Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak Sıvı Nano-ölçekli Nesnelerin dinamik Süreçlerinin İncelenmesi
5 Şubat 2017
Bu protokol, nano ölçekli dinamik süreçleri gözlem için kullanıldığı şekilde, su içinde AuNPs transmisyon elektron mikroskobu için bir sıvı akımı numune tutucu çalışmasını açıklar.
Sıvı faz taramalı transmisyon elektron mikroskobunun genel amacı, kalınlığı birkaç mikrometreye kadar olan bir sıvı tabakasına tamamen gömülü biyolojik numunelerdeki nanomalzemelerin yapılarını ve fenomenlerini gözlemlemektir. Bu yöntem, nanomalzemelerin sıvı içindeki davranışı ve doğal sıvı ortamındaki biyolojik örneklerin incelenmesi gibi Malzeme Bilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sıvı içindeki örnekler hakkında nano ölçekte morfolojik bilgi sağlamasıdır.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü numune tutucunun yüklenmesi ve görüntü elde edilmesi, ilk olarak elektron mikroskobu ile yapılan kadar basit değildir. Prosedüre başlamak için, temiz bir laminer akış başlığında, lif içermeyen bir doku ve saf etanol ile hafif bir mikroskopi cam slaytını temizleyin. Slaytı, kapaklı bir Petri kabındaki temiz oda dokusuna yerleştirin.
SiN mikroçiplerini manipüle etmek için, karbon kaplı cımbız kullanarak, mikroçipi uzun kenarlarından dikkatlice tutun ve SiN zarını her zaman yukarı bakacak şekilde tutun. Bu tekniği kullanarak, cam slaytın üzerine ara parçası olmayan beş mikroçip ve 200 nanometre ara parçası olan beş mikroçip yerleştirin. Petri kabını kapatın ve mikroçipleri çeker ocak'a getirin.
Mikroçipleri, zar tarafı yukarı bakacak şekilde HPLC sınıfı asetonlu bir behere yerleştirin. Koruyucu kaplamayı çıkarmak için kabı iki dakika boyunca hafifçe döndürün, mikroçipleri ters çevirmemeye dikkat edin. Ardından, mikroçipleri hızlı bir şekilde saf etanol kabına aktarın.
Beheri alüminyum folyo ile örtün. Kaplamayı çıkarmayı bitirmek için kabı iki dakika boyunca hafifçe döndürün ve kapalı bir Petri kabında laminer akış başlığına getirin. Mikroçipleri cımbızdan çıkarken ters çevirmemeye dikkat ederek yeni bir temiz oda mendili üzerine yerleştirin.
Mikroçiplerin birkaç dakika kurumasını bekleyin. Ve sonra mikroçipleri Petri kabındaki cam slaytın üzerine yerleştirin. Petri kabını kapatın ve mikroçipleri bir plazma temizleyiciye getirin.
Cam sürgüyü ve mikroçipleri plazma temizleyiciye yerleştirin ve hidrokarbonları SiN zarından çıkarmak için beş dakikalık bir temizleme programı çalıştırın. Bir ışık mikroskobu kullanarak, mikroçiplerde yırtılmış zarlar veya kir parçacıkları olup olmadığını kontrol edin. Hasarlı veya kirli mikroçipleri atın.
Laminer akış başlığında, mikroçipleri yapışkan bir iç yüzeye sahip temiz bir taşıma kutusunda hareketsiz hale getirin. Her bir mikroçipin SiN membranına ara parça olmadan üç molar sitrat stabilize edilmiş sulu altın nanopartikül çözeltisinden bir mikrolitrelik bir damlacık uygulayın ve çözeltinin kurumasını bekleyin. Ardından, tuz ve yüzey aktif maddeleri yıkamak için zara bir mikrolitre deiyonize su uygulayın.
30 saniye sonra, suyu dikkatlice kurutmak ve mikroçiplerin kurumasını sağlamak için filtre kağıdı kullanın. Sıvı akışı TEM tutucusunun ucunu bir binoküler ışık mikroskobu altına yerleştirin. Titanyum kapağı tutucu ucundan çıkarın ve bir alüminyum folyo tabakasının üzerine yerleştirin.
