Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

Bu protokolün genel amacı, görüntü kılavuzlu lazer tabanlı bozunma kullanarak polietilen glikol diakrilat hidrojellere gömülü üç boyutlu vasküler türevli biyomimetik mikroakışkan ağlar oluşturmak için femtosaniye darbeli lazer ile donatılmış bir konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağını açıklamaktır. Bu tekniğin önemli bir avantajı, sentetik yapılarda in vivo vaskülatür yoğunluğunu, kıvrımlılığını, boyut aralığını ve genel mimarisini doğru bir şekilde özetleyen üç boyutlu biyomimetik mikroakışkan ağlar oluşturma yeteneğidir. Bu mikroakışkan üretim yaklaşımı, doku mühendisliği yapıları, biyomimetik hastalık modelleri ve bir çip cihazında ultra yüksek yoğunluklu gibi daha fazla in vivo üretme yeteneğimizi geliştirecektir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü mikroskop yazılımının uygun şekilde kurulması ve uygulanması sezgisel değildir, ancak istenen mikroakışkan ağların oluşturulmasında çok önemlidir. Sanal maskelerin oluşturulması, mikroskobun yapılandırılması ve sanal maskelerin mikroskop yazılımına yüklenmesi dahil olmak üzere hazırlık adımlarının çoğu metin protokolünde ele alınmaktadır. PEGDA hidrojeli fotopolimerize etmek için, önce alttan 20 milimetrelik bir delik açılmış 60 milimetrelik bir petri kabına çift taraflı bir yapışkan halkası takın.

Daha sonra, bir çeker ocakta, folyo kaplı iki mililitrelik kehribar santrifüj tüpüne TEOA ile bir mililitre HBS ekleyin. Ardından, tüpe 10 mikrolitre bir milimolar Eosin Y disodyum tuzu ekleyin. Şimdi, bir cam pipet kullanarak küçük bir hacimde NVP'yi bir cam behere pipetleyin.

Bu hacimden 3,5 mikrolitre NVP alın ve karışıma aktarın. Daha sonra, ikinci bir folyo kaplı tüpe 10 miligram 3.4 kilodalton PEGDA ekleyin. Ardından, hacimce %5'lik bir PEGDA prepolimer çözeltisi elde etmek için karışımdan 0,2 mililitre ekleyin.

Şimdi, PEGDA tamamen çözülene kadar prepolimer çözeltisini girdaplayın. Ardından, herhangi bir kabarcık oluşturmadan bir PDMS kalıbına 60 mikrolitre pipetleyin. Şimdi, akrilatlı 40 milimetre numaralı 1.5 cam lamel PDMS ara parçalarındaki çözeltinin üzerine ortalayın.

Ardından düzeneği 95 miliwatt verecek şekilde kalibre edilmiş beyaz bir ışık kaynağının altına yerleştirin. Polimeri üç dakika sertleştirin. Ardından, hidrojeli PDMS'den ayırmak için kalıp ve lamel arasına damıtılmış su akıtın ve hidrojeli durulayın.

Ardından, hidrojelden su çekmeden lamel kenarlarını dikkatlice kurulayın. Şimdi, lamel hazırlanan petri kabına yapıştırın. Biraz baskı yardımcı olur.

Ardından, hidrojeli damıtılmış suya batırın. Lazer taramalı konfokal mikroskobu metin protokolünde açıklandığı gibi ayarlayın ve hidrojel görselleştirme konfigürasyonuna başlayın. Ardından, hidrojel ve petri kabını sahne ekine yerleştirin ve sahneye yerleştirin.

Ardından, petri kabını en az beş mililitre damıtılmış su ile doldurun ve suya daldırma hedefini hidrojelle temas etmeden hemen üzerine indirin. Şimdi, argon lazer çizgisini açmak için canlı yayına tıklayın. Ardından, hidrojelin üst tarafında Eozin Y sinyali görünene kadar hidrojele odaklanın.

Hidrojeli bulmanıza yardımcı olmak için, güç yüzdesini veya iğne deliği boyutunu geçici olarak artırmayı deneyin. Hidrojelin üst ve alt kısımlarının ve kuyu tabanının yerlerini işaretleyin. Ardından enine hareket etmek ve kuyunun kenarlarını bulmak için joystick'i kullanın.

Odak penceresinde, Z konum kutusunun yanındaki aşağı oku kullanarak odak düzlemini hidrojel içinde 150 mikron aşağı bırakın. Bir sonraki adım kritiktir. Sahne alanı penceresindeki X ve Y konumunu sıfırlayın, ardından işaretli diğer tüm konumları silin ve yalnızca sıfırlanan konumu işaretleyin.

Şimdi, bir giriş kanalı oluşturma işlemini başlatmak için önce bir görüntü çekin ve ardından bölgeler penceresindeki dikdörtgen düğmeyi kullanarak vasküler ağa giriş olacak bölgeyi ana hatlarıyla belirtin. Ardından kanal oluşumu konfigürasyonuna geçin. Ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir.

