Gerçek Zamanlı Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometresi Doğrudan Analizi Kullanılarak Botanik Malzeme Hızlı Yüksek verim Türler Kimlik

Bu deneyin genel amacı, ortam iyonizasyon kütle spektrometrisi ve çok değişkenli istatistiksel analiz kullanarak botanik materyalin türünü belirlemektir. Bu yöntem, örneğin kimyasal parmak izine dayanarak elinizde hangi bitki türünün olduğunu belirlemek gibi, kimya ve biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Ayrıca bitki dokusunda bulunan biyoaktif moleküller hakkında da bilgi edinebilirsiniz. Bu tekniğin temel avantajı, analiz için çok az numune hazırlığına ihtiyaç duyulması ve verilerin birkaç dakika içinde elde edilebilmesidir. Bu yöntem, kimyadaki diğer sorunların çözümünde de kullanılabilir.

Örneğin, organik sentezdeki reaksiyon ara ürünlerinin ve ürünlerinin takibi, farklı türdeki karmaşık matrislerin analizi ve headspace analizi yapılması. Taze kratom yaprak materyalini hazırlamak için, M.speciosa bitkisinden homojen kratom yaprak parçaları oluşturmak amacıyla altı milimetre çapında bir delgeç kullanın. Bu işlemi beş kez tekrarlayın.

Kratom tozunu ekstrakte etmek için 1,5 mililitrelik bir mikrocentrifüj tüpünde çalışın ve az miktarda kratom Bali tozunu bir mililitre bire bir etanol-su çözücü karışımı içinde süspande edin. Bu işlemi beş kez tekrarlayın. Kratom Bali tozu ekstrakt örneklerini, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ultrasonik banyoda sonike edin.

Ardından, kratom Bali toz ekstraktı örneklerini oda sıcaklığında 750 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Sonraki analizler için çözücüyü kalan tozdan dekante edin. Datura tohumlarını hazırlamak için bir D.stramonium tohumunu jilet kullanarak transvers düzlem boyunca ikiye bölün.

Bu işlemi beş farklı tohum kullanarak tekrarlayın. Kütle spektrometresini veya MS parametrelerini metin protokolünde açıklandığı şekilde ayarladıktan sonra, kratom yaprağını analiz etmek için kütle spektrometresi kontrol yazılımındaki Başlat (Start Run) düğmesine basın. Bir spektrum elde edilene kadar kratom yaprağı bitki materyalinin kalıntısını bir cımbız yardımıyla iyon kaynağı ile kütle spektrometresi girişi arasına asılı tutun.

Bu prosedürü, ayrı bitki materyali örnekleri ile beş kez tekrarlayın. Spektrumu, PEG olarak kısaltılan polietilen glikol 600 ile kalibre etmek için, bir erime noktası kılcal tüpünün kapalı ucunu PEG standardına daldırın. Kaplanmış kılcal tüpü, iyon kaynağı ile kütle spektrometresi girişi arasına asın.

Analitik çalışmayı sonlandırmak için Durdur (Stop) düğmesini seçin. Kurutulmuş kratom yaprağını analiz etmek için kütle spektrometresi kontrol yazılımında Çalışmayı Başlat (Start Run) düğmesine basın. Bir spektrum elde edilene kadar, cımbız yardımıyla küçük bir miktar kurutulmuş yaprak materyalini iyon kaynağı ile kütle spektrometresi girişi arasına yerleştirin.

Her seferinde yeni bitki materyali analiz ederek ölçümü beş kez tekrarlayın. Spektrumu daha önce olduğu gibi PEG ile kalibre edin ve ardından analitik çalışmayı sonlandırmak için Stop düğmesini seçin. Kratom tozunu analiz etmek için kütle spektrometresi kontrol yazılımında Start Run'a basın.

Erime noktası kapilerinin kapalı ucunu kratom tozuna daldırın. Bir spektrum elde edilene kadar, kaplanmış kapileri iyon kaynağı ile kütle spektrometresi girişi arasına yerleştirin. Analizi, her seferinde yeni bir kapiler kullanarak beş kez tekrarlayın ve ardından PEG kalibrasyonu yapın.

Kratom ekstraktını analiz etmek için bir kılcal borunun ucunu ekstraktın içine daldırın. Kılcal boruyu kütle spektrometresinin lineer rayı üzerindeki 12'li numune tutucuya yerleştirin. Her seferinde farklı bir ekstrakt kullanarak işlemi beş kez tekrarlayın.

Kütle spektrometresi kontrol yazılımında Start Run'a basın. Spektrumları toplamak için kontrol panelini kullanarak, lineer rayı iyon akışı boyunca saniyede bir milimetre hızla ilerletmek amacıyla ileri sürme düğmesini seçin. Spektrumu daha önce olduğu gibi PEG ile kalibre edin ve analitik çalışmayı sonlandırmak için Stop'a basın.