0,5 mililitre HPLC dereceli su içeren bir mililitrelik cam şırınga ile bir mikroakışkan şırınga pompası kurun. Şırıngayı akış sistemine bağlayın ve pompayı çalıştırın. Su sistemden akıtılırken, hatlarda sızıntı veya akış daralması olup olmadığını kontrol edin.
Pompalama tamamlandığında, durulamayı sıvı hücre bölmesinden çıkarın ve tutucu ucu filtre kağıdı ile kurulayın. Tutucu ucunu ışık mikroskobu ile inceleyin. Ucu temiz oda mendiliyle kurulayın ve temiz PTFE kaplı cımbızla tozu veya lifleri temizleyin.
Tutucu uç kapağını, O-ringi ve vidaları inceleyin ve PTFE kaplı cımbızla tozu veya lifleri temizleyin. O-ringi tutucu gruplarına yerleştirin. İlk vidayı yerleştirin ve sadece kalması için birkaç kez çevirin.
Temiz kavisli cımbızla, numune mikroçipini SiN zarı yukarı bakacak şekilde tutucu ucun cebine yerleştirin. Mikroçipin doğru şekilde oturup oturmadığını kontrol etmek için binoküler ışık mikroskobunu kullanın. Numune mikroçipinin üzerine 0,3 mikrolitrelik saf filtrelenmiş su damlatın.
Mikroçipi cımbızla yerinde tutmak. Ardından, baş aşağı tutulan kavisli cımbızlı bir ara parça mikroçip alın. Cımbızları, mikroçip zarı aşağı bakacak şekilde dikkatlice döndürün.
Ara parça mikroçipini numune mikroçipinin üzerine yerleştirin. Işığı yansıtan malzemeyi tutucu ucun altına yerleştirin ve dürbün ışık mikroskobu altında mikroçip hizalamasını kontrol edin. SiN pencereleri hizasızsa mikroçipleri dikkatlice ayarlamak için cımbız kullanın.
Ardından, numune haznesi kapağını cımbızla alın. Kapağı ters çevirin ve mikroçiplere dokunmadan kapağın arka tarafını tutucu ucuna dayayın. Kalan vidayı cımbız kullanarak yerleştirin ve her iki vidayı da yinelemeli bir şekilde sıkın.
Dirençle karşılaşana kadar dikkatlice sıkın. Sıkma çok güçlüyse pencereler kolayca kırılabilir. Sistemden dakikada dört mikrolitrelik bir sıvı akışı başlatın ve tutucu ucunda sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
Ardından, tutucuyu bir vakum pompası istasyonuna getirin ve bir sızıntı kontrolü yapın. Basıncın beş dakika içinde en az 10 ila negatif beşinci mbar'a ulaştığından emin olun. Tutucuyu muhafazasına yerleştirin.
Ve tutucuyu elektron mikroskobuna getirin. Mikroskobu STEM modunda ayarlayın. Elektron demetinin akım yoğunluğunu, susuz bir referans numune olarak altın nanopartiküllerle kaplanmış ince bir karbon film ile ölçün.
Saf su akışını dakikada iki mikrolitreden fazla olmayan bir oranda başlatın. Sıvı akışı TEM tutucusunu vakum yük kilidine yerleştirin ve tahliyeye başlayın. Basıncın normal şekilde düştüğünden emin olun.
Ardından TEM tutucuyu mikroskoba tam olarak yerleştirin. Basınç yeterince düşük olduğunda, ışın valfini açın ve ADF dedektörünü takın. Mikroskobu sürekli çekim moduna ayarlayın ve SiN penceresini bulmak için numune aşamasını X ve Y yönlerine çevirin.
Kontrastı ve parlaklığı, pencerenin kenarları net bir şekilde görünecek şekilde ayarlayın. Sahne alanını X ve Y yönlerinde, pencerenin bir köşesi görüş alanının merkezinde olacak şekilde çevirin. Ardından objektif lensi sıfırlayın.
Köşeyi kaba bir şekilde odaklamak için örnek aşamasının dikey konumunu ayarlayın. Numunenin ösantrik yükseklikte olduğunu kontrol etmek için sahneyi beş derece ileri geri eğin. Pencere köşesini görüş alanında ortalayın ve ardından sahne alanı konumunu yazılımda kaydedin.
Altın nanoparçacıklar görünene kadar sahneyi X ve Y yönlerinde çevirin. Ve sonra objektif lensi odaklayın. Mevcut yoğunluğu not edin ve sıvı hücre kalınlığını hesaplayın.
