Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

Bu protokol, kazınmış topografik kılavuz ipuçlarını hidrojel biyomürekkebi taşıyan bir hücrenin hassas birikimiyle birleştiren otomatik bir robotik biriktirme sistemi kullanan bir biyo-baskı metodolojisini açıklar. Basılı hücreler doğrudan kazınmış özelliklere iletilir ve onlarla birlikte algılayabilir ve yönlendirebilir.

Bu otomatik robotik dağıtım tekniğinin genel amacı, topografik hücre rehberliği için bir yüzey oluşturmak ve daha sonra hücreleri, hücre davranışı ve dağılımı üzerinde kontrol sağlayarak programlanmış bir modeli izleyerek bu özelliklere ulaştırmaktır. Bu yöntem, yüzey topolojilerinin hem monokültürde hem de ko-kültürde hücre davranışını nasıl etkileyebileceği gibi biyomedikal mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, daha yerleşik yöntemlere kıyasla hücre yönlendirme modelini programlamanın ve yazdırmanın daha az zaman almasıdır.

Ayrıca kontrollü dağıtım için hücre dağıtım adımını da içerir. Bu yöntem için ilk olarak, hidrojellerde biriken hücrelerin 2D modellerinin yüzey rehberliğinden yararlanabileceğini fark ettiğimizde aklımıza geldi. Bu nedenle, hidrojelleri yüzey özelliklerine uygun bir şekilde basmak için bu tekniği geliştirdik.

Bu protokol, yüzey aşındırma ve ekstrüzyon tabanlı bir biyoyazıcı olarak geri basınç destekli robotik dağıtım sisteminin kullanımını açıklar. Aşındırma ve baskı için bir polistiren yüzey hazırlamak için bir milimetre kalınlığında bir polistiren levha seçin. Daha kalın çarşaflar daha fazla eğilir.

Ardından, tabakayı oksijen plazması ile tedavi edin. Oksijen gazı regülatörünü iki çubuğa ayarlayın. Ardından plazma makinesini açın ve vakum pompasını açın.

Makineyi dakikada 150 watt ve 30 standart santimetreküp oksijen gazı akışı için programlamaya devam edin ve levhayı 10 dakika boyunca bu koşullara maruz bırakın. Ardından, hazneyi boşaltın ve kapıyı kapatın ve döngüyü başlatın. Daha sonra, tedavi edilen tabakayı saf fetal sığır serumuna batırın ve çalkalama ile iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Serum tedavisinden sonra, tabakayı 1X PBS ile üç kez yıkayın ve tabakayı sterilize edin. Son yıkamadan sonra, tabakayı 37 derecelik bir fırında gece boyunca yaklaşık 12 saat kurumaya bırakın. İlk önce aşındırma için bir baskı kalemi hazırlayın.

Büyük bir özenle, 1,5 milimetre çapında bir tekstil iğnesini, sıkışana ve sabitlenene kadar bir dağıtım şırıngasının ağzına sokun. Biyobaskılı bir düzenlemeyi ilk kez oluşturmaya çalışırken, x, y koordinatlarını oluşturmak için istenen deseni numaralandırılmış eksenlere sahip grafik kağıdına çizin. Ardından desenin koordinatlarını bir elektronik tabloya girin.

Ardından, yazdırma yazılımında Program, Program Ekle, ardından Programı kurmak için Düzenle, Nokta Ekle'yi seçin. Ardından, elektronik tablodaki x ve y koordinat değerlerini baskı dağıtım yazılımına kopyalayın. Her çalıştırmadan önce, kalem temas konumunu ayarlamak için robotun z yüksekliğini kalibre edin.

İlk olarak, Robot seçeneğini seçin. Ardından, Modu Değiştir'e tıklayın ve Öğretme Modu seçeneğini etkinleştirin. Bu, robotun JOG işlevini etkinleştirir.

Robotu JOG yapmak için önce Robot, Meca Initialize'ı seçerek robotu varsayılan konumuna getirin. Sonra, Robot, JOG. Ardından, x ve y yuvalarına, kalemi tam olarak desenin başlangıç noktasına yerleştirmek için gereken mesafeyi milimetre cinsinden girin.

Ardından, yüzeyi esnetmeden veya girintilemeden kalemi veya nozulu yüzeyle temas edecek şekilde yerleştirmek için z yuvasına da milimetre cinsinden sayısal bir değer girin. Bu, z'nin başlangıç değeri olarak belirlenir. Her oluğun derinliği, z yüksekliği kullanılarak değiştirilebilir.

Örneğin, kesilen oluklar 40, 80 veya 170 mikron derinliğinde olabilir. Kalemin esnemesi veya yüzeyde gözle görülür bir girinti olmayacak şekilde bir temas noktası bulmak için konsantrasyon ve yakın gözlem gerekir. Başarıyı sağlamak için, ideal başlangıç konumunu bulmak için birkaç sayfa hazırlamanızı ve programı farklı z yüksekliğinde çalıştırmanızı öneririz.