Datura tohumlarını analiz etmek için kütle spektrometresi kontrol yazılımında Start Run'a basın. Bir spektrum toplanana kadar datura tohumu yarısını bir cımbız yardımıyla iyon kaynağı ile kütle spektrometresi girişi arasına asın. Kesik tarafın iyon kaynağına bakacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun.

Her seferinde yeni bir tohum yarısını analiz ederek bu prosedürü beş kez tekrarlayın. Analizi PEG kalibrasyonu ile tamamlayın ve analitik çalışmayı sonlandırmak için Durdur'a basın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde veri işlemeyi gerçekleştirdikten sonra, spektral analiz yazılımının Kurulum sekmesi altındaki Sınıflandır bölümüne giderek ve Sınıf Ekle'yi seçerek veri işleme için sınıflar oluşturup temel bileşen analizini gerçekleştirin.

Dosya Ekle'yi seçerek veri metin dosyalarını içe aktarın. Metin Dosyaları ve Seçilen Dosyalar için Sınıf Ata'yı seçerek veri dosyalarını uygun bitki sınıfına atayın. Eğitim setinden MS ayrımı için özellik kütlelerini seçin ve eşik yüzdesini %1 olarak ayarlayın. Ardından, kütle toleransını 10 olarak ayarlayın ve Veri Dosyalarından Vektörleri Oluştur'u seçin.

Hesaplama bölümünde, 3D PCA Grafiği kutucuğunu işaretleyerek temel bileşen analizini gerçekleştirin ve Hesapla'yı seçin. Doğrula'yı seçerek bir-denek-çıkarımlı çapraz doğrulama yapın. Ardından, spektral analiz yazılımının Frekans Grafiği sekmesine gidip Isı Haritası'nı seçerek verilerin ısı haritasını oluşturun.

Abundance eşiğini %1 olarak ayarlamak için Threshold saved data seçeneğini seçin. Save Heat Map to Excel seçeneğini seçerek ısı haritasını bir hesap tablosuna aktarın. Hesap tablosu programında, aktarılan ısı haritasını bir metin dosyası olarak kaydedin. Ardından, hiyerarşik kümeleme analizini gerçekleştirmek için ısı haritasını metin dosyası olarak Cluster 3.0 yazılımına aktarın.

Cluster 3.0'ın Hierarchical sekmesinde, Genes and Arrays altındaki Cluster ve Calculate weights onay kutularını işaretleyin. Cutoff değerini 0.1 ve exponent değerini bir olarak ayarlayın. Analizi gerçekleştirmek için single linkage clustering seçeneğini belirleyin.

Son olarak, oluşturulan cdt veri dosyasını Java ağaç görünümünde inceleyin. Kratom ürünlerinin temsilci yumuşak iyonizasyon pozitif iyon modu spektrumları burada gösterilmiştir. Daha önce M.speciosa'dan izole edilmiş bileşikler tanımlanmıştır.

Psikoaktif biyobelirteçler Mitragynin ve 7-Hydroxy-mitragynine dahil edilmiştir. Datura tohumlarının temsili yumuşak iyonizasyon pozitif iyon modu spektrumları burada gösterilmiştir. Atropine ve Scopolamine psikoaktif biyobelirteçleri de dahil olmak üzere, daha önce datura'dan izole edilmiş bileşikler tanımlanmıştır.

Kütle spektrometrisi verilerinin ısı haritası gösterimleri burada örneklendirilmiştir. Kratom ve datura verilerinin temel bileşen analizi veya PCA grafiği gösterilmektedir. PCA grafiği, kratom verileri ile datura verilerinin birbirinden net bir şekilde ayrıldığını açıkça göstermektedir.

PCA analizi ayrıca, kratomun bireysel varyetelerinin ve datura'nın farklı türlerinin tanımlanabildiğini ve birbirinden ayırt edilebildiğini ortaya koymuştur. Kratom ve datura kütle spektral verilerinin hiyerarşik kümeleme analizi veya HCA sonuçları gösterilmektedir. HCA sonuçları; yalnızca gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisinden elde edilen verilerin doğrudan analizine dayanarak sınıf, tür ve varyete farklılaşmasını ortaya koymuş ve PCA analizi sonuçlarını doğrulamıştır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde numune sayınıza bağlı olarak bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, karmaşık numuneleri analiz etmek için doğrudan analiz ve gerçek zamanlı kütle spektrometrisini nasıl kullanacağınız ve tür bilgilerini elde etmek için verilerin istatistiksel analiz işlemesini nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Bu prosedürü uygularken, numunenin tam bir kütle spektrumunu elde edebilmek için numuneyi iyon akımında uygun bir süre tutmak önemlidir.

Bu teknik; Bitki Omikleri, Adli Tıp, Organik ve Analitik Kimya dahil birçok alandaki araştırmacıların, bitkiler tarafından salınan uçucuların analizini yapmalarına, yasa dışı ilaçlara yasal alternatifler belirlemelerine ve reaksiyon ürünlerini gerçek zamanlı olarak izlemelerine olanak sağlamıştır.