En az 20 altın nanoparçacık içeren bir alanı bulmak için sahneyi X ve Y yönlerinde çevirin. Parametreleri ayarlayın ve bir görüntü elde edin. Altın nanopartiküller, bir silikon nitrür membran üzerinde hareketsiz hale getirilir ve sıvı faz STEM ile görüntülenir.
Saf suda, altın nanopartiküller görüntüleme boyunca şekillerini korudular. Sudaki radyoliz ürünleri, sonunda nanopartiküllerin şeklini değiştirebilecek tek tek altın atomlarını oksitleyebilir. Başka bir deneyde, klorür iyonları sıvı faza sokulur.
Altın nanoparçacıkları, oksitlenmiş altın atomları çözünür tetrakloroaureat oluşturduğunda deney boyunca yavaşça çözüldü. Altın nanopartiküllerin sudaki hareketlerini araştırmak için, sonraki deneyde, nanopartiküller numune zarı üzerinde tamamen hareketsiz hale getirilmedi. Altın nanoparçacıklar topaklandı ve kritik bir küme boyutuna ulaştığında görüş alanından çıktı.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Birkaç haftalık eğitim gerekli olacaktır. Bu prosedürü denerken, sakince çalışmayı ve vakum sıkılığını ve sıvı kalınlığını kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.
Geliştirilmesinden sonra bu teknik, Malzeme Bilimi, Kimya ve Biyoloji alanındaki araştırmacıların sıvıda nanopartikül büyümesini ve hareketini, sıvı ortamlardaki nano ölçekli malzemelerin yapısını ve memeli hücrelerinde proteinlerin işlevselliğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, numune tutucunun doğru yüklenmesi ve mikroskobun ayarlanması da dahil olmak üzere, bir su tabakasına gömülü altın nanopartiküllerin taramalı iletim elektron mikroskobunun nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Elektron mikroskobunda sıvı ile çalışmanın, numune tutucunun doğru şekilde yüklenmemesi durumunda hasara neden olabileceğini unutmayın.
Bu nedenle, yüklemeden önce vakum sızıntısı olup olmadığını kontrol etmek önemlidir.
Genel Bakış
Bu protokol, su içindeki AuNP'lerin taramalı geçişli elektron mikroskobisi için bir sıvı akış numune tutucusunun çalışmasını açıklar ve nano ölçekli dinamik süreçlerin gözlemlenmesini kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Taramalı Geçişli Elektron Mikroskobisi
- Nanomalzemeler
- Sıvı Faz Görüntüleme
Arka Plan
- Sıvı faz taramalı geçişli elektron mikroskobisi, nanomalzemelerin sıvı ortamda gözlemlenmesini sağlar.
- Bu teknik, numuneler hakkında nano ölçekli morfolojik bilgiler sağlar.
- Özellikle biyolojik örneklerin doğal sıvı durumlarında çalışılması için yararlıdır.
- Yeni kullanıcılar, numune yükleme ve görüntü elde etme süreçlerini zor bulabilirler.
Çalışmanın Amacı
- Biyolojik örneklerdeki nanomalzemelerin yapılarını ve fenomenlerini gözlemlemek.
- Nanomalzemelerin sıvı içindeki davranışı araştırmak.
- Nano ölçekli dinamik süreçler hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Numune yükleme için SiN mikroçiplerin temizlenmesi ve hazırlanması.
- Mikroçiplere altın nanopartikül çözeltisinin uygulanması.
- Görüntüleme için bir sıvı akış TEM tutucusu kullanımı.
- Sızıntı kontrollerinin yapılması ve mikroçiplerin doğru hizalanmasının sağlanması.
Ana Sonuçlar
- Protokol, sıvı ortamda AuNP'lerin hazırlanmasını ve görüntülenmesini başarıyla gösterir.
- Süreç sırasında numune bütünlüğünü sağlamak için adımları belirtir.
- Sonuçlar, sıvı akış tutucunun dinamik süreçleri yakalamada etkinliğini gösterir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, sıvı ortamda nanomalzemelerin davranışları hakkında değerli bilgiler sağlar.
- Biyolojik örnekleri incelemek için elektron mikroskobisinin kabiliyetini artırır.
- Gelecek uygulamaları malzeme bilimi alanındaki çeşitli alanlara genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
