanmış yapılar üzerinden elde edilen canlılık, proliferasyon ve migrasyon metriklerini kullanarak koşulların karşılaştırmalı analizine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Yazım sonrası sekiz gün boyunca biyomürekkep içindeki hücre fonksiyonlarını koruyarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Programlanabilir dağıtım ve yazılım kontrolü aracılığıyla birden fazla projede karmaşık geometriler oluşturmak için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücre-çevre etkileşimlerinde mekanistik belirsizliğin azaltılması yoluyla hedef doğrulama sürecinde öngörü güvenilirliği.
- Operasyonel Değer: Kontrollü dağıtma parametreleri ve steril oda ortamı aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Doku benzeri ortamlarda hücresel yanıtların erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak geliştirilen iyileştirilmiş devam/durdurma (go/no-go) kararları.
- Portföy Etkisi: İlerleme kriterlerini destekleyen kantitatif canlılık ve proliferasyon verileri aracılığıyla risk ayarlı önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Hücre izolasyonu, biyomürekkep hazırlama ve canlılık değerlendirmesi için konfokal mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Biyoyazıcı donanımına, steril şırınga sistemlerine ve sıcaklık kontrollü baskı tablalarına bağımlıdır.
- CAD tasarımlarının, dağıtım hızlarının ve çevresel kontrollerin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Adaptasyon hususları arasında biyomürekkep bileşimi ve hücre tipinin aljinat bazlı matrislerle uyumluluğu yer alır.
- Pratik sınırlamalar arasında nozül tıkanma riskleri ve canlılığı nicelleştirmek için baskı sonrası boyama protokollerine duyulan ihtiyaç bulunur.