Oradayken, bir Z yığını penceresinde, Z yığınını geçerli konumda ortalamak için üst ve üst ofsetteki orta düğmelere tıklayın. Ardından, girişin ne kadar büyük olması gerektiğine bağlı olarak, dilim sayısını bir aralıklarla ayarlayın. Şimdi, hızın üçe ve güç yüzdesinin 100'e ayarlandığını kontrol edin.

Ardından yapılandırmayı kaydetmeye devam edin ve denemeyi başlat düğmesine tıklayın. Kanalın bozulması sırasında hidrojeli görselleştirmek için, görüş alanındaki bölge siyahsa kanallar penceresindeki kazanç master'ı artırın veya bölge beyazsa gain master'ı azaltın. Bozunmadan sonra, hidrojel görselleştirme konfigürasyonuna geri dönerek ve canlı'ya tıklayarak girişin oluşturulduğundan emin olun.

İlk olarak, bölgeler penceresinin altında, sanal maskelerin Z yığınından herhangi bir ovl dosyasını yükleyin ve görüş alanındaki ROI'leri görmek için ok düğmesine tıklayın. Ardından, hidrojel görselleştirme konfigürasyonunu taramak için canlı yayına tıklayın ve hidrojeli, girişin vasküler ağ içinde doğru konuma bağlanacak şekilde konumlandırmak için joystick'i veya sahne penceresini kullanın. Ardından, odak penceresindeki adım boyutunu kullanarak odak düzlemini mikroskop makrosundaki önceki ortalanmış Z konumundan 50 mikron aşağı olan ilk konuma bırakın ve aşağı oka tıklayın.

Yine, şimdi X ve Y konumlarını yeniden sıfırlamak, diğer tüm işaretli konumları silmek ve yalnızca bu konumu yeni sıfır noktası olarak işaretlemek çok önemlidir. Bu yeni yapılandırmayı kaydettiğinizden emin olun. Şimdi, kanal oluşturma yapılandırması altında yalnızca zaman serisini ve ağartma pencerelerini seçin.

Ardından, makroyu açın ve kaydetme sekmesini seçin. Daha önce yapılmış tarifi seçin ve uygula'ya tıklayın. Mağazaya tıklamadığınızdan emin olun, aksi takdirde tarifin üzerine yazılacaktır.

Ayarları doğruladıktan sonra, kanal oluşumu konfigürasyonunu tekrar kaydedin ve ardından mikroskop makrosunda güncelle'ye tıklayın. Geçerli konum listesinin üzerine yazmak için hayır'a tıklayın ve ardından tarife başlamak için mikroskop makrosunda başlat'a tıklayın. Bozunma işlemi tamamlandıktan sonra, hidrojelin doğal Eosin Y sinyalinden daha parlak bir sinyale sahip olan FITC etiketli dekstranın görüntülenmesini sağlamak için daha düşük bir lazer gücünde hidrojel görselleştirme konfigürasyonunu kullanın.

Floresan etiketli dekstranı eklemeden önce, hidrojeldeki kuyudan bir miktar su çekin. Daha sonra 10 mikrolitre filtrelenmiş FITC etiketli dekstran pipetleyin. Açıklanan prosedür, büyük hacimli mikrovasküler görüntüleri, görüntü kılavuzlu mikroakışkan ağ oluşumu için bir dizi sanal maskeye dönüştürmek için kullanıldı.

Elde edilen mikroakışkan ağ, türetildiği in vivo vaskülatür ile karşılaştırıldı. Görüntü kılavuzlu lazer tabanlı hidrojel bozunması, in vivo vaskülatürün boyutunu, kıvrımlılığını ve karmaşık mimarisini özetleyen 3D biyomimetik mikroakışkan ağların üretilmesini sağladı. Basınç başlıkları ve şırınga pompaları, bu gömülü mikroakışkan ağlarda sıvı akışını başlatmak için kullanıldı.

Floresan etiketli 70 kilodalton dekstran ve 10 mikron polistiren boncukların, basınç kafasının neden olduğu bir akışla soldan sağa hareket ettiği gözlendi. Alternatif olarak, şırınga pompası tahrikli akış, ikincil bir mikroakışkan cihazın içindeki bir hidrojelin fotopolimerize edilmesiyle başlatıldı. Burada açıklanan aynı protokolü kullanarak, daha sonra şırınga pompası tahrikli akış ve 65 kilodalton dekstran bolluğu için muhafazalı bir hidrojelde 2D vasküler türevli bir ağ imal etmek için lazer bazlı bozunma uygulandı.

Bu videoyu izledikten sonra, görüntü kılavuzlu lazer tabanlı hidrojel bozunması kullanarak biyomimetik mikroakışkan ağlar oluşturmak için femtosaniye darbeli lazer ile donatılmış bir lazer taramalı konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, güç, dalga boyu ve tarama hızı dahil olmak üzere lazer parametrelerinin, bozulan hidrojel formülasyonuna göre ayarlanması ve optimize edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir.

Teşekkür ederim ve deneylerinizde iyi şanslar.