Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Bu protokolün genel amacı, biyo-baskı cihazları aracılığıyla ekstrüde edilebilen hidrojel biyomürekkeplerin tasarımı için çok yönlü bir yaklaşım göstermektir. Biyomürekkepler daha sonra üç boyutlu doku yapılarını üretmek için kullanılabilir. Bu yöntem, bir biyoyazıcı kullanılarak ekstrüde edilebilecek bir malzeme sağlamak için gereken mekanik özelliklerin nasıl kontrol edileceği gibi biyo-baskı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, basit ve etkili bir biyoyazdırılabilir hidrojel biyomürekkep oluşturmak için modüler bir şekilde birleştirilmiş ticari olarak temin edilebilen bileşenleri kullanmamızdır. Bu teknolojilerin uygulamaları, ilaçların, toksinlerin ve hastalıkların etkilerini doğru bir şekilde modellemek için kullanılabilecek 3D doku organoidlerinin oluşturulmasını içerir. Bu yöntem, 3D karaciğer yapılarının biyoprint edilmesi için bir çerçeve sağlayabilse de, kas, akciğer ve kolon gibi diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, hidrojel biyomürekkebini oluşturmak için kullanılan bir dizi farklı reaktif olduğu için mücadele edeceklerdir, ancak aslında oldukça basittir. Prosedürü göstermek, ekibimizde bir doktora sonrası olan Young-Joon Seol olacak. Başlamak için, başka bir yerde açıklandığı gibi hidrojel formülasyonunda kullanılmak üzere dokuya özgü bir hücre dışı matris sindirimi hazırlayın.

Daha sonra, bir foto başlatıcıyı hacim başına %0,1'lik bir ağırlık oranında suda çözün Hidrojel biyomürekkepleri oluşturmak için, önce hyaluronik asit hidrojel kitlerinden gelen temel malzeme bileşenlerini su foto başlatıcı çözeltisinin ayrı ayrı alikotlarına çözün. Ardından, ECM solüsyonunu, %2 tiyollenmiş hyaluronik asidi, %2 tiyollenmiş jelatini, çapraz bağlayıcıları ve hepatosit kültür ortamını burada gösterilen oranlarda birleştirin. Biyomürekkebin ekstrüzyon özelliklerini iyileştirmek için, karışıma mililitre başına 1.5 miligram modifiye edilmemiş hyaluronik asit ve mililitre jelatin başına 30 miligram ekleyin.

Ardından, elde edilen karışımı kullanmadan önce on saniye boyunca yüksek ateşte girdaplayın. Biyomürekkebi bir biyo-baskı cihazında test etmeden önce, ekstrüzyon özelliklerini laboratuvar tezgahında test edin. Standart bir şırınga kullanarak, biyomürekkebin bir örneğini bırakın ve ardından şırıngaya 20 ila 30 gauge bir iğne takın.

Biyomürekkebin çapraz bağlanmasına izin verin ve ardından düzgün bir şekilde ekstrüde edilmiş hidrojel filamentler elde etmek için biyomürekkebi iğneden itin. Formülasyon, az sayıda veya hiç yumru olmayan bir filament oluşturabiliyorsa, biyo-baskı için hazırdır. Biyomürekkep preparatlarını bir biyoyazıcıya yüklemek için, biyomürekkepleri sterilize edilmiş yazıcı kartuşlarına pipetleyin.

Ekstrüzyondan önce 30 dakika bekletin, çünkü biyomürekkep kartuş içinde kendiliğinden birinci aşama çapraz bağlanmaya uğrayacaktır. Ardından, kartuşu yazdırma kurulumuna yerleştirin ve kartuşa bir pnömatik basınç kaynağı bağlayın. Ekstrüzyon uyumluluğunu değerlendirmek için yazdırmak için bu yedi x yedi milimetrelik paralel çizgiler ızgarası gibi basit bir desen hazırlayın.

