Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Bu protokolün genel amacı, biyobasım cihazları aracılığıyla ekstrüde edilebilen hidrojel biyomürekkepler tasarlamak için çok yönlü bir yaklaşım sunmaktır. Bu biyomürekkepler daha sonra üç boyutlu doku konstrüktları üretmek için kullanılabilir. Bu yöntem, biyobasım alanındaki, bir biyoyazıcı kullanılarak ekstrüde edilebilen bir materyal sağlamak için gereken mekanik özelliklerin nasıl kontrol edileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, basit ve etkili, biyoyazdırılabilir bir hidrojel biyomürekkep oluşturmak için modüler bir şekilde birleştirilmiş, ticari olarak mevcut bileşenler kullanmamızdır. Bu teknolojilerin uygulamaları arasında, ilaçların, toksinlerin ve hastalıkların etkilerini doğru şekilde modellemek için kullanılabilecek 3D doku organoidlerinin oluşturulması yer almaktadır. Bu yöntem 3D karaciğer yapılarını biyoyazdırmak için bir çerçeve sağlayabilse de kas, akciğer ve kolon gibi diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, hidrojel biyomürekkebini oluşturmak için çok sayıda farklı reaktif kullanıldığından zorlanabilirler; ancak işlem aslında oldukça basit bir süreçtir. Prosedürü, ekibimizde doktora sonrası araştırmacı olan Young-Joon Seolle gösterecektir. Başlamak için, başka bir yerde açıklandığı şekilde, hidrojel formülasyonunda kullanılacak dokuya özgü bir hücre dışı matris sindirimi hazırlayın.

Ardından, bir fotobaşlatıcıyı ağırlık/hacim oranı 0.1% olacak şekilde suda çözün. Hidrojel biyomürekkepleri oluşturmak için, öncelikle hyaluronik asit hidrojel kitlerindeki temel materyal bileşenlerini, su bazlı fotobaşlatıcı çözeltisinin ayrı alikotları içinde çözün. Daha sonra ECM çözeltisini, %2 tiyole hyaluronik asidi, %2 tiyole jelatini, çapraz bağlayıcıları ve hepatosit kültür ortamını burada gösterilen oranlarda birleştirin. Biyomürekkebin ekstrüzyon özelliklerini iyileştirmek için karışıma 1,5 mg/mL modifiye edilmemiş hyaluronik asit ve 30 mg/mL jelatin ekleyin.

Ardından, elde edilen karışımı kullanmadan önce on saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin. Biyo mürekkebi bir biyobaskı cihazında test etmeden önce, ekstrüzyon özelliklerini laboratuvar tezgahında test edin. Standart bir şırınga kullanarak biyo mürekkep örneği damlatın ve ardından şırıngaya 20 ila 30 gauge bir iğne takın.

Bioink'in çapraz bağlanmasına izin verin ve ardından pürüzsüzce ekstrüde edilmiş hidrojel filamentler elde etmek için bioink'i iğneden itin. Formülasyon, az sayıda tümsek içeren veya hiç tümseği olmayan bir filament oluşturabiliyorsa biyo-yazıma hazırdır. Bioink hazırlıklarını bir biyo-yazıcıya yüklemek için bioink'leri sterilize edilmiş yazıcı kartuşlarına pipetleyin.

Biyo mürekkep kartuş içerisinde kendiliğinden birinci aşama çapraz bağlanmaya uğrayacağı için ekstrüzyondan önce 30 dakika bekletin. Ardından, kartuşu yazdırma düzeneğine yerleştirin ve kartuşa bir pnömatik basınç kaynağı bağlayın. Ekstrüzyon uyumluluğunu değerlendirmek amacıyla, paralel çizgilerden oluşan bu yedi tarafından yedi milimetrelik ızgara gibi basit bir desen hazırlayıp yazdırın.

Yazıcı kafası XY düzleminde yaklaşık 300 milimetre/dakika hızla hareket ederken, biyomürekkebini ekstrüde etmek için kartuşa 20 kilopaskal basınç uygulayın. Ekstrüde edilen malzemeler topaklı veya düzensizse, birinci aşama çapraz bağlanmış malzemeyi yumuşatmak için eklenen çapraz bağlayıcı miktarını azaltın. Doğru şekilde hazırlanmış bir biyomürekkep formulasyonu, hassas depozisyon ve mimarilere olanak tanıyacak şekilde pürüzsüzce ekstrüde edilmelidir.

