Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Bu prosedürün genel amacı, bir 3D Bioprint kullanarak karmaşık bir geometriye sahip canlı hücre yüklü yapılar oluşturmaktır. Bu, ilk olarak insan yağ dokusu stromal hücrelerinin kültürden izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, hücreler taze hazırlanmış oksitlenmiş RGD konjuge aljinat biyo mürekkebi ile karıştırılır.

Son adımda, biyomateryaldeki LA hücresi biyo-baskı yoluyla ekstrüde edilir. Sonuç olarak, biyo-baskılı hücrelerin canlılığını, çoğalmasını ve göçünü analiz etmek için konfokal mikroskopi kullanılır. Bu prosedürün, iskele oluşturma ve hücre tohumlama gibi mevcut prosedürlere göre en büyük avantajı, prosedürümüzle hücreleri ve hücre agregatlarını dokuyu oluşturmak için tam olarak olmaları gereken yere doğrudan yerleştirebilmenizdir.

Prosedürü gösteren bugün, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Sarah Grace Dennis olacak. Bir hücre kültürü inkübatöründe genişleme için 350.000 insan yağ dokusu stromal hücresini, 15 mililitre düşük glikoz TMEM'de işlenmiş bir T 75 şişesine ekerek başlayın. Kültür% 80 co akıcılığına ulaştığında, ortamı çıkarın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre DPBS'de durulayın.

Daha sonra hücreleri, hücreler ayrıldığında 37 santigrat derecede iki dakika boyunca beş mililitre tripsin ve DPBS içinde inkübe edin, enzimatik reaksiyonu üç mililitre hücre kültürü ortamı ile durdurun ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peleti iki mililitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri sayın, altı hücreli alikotun 1.3 katını 10 kez 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri tekrar döndürün.

Peletleri bir mililitre taze hazırlanmış biyo mürekkep içinde süspanse edin ve hücreleri sulu aljinat çözeltisi boyunca homojen bir şekilde dağıtmaya dikkat edin. Ardından hücreleri steril yazıcı uyumlu üç mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve steril 22 gauge plastik ucu vidalayın. Şimdi bioprint'i, dağıtıcı bilgisayarların her birini ve devridaim su banyosunu açın.

İlişkili dağıtıcı bilgisayarındaki her dağıtıcı için asyon mekanizması ve yazdırma parametreleri için banyo sıcaklığını manuel olarak dört santigrat dereceye ayarlayın. Dağıtım hacmini 230 nanolitreye, geri adım sayısını sıfıra ve dispanser oranını saniyede 10 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, bilgisayarda USB kamera ekranını görüntülemek için tasarım yazılımını ve programı açın.

Ardından, damlalar arasında 2,4 milimetre boşluk bulunan beşe beş nokta dizisinin koordinatlarını manuel olarak girin. Programı kaydedin ve robota gönderin. Ardından, dört santigrat derece yazıcı aşamasına Petri kabı içeren bir jelatin titanyum dioksit yerleştirin ve hazne kapısını kapatın ve kilitleyin.

Programlanabilir mantık denetleyicisini kullanarak, odayı sterilize etmek için ultraviyole ışık kaynaklarını başlatın. 90 saniye sonra, hazneyi açın ve insan yağ dokusu stromal hücre süspansiyonunu içeren şırıngayı tabancaya yükleyin, bir kapatın ve hazne kapısını kilitleyin ve fan sistemini açmak için programlanabilir mantık denetleyicisini kullanın. İç basıncın dengelenmesi için 30 saniye bekleyin ve ardından yazdırma işlemi boyunca geometrik yolu ve yazdırma parametrelerini içeren programı çalıştırın.

Doğru ve düzgün bir yazdırmayı onaylamak için bilgisayardaki USB kamera ekranını izleyin. Biyo-baskılı yapıların canlılığını ölçmek için, onları taze hazırlanmış leke çözeltisine batırın. Ardından, lekenin kurumasını sağlamak için yapıları karanlıkta 15 dakika buzdolabına koyun.

Daha sonra konfokal bir mikroskop görüntüsü kullanarak, hücreler sarı veya yeşil görünüyorsa, onları canlı, kırmızı ise hücreler ölü olarak sınıflandırır. Bu sonuçların gösterdiği gibi, biyobaskı, bilgisayarlı yazılım kullanarak hücre yardımcısının ve hidrojellerin belirli üç boyutlu konumlarda doğru ve tutarlı bir şekilde biriktirilmesini kolaylaştırır. Bilgisayar yazılımı, her bir damlacığın yerleşimini belirler ve dağıtım için birçok parametreyi kontrol eder.

Başarılı bir biyo-baskı tekniğinin gerekliliklerinden biri de hücrelerin burada canlı kalmasıdır. Az önce gösterildiği gibi aljinik biyo mürekkebinde basılan hücreler, baskıdan bir saat sekiz gün sonra analiz edildi ve hücrelerin %98'i sıfırıncı günde yeşil ve canlı, sekizinci günde ise %95'e kadar çıktı. Kırmızı lekelenmenin gösterdiği gibi, her iki zaman noktasında da alternatif mürekkebin biyo-baskı için uygunluğunu doğrulayan birkaç ölü hücre gözlemlendi.

Ayrıca, RGD konjuge algin mürekkebi, hücrelerin basılı yapılara bağlanmasını arttırır ve hidrojelin sıfır ve sekiz üzerinde üç ayrı alanında ölçüldüğü gibi gelişmiş bir hücre yayılmasına ve çoğalmasına yol açar. Burada, ginnet biyo mürekkebi üzerindeki RGD peptit konjugasyonunun kalitesinin karşılaştırılması, sekizinci günde tek başına Ginnet biyo mürekkebinin kullanımıyla karşılaştırıldı. RGD konjuge çırçır ağı lekeli numunede gözlenen hücre yayılımı, peptidin ginnet üzerine başarılı bir şekilde dahil edildiğini gösterdi, bu fenomen konjuge olmayan biyo-baskı numunelerinde geliştirildikten sonra gözle görülür şekilde eksik olan bir fenomendi.

Bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, canlı mühendislik yapılarını bir araya getirmenin bir yolu olarak eklemeli üretimi keşfetmelerinin yolunu açtı.