Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon

Bu prosedürün genel amacı, aortik vasküler kalsifikasyonu ex vivo olarak görselleştirmek ve kültüre edilmiş primer fare aortik düz kas hücrelerini kullanarak in vivo vasküler kalsifikasyonu modellemektir. Bu yöntem, vasküler kalsifikasyonun moleküler mekanizmalarını incelemek için bir in vitro model sağlayarak ve in vivo vasküler kalsifikasyon ile makrofaj inflamasyonunun değerlendirilmesine olanak tanıyarak, vasküler hastalık biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalığın erken evrelerinde bile aterosklerotik lezyonlardaki makrofaj aktivitesinin ve kalsiyum depozitlarının hassas bir şekilde miktarının belirlenmesine ve ko-lokalizasyonuna olanak tanımasıdır.

Bu prosedürü Caitlin ve benimle birlikte, laboratuvarımızdaki teknisyen Robert Tainsh uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, kuyruğu alkollü bir pamukla dezenfekte edin ve kuyruk venlerini yan taraflardan belirleyin. Ardından, 30 gauge bir iğne dirençle karşılaşmadan kuyruğa ilerletilirken, şırıngaya hafifçe ileriye doğru basınç uygulayın.

Ardından, 100 µL kalsiyum NIR ve/veya 100 µL cathepsin NIR'yi sabit bir hızla enjekte edin. İğneyi beş saniye sonra geri çekin ve aortaları enjeksiyondan 3 ila 24 saat sonra toplayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, abdominal organları açığa çıkarmak için peritonyumu kaldırın.

Ardından, aortayı kesmemeye dikkat ederek gastrointestinal organları çıkarın. Sonrasında, ön diyaframa lateral bir insizyon yapın ve insizyonu abdomen boyunca devam ettirin. Diseksiyon makası kullanarak, kaburgaların yanlarından keserek ve sternumun üst kısmına yapışık yumuşak dokuyu uzaklaştırarak göğüs kafesini serbest bırakın.

Ardından göğüs kafesini çıkararak akciğerleri açığa çıkarın. Akciğerleri dikkatlice çıkarın. Daha sonra, aortanın sağlam kaldığından emin olarak trakea ve özofagusu dikkatle çıkarın.

Ardından, aortayı çevreleyen yumuşak dokuyu iliak bifurkasyondan aortik arkaya kadar temizleyin. Peri-aortik yağı çıkarırken dikkatli olun. Bundan sonra, torasik aortayı ve aortik arkın büyük dallarını çevreleyen geri kalan yağ ve yumuşak dokuyu temizleyin.

Ardından, timusu çıkarın. Şimdi, kalbi proksimal aortadan dikkatlice ayırarak torasik boşluktan çıkarın. Daha sonra distal aortayı iliak bifurkasyondan kesin.

Kalan kan hücrelerini temizlemek için, insülin iğnesi kullanarak aortik ark üzerinden aortaya normal salin enjekte edin. Aortayı, aortik ark damarlarıyla birlikte ayırın ve vücuttan tamamen çıkarın. Görüntüleme aşamasına kadar aortayı buz üzerinde normal salin çözeltisi içinde bekletin.

Bu adımda, diseksiyonlar tamamlanana kadar aortları soğuk HBSS içinde bekletin. Steril bir doku kültürü davlumbazında, aortları 35 X 10 milimetrelik doku kültürü kaplarındaki aortik sindirim solüsyonuna aktarın. Ardından, 37 °C'de, hafif aralıklı sallama ile 30 dakika boyunca inkübe edin.

Sindirimin ardından, aortalar gerilmiş veya yıpranmış bir görünüm sergilemelidir. Bir diseksiyon mikroskobu altında, medial tabakayı sağlam tutarak aortanın dış adventisya tabakasını çıkarın. Bunun için, aortanın dış tabakasını bir ucundan soyun ve alttaki medial tabakadan bir çorap gibi çıkarın.