Baskı kafası XY düzleminde dakikada yaklaşık 300 milimetre hızla hareket ederken, biyomürekkebi çıkarmak için kartuşa 20 kilopaskal basınç uygulayın. Ekstrüde edilmiş malzemeler topaklı veya düzensizse, birinci aşama çapraz bağlı malzemeyi yumuşatmak için eklenen çapraz bağlayıcı miktarını azaltın. Düzgün hazırlanmış bir biyomürekkep formülasyonu, hassas biriktirme ve mimarilere izin verecek şekilde düzgün bir şekilde ekstrüde edilmelidir.

Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi asılı bırakma yöntemini kullanarak 96 oyuklu bir plakada 3D birincil hücreli karaciğer sferoidlerini hazırlayın. Kültürde üç gün geçirdikten sonra, karaciğer sferoidlerini bir pipet kullanarak asılı damla plakasından toplayın ve bunları steril, 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Sferoidlerin bir ila iki dakika boyunca konik tüpün dibine çökmesine izin verin.

Ardından, ortamı bir pipetle dikkatlice aspire edin. Yeni hazırlanmış hidrojel biyomürekkep çözeltisinin istenen basılı 3D yapı hacminin yüzde 110 ila 125'ini sferoidleri içeren konik tüpe aktarın. Ardından, hidrojel biyomürekkep çözeltisinde yeniden süspanse etmek için sferoidleri dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.

Eşit şekilde süspanse edildikten sonra, küresel çözeltiyi bir pipet kullanarak bir biyoyazıcı kartuşuna aktarın ve çözeltinin 30 dakika boyunca ilk çapraz bağlama aşamasından geçmesine izin verin. Çapraz bağlama aşamasını takiben, birincil karaciğer sferoidlerini içeren istenen hidrojel yapılarını oluşturmak için bir biyo-baskı cihazı kullanın. Her biriktirme katmanından sonra, ikincil çapraz bağlama mekanizmasını başlatmak için basılı biyomürekkebi iki ila dört saniye UV ışığına maruz bırakın.

Bu, yapıları stabilize edecek ve sertliği istenen seviyeye çıkaracaktır. Çözeltideki PEG alkin konsantrasyonu, genel çapraz bağlama yoğunluğunu kontrol eden şeydir ve bu nedenle esas olarak nihai yapının sertliğini kontrol eder. Biyobaskıdan sonra, konfokal mikroskopi kullanılarak karaciğer yapılarında yüksek hücre canlılığı gözlendi.

Optimal çevresel koşullar altında, canlılık %85'in üzerinde olmalıdırEk olarak, yapılar karaciğer dokusunu gösteren belirteçler için boyandığında, bir sitokrom P450 izoformu olan CYP3A4, hücre içi albümin, bir epitel hücre-hücre adezyon proteini olan E-kaderin pozitif ekspresyonu ve karaciğerde yüksek oranda eksprese edilen bir protein olan DPP4'ün tümü gözlendi. Kültür ortamı üre ve albümin seviyeleri için test edildiğinde, yapının 14 günlük süre boyunca sabit seviyelerde hem üre hem de albümin salgıladığı bulundu. Bu ayrıca, dokuya özgü hidrojel biyomürekkeplerin karaciğer hücrelerinin işlevinin korunmasına yardımcı olduğunu düşündürmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa baştan sona yaklaşık iki saat içinde yapılabilir. Bununla birlikte, bu genellikle kullanılan belirli biyo-baskı cihazına bağlıdır. Bu prosedürü denerken, gösterilen adımların genellikle diğer doku türleri veya biyo-baskı cihazlarıyla uyumlu olacak şekilde uyarlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, diğer doku tiplerinin biyo-baskısını desteklemek için başka hidrojel biyomürekkep formülasyonları oluşturulabilir. Bu teknolojilerin geliştirilmesi, ilaçların taranması ve hastalıkların modellenmesi için çok organoid, çip üzerinde vücut platformlarının oluşturulmasının önünü açmaya yardımcı oldu. Bu videoyu izledikten sonra, çok adımlı çapraz bağlama kullanarak 3D doku yapılarının biyo-baskısı için kullanılabilecek malzemeleri tasarlamaya nasıl başlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Ultraviyole ışıkla çalışmanın kişinin görüşü için son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken UV koruyucu gözlük kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.