Bir sonraki adım, koordinat noktalarının her biri için yazdırma talimatını tanımlamaktır. İlk noktayı ve yazdırma başlangıcını tanımlamak için Satır Dağıtımının Başlangıcı'nı kullanın. Ara noktaları belirlemek için Satır Geçişi'ni kullanın ve son olarak, robota yazdırma çalışmasını sonlandırması için sinyal vermek için Satır Sonu Dağıtımı'nı kullanın.

Programı robota iletmek için Robot, C&T Verilerini Gönder'i seçin. Ardından, Robot, Modu Değiştir, Çalıştırma Modunu Değiştir'i seçerek ve ayarı Çalıştır olarak değiştirerek çalıştırmayı başlatın. Son olarak, yazdırmaya başlayın.

Biyomürekkebi yapmak için,% 10 FBS ve% 2 antibiyotik antimikotik ile desteklenmiş Alpha MEM içinde% 2 jelatini çözün. Jelatinin ortamda çözünmesini sağlamak için ortamı iki saat boyunca 60 santigrat dereceye yerleştirin. Biyomürekkep için hücreleri% 70'e kadar kültürleyin.10 santimetrelik tabaklarda birleşir.

Yüzey yönlendirme özelliklerine yanıt veren herhangi bir hücre kullanılabilir ve gömme işlemi sırasında görülebilmeleri için bir floresan etiketi ifade etmelidirler. Ortamı çıkararak, hücreleri PBS ile yıkayarak ve hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca 1X Tripsin-EDTA çözeltisi ile kaplayarak bağlı hücreleri süspansiyona bırakın. Tripsin'i ortam ile nötralize ettikten sonra, hücreleri bir süspansiyon halinde toplayın ve beş dakika boyunca 1.000 g'da pelet haline getirin.

Süpernatanı tanımlayın ve hücreleri 0.5 mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Hücre yoğunluğunu ölçtükten sonra, milimetre başına beş milyon hücreli bir çözelti elde etmek için süspansiyonu soğutulmuş biyomürekkep çözeltisine karıştırın. Ardından, hücre taşıyan biyomürekkebi bir yem kapağı ile bloke edilmiş hazırlanmış bir baskı şırıngasına dökün.

Yazdırılabilir bir viskozite elde etmek için yüklü şırıngayı dört santigrat dereceye kadar soğutun. Ardından, doldurulmuş ve soğutulmuş şırıngayı çıkarın, şırınga kapağını çıkarın ve yazdırma memesini takın. Ardından, yüklü şırıngayı dağıtım sistemine takın ve hava basıncı hatlarına bağlayın.

Biyomürekkebi önceden tasarlanmış desene yazdırmak için kenarların ve çizgilerin belirgin olması gerekir. Hassas baskı aslında dağıtıcının geri basıncını ve baskı nozülünün iğne ölçüsünü optimize ederek elde edilir. 34 gauge konik iğneli 10 mililitrelik bir şırınga için dağıtıcının geri basıncını 0,05 megapaskal'a ayarlayın.

Ardından, yazılımda, bir polistiren film yüzeyine yazma hızını saniyede beş milimetreye ayarlayın. Şimdi, programlanan deseni takip ederek, hücreselleştirilmiş biyomürekkebi önceden kazınmış olukların üzerine bırakın. Hücreleri biriktirdikten sonra, tabakanın oda sıcaklığında 20 dakika inkübe etmesine izin verin.

Daha sonra, basılı hücre iskelesini uygun büyüme ortamında örtün ve hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin, böylece hücreler daha fazla deneyden önce bağlanır. Biyomürekkep içinde biyo-baskı ile tohumlanan kök hücreler, sonunda yüzeye çökeldi ve gizlice kazınmış çizgilerin bir yönü boyunca algılandı ve uzadı. Biyo-baskı yapılmadan kültür ortamında ekilen hücreler de özellikler yönünde hizalanır.

Bununla birlikte, aynı zamanda tüm yüzeyi kapladılar, bu nedenle biyomürekkep, hücreleri basılı izle sınırladı. Kazınmış unsurlar olmadan tabakalara tohumlandığında, hücreler herhangi bir yönelim veya hizalama göstermedi. Bu videoyu izledikten sonra, polistiren levha üzerindeki olukların nasıl hassas bir şekilde aşındırılacağını ve ardından hücrelerin oluklara hassas bir şekilde nasıl biyo-baskı yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık iki ila üç saat içinde yapılabilir. Biyomühendislik alanındaki araştırmacıların, hücre anizotropisi ve konumlandırmasının gerekli olduğu modellerde hücre yüzeyi etkileşimlerini ortaya çıkarması çok yararlıdır. Bioink'in canlı hücreler içerdiğini ve sayfaları yazdırırken steril tekniğin kullanılmasının çok önemli olduğunu unutmayın.