Eşlik eden metin protokolünde açıklandığı şekilde, asılı damla yöntemini kullanarak 96 kuyucuklu bir plaka içerisinde 3D primer hücre karaciğer sferoidleri hazırlayın. Kültürde üç gün geçtikten sonra, karaciğer sferoidlerini asılı damla plakasından bir pipet yardımıyla toplayın ve steril, 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Sferoidlerin konik tüpün dibine çökmesi için bir ila iki dakika bekleyin.

Ardından, medyayı bir pipet yardımıyla dikkatlice aspire edin. Taze hazırlanmış hidrojel biyomürekkep çözeltisinin, hedeflenen basılı 3D yapı hacminin %110 ila %125'ini sferoidleri içeren konik tüpe aktarın. Sonra, sferoidleri hidrojel biyomürekkep çözeltisi içinde yeniden süspande etmek için pipetle dikkatlice aşağı yukarı hareket ettirin.

Homojen bir süspansiyon elde edildikten sonra, sferoid çözeltisini bir pipet yardımıyla biyoyazıcı kartuşuna aktarın ve çözeltinin 30 dakika boyunca birinci çapraz bağlanma aşamasından geçmesini sağlayın. Çapraz bağlanmanın ardından, primer karaciğer sferoidlerini içeren istenen hidrojel yapıları oluşturmak için bir biyoyazıcı cihazı kullanın. Her bir depozisyon katmanından sonra, ikincil çapraz bağlanma mekanizmasını başlatmak için basılan biyomürekkebi iki ila dört saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın.

Bu işlem yapıları stabilize edecek ve sertliği istenen seviyeye çıkaracaktır. Çözeltideki PEG alkin konsantrasyonu, genel çapraz bağ yoğunluğunu kontrol eder ve bu nedenle temel olarak nihai yapının sertliğini belirler. Biyobasım sonrası, konfokal mikroskopi kullanılarak karaciğer yapılarında yüksek hücre canlılığı gözlemlenmiştir.

Optimal çevresel koşullar altında, canlılık %85'in üzerinde olmalıdır. Ayrıca, konstrüktler karaciğer dokusunu belirten markörler için boyandığında; bir sitokrom P450 izoformu olan CYP3A4'ün, hücre içi albüminle beraber, bir epitelyal hücre-hücre adezyon proteini olan E-cadherin'in ve karaciğerde yüksek düzeyde eksprese edilen bir protein olan DPP4'ün pozitif ekspresyonlarının tamamı gözlemlenmiştir. Kültür medyası üre ve albümin seviyeleri açısından test edildiğinde, konstrüktün 14 günlük zaman süreci boyunca hem üre hem de albümini sabit seviyelerde salgıladığı tespit edilmiştir. Bu durum, dokuya özgü hidrojel biyomürekkeplerin karaciğer hücrelerinin fonksiyonlarının korunmasına yardımcı olduğunu daha da desteklemektedir.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde başlangıçtan bitişe yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Ancak bu durum, genellikle kullanılan belirli biyobasım cihazına bağlıdır. Bu prosedür uygulanırken, gösterilen adımların diğer doku türleri veya biyobasım cihazlarıyla uyumlu hale getirilmek için sıklıkla adapte edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu prosedür takip edilerek, diğer doku türlerinin biyobaskısını desteklemek amacıyla farklı hidrojel biyomürekkep formülasyonları oluşturulabilir. Bu teknolojilerin geliştirilmesi; ilaç taraması ve hastalık modellemesi için çoklu organoid içeren, çip üzerinde vücut platformlarının oluşturulmasına zemin hazırlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, çok aşamalı çapraz bağlanma kullanarak 3D doku yapıları için kullanılabilecek materyallerin tasarımına nasıl başlanacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

Ultraviyole ışıkla çalışmanın görme yetisi için son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken UV koruyucu gözlük kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.