Adventis tabakası temizlendikten sonra, geriye kalan aortu yeni bir kültür kabında, hücre kültür ortamı ile 37 °C'de iki ila dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, aortu bir ila iki milimetre genişliğinde halkalar halinde kesin. Halkaları, aort sindirim solüsyonu içeren yeni bir doku kültürü kabına aktarın ve 37 °C'de, hafif aralıklarla sallayarak 120 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, hücreleri tekrar süspande etmek için solüsyonu pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekin. Ardından, sindirim solüsyonuna beş mililitre sıcak hücre kültür medyumu ekleyin ve karışımı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra medyumu aspire edin ve hücreleri istenen hacimdeki hücre kültür medyumunda tekrar süspande edin.

Vasküler düz kas hücrelerinde kalsifikasyonu indüklemek için, hücreleri altı kuyucuklu kültür plağına aktarın ve yapışmalarını bekleyin. Ardından hücreleri kalsifikasyon medyumu ile yeniden besleyin. Hücreleri 37 °C'de en az yedi gün boyunca inkübe edin.

Ardından, hücre kültürü plağından medyumu aspire edin. Hücreleri bir kez iyonize su ile yıkayın. Hücreleri, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 ml %10'luk formalin içerisinde bekleterek sabitleyin.

Ardından formalini uzaklaştırın ve fikse edilmiş hücreleri beş dakika boyunca distile su ile yıkayın. Daha sonra hücreleri, 60 ila 100 watt'lık bir ampul altında, bir mililitre %5'lik gümüş nitrat çözeltisi içinde bir ila iki saat inkübe edin. Sonrasında gümüş nitrat çözeltisini aspire edin ve beş dakika boyunca distile su ile yıkayın.

Beş dakika sonra, hücreleri beş dakika boyunca distile su içinde %5 sodyum tiyosülfat çözeltisinden oluşan bir mililitre sıvıya yerleştirerek reaksiyona girmemiş gümüşü uzaklaştırın. Ardından, hücreleri beş dakika boyunca distile su ile durulayın. Von Kossa ile boyanmış hücreler, artık standart ters ışık mikroskobu ile görüntüleme için hazırdır.

Bu şekilde, wild tip MGP nakavt farelere ve LDLR nakavt farelere kuyruk veni yoluyla kalsiyum NIR ve Katepsini NIR enjekte edilmiş, aortlar 24 saat sonra toplanmış ve NIR floresan görüntüleme ile değerlendirilmiştir. Wild tip fareler, aortik kalsifikasyon veya makrofaj varlığına dair neredeyse hiçbir belirti göstermemektedir. LDLR nakavt farelerden alınan aortlar, makrofaj birikimi ile aynı bölgede yerleşmiş yaygın kalsifikasyonlar içermektedir.

Buna karşılık, MGP nakavt farelerde, makrofaj infiltrasyonu olmaksızın gelişen aortik kalsifikasyon görülür. Bu deneyde, MGP nakavt farelerden kültüre edilmiş aortik VSMC'ler izole edilmiş ve GFP veya MGP eksprese eden adenovirüsle enfekte edilmiştir. Yabani tip farelerden izole edilen aortik VSMC'ler ise kontrol scrambled siRNA veya MGP'yi hedefleyen siRNA ile transfekte edilmiştir.

Hücreler yedi gün boyunca kalsifikasyon medyumu A'da büyütülmüş, ardından fikse edilmiş ve von Kossa ile boyanmıştır. Kalsiyum boyaması, arka plan çıkarma işleminin ardından ImageJ yazılımı kullanılarak nicelleştirilmiştir. Geliştirildikten sonra bu teknikler, bilim insanlarının ateroskleroz ve vasküler kalsifikasyonu ex vivo olarak görüntülemesine olanak sağlamıştır.

Ve in vitro ortamda vasküler kalsifikasyonu modellemek. Bu, yeni ilaç tedavilerinin vasküler hastalıklar üzerindeki etkilerini test etme olasılığını ortaya çıkarmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, primer murin aortik vasküler düz kas hücrelerinde aortların nasıl izole edileceği, yakın kızılötesi floresan görüntüleme probları kullanılarak aterosklerotik plakların ve in vitro ortamdaki kalsifiye vasküler düz kasların nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.