Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, in vivo mikrodamarların 3D geometrisini taklit eden ve kontrollü sürekli perfüzyon akışı altında çalışan, çok derinlikli dairesel kesitli endotel canlı mikro kanallardan oluşan bir çip geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle pozitif yeniden akışkan fotoresist kullanılarak yarı dairesel kesitli bir mikro kanal ağına sahip bir ana kalıbın fotolitografik olarak üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ana kalıbı kullanarak iki poli dimetil siloksan mikro kanal kopyalamak, bunları hizalamak ve silindirik bir mikro kanal ağı oluşturmak için birbirine bağlamaktır.

Ardından, hücreler dört gün ile iki hafta arasındaki bir süre boyunca kontrollü sürekli ortam perfüzyon koşulları altında kültüre edilmeden önce, primer insan göbek kordonu ven endotelyal hücreleri mikrokanal ağına yerleştirilir. Nihayetinde, mikroskoplarda membran ve çekirdeklerin görünür olduğu konfluens bir hücre monotabakası, karmaşık vasküler fenomenlerin incelenmesi için bir platform sağlayabilecek fonksiyonel mikro damarların hesaplanmasına olanak tanıyarak mikrokanal ağının iç yüzeyi boyunca gelişir. Ancak, hücre göçü deneyleri, tüp oluşum deneyleri ve ring deneyleri gibi geleneksel bireysel mikro damar analizleri, üç boyutlu geometri ve sürekli akış kontrolü açısından bireysel mikro damarları yeniden oluşturmada sınırlıdır.

Mevcut mikrofabrikasyon yöntemimiz olan tekniklerimizin temel avantajı, yuvarlatılmış kesitlere sahip in vivo mikro damarların karmaşık 3D geometrilerini taklit eden, çok derinlikli bir mikroakışkan kanal ağını geleneksel yöntemlerle üretebilmesidir. Ayrıca, akışın yaklaşık olarak daha yavaş seyrettiği ve toplam kanal direncinin düşük kalması için sıvı akışının gerekli düzeyde tutulduğu, böylece ağ genelinde daha üniform bir akış elde edilen mikrovasküler biyomanyetik sistemlerin tasarlanmasına olanak tanır; bu prosedür laboratuvarımdan bir lisansüstü öğrencisi tarafından gösterilecektir. Bu prosedür, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı üzere, çapları 30 mikron ile 60 mikron arasında olan mikro kanallardan oluşan bir fotorezist ana kalıbın üretimi ile başlar; kısaca, reflow fotorezisti kullanımdan 24 saat önce dört derece Celsius'taki buzdolabından temiz odaya aktarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.

Metin protokolündeki prosedürü takip ederek, önceden temizlenmiş bir silikon substrat üzerine pozitif reflow fotoresist tabakasını spin coating yöntemiyle kaplayarak başlayın. Ardından, desenli mikro kanalları geliştirmeden önce fotoresisti desenli bir maske aracılığıyla UV ışığına maruz bırakın. Son olarak, reflow işleminden sonra, yarı dairesel kesitli bir mikrokanal ağı oluşturun.

Ana kalıp hazır olduğunda, 10'a bir baz ile kürleme ajanı ağırlık oranında polimetilsiloksan veya PDMS çözeltisi hazırlayın ve bir gezegensel santrifüj karıştırıcı kullanarak iyice karıştırın. PDMS çözeltisini, yeniden akıtılmış fotoresist ana kalıba dökün. Gaz giderme işlemi için dökülen PDMS'i 15 dakika boyunca bir desikatörde bekletin.

Gerekirse, kalan hava kabarcıklarını gidermek için azot gazı kullanın. PDMS'in kürlenmesini sağlamak için 60 °C sıcaklıktaki fırında üç saat boyunca pişirin. Ardından, kürlenmiş PDMS tabakasını ana kalıptan ayırın.

Kanal ağında delikler açarak giriş ve çıkış delikleri oluşturmak için bilenmiş bir delgeç kullanın. PDMS yüzeyini nitrojen gazı kullanarak temizleyin. İki PDMS katmanını, bir plazma temizleyici içerisinde 45 militorr çalışma basıncında ve dakikada 3,5 kübik ayak oksijen akış hızında 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın.

Ardından, PDMS yüzeylerini bir optik mikroskop altında manuel olarak hizalayın. Hizalamayı daha iyi kontrol edebilmek için gerekirse bir damla su kullanın. Son olarak, kalıcı bağlanma kültürünü sağlamak için cihazı bir fırında 60 °C'de 30 dakika boyunca pişirin.

%10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş, L-glutamin içeren kültür ortamında primer insan göbek ven endotel hücreleri veya VE. Cihazı, 45 milit çalışma basıncında ve dakikada 3,5 kübik fit oksijen akış hızıyla beş dakika boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Ardından, sterilizasyon için cihazı deiyonize su ile doldurun ve laminer biyogüvenlik kabininde sekiz saat boyunca UV ışığı ile işleme tabi tutun.

Hücreler hazır olmadan bir gün önce, cihazı bir x fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve ardından fibronektin ile kaplayın. Buzdolabında dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Hücreler konfluent hale geldiğinde, önce hücreleri HEPES tamponlu salin solüsyonu ile durulayarak ve ardından tripsin eklemesinin ardından hücreleri tripsin EDTA ile muamele ederek hasat edin.

Hücreleri 37 °C'de iki ila altı dakika boyunca inkübe edin. Tripsinizasyon tamamlandıktan sonra, tripsin EDTA'yı tripsin nötralizasyon çözeltisi ile nötralize edin. Hücreleri sayın ve ardından resüspansiyondan önce santrifüjleyin.

%8 dekstrin içeren kültür ortamında süspansiyon haline getirme, FI enc ENC kaplamasının ardından daha iyi hücre yerleşimi ve tutunmasını sağlamak için ortam viskozitesini artırmak amacıyla kullanılır. Cihazı bir kez XPBS ile yıkayın ve ardından 37 °C sıcaklıkta 15 dakika inkübe etmeden önce cihazı kültür ortamı ile doldurun. Sonrasında, %8 dekstrinli kültür ortamında mililitre başına 3 ila 4 milyon hücre konsantrasyonundaki hücreler cihaza yüklenir.

Cihazın bir girişine 20 µL hücre damlası yerleştirin ve hücrelerin mikroakışkan kanala girmesini sağlamak için cihazı eğin. 15 ila 20 dakika sonra hücreler, kanalların yan duvarlarına tutunmaya başlayacaktır. Hücrelerin daha homojen bir dağılım oluşturması için cihazı her 15 dakikada bir döndürün.

Gerektiğinde ek yükleme yapılabilir. Beş ila altı saatlik statik kültürün ardından, yapışan hücreler tamamen yayılmaya başlayacaktır. Uzaktan kumandalı bir şırınga pompası sistemi kullanarak, saatte 10 microliters sabit akışla uzun süreli perfüzyon kurun; perfüzyon daha yüksek bir akış hızı için ayarlanabilir ve dört gün ile iki hafta arasındaki bir süre boyunca devam edebilir.

Hücreler cihaz içinde konfluansa ulaştığında, önce besiyerini tamamen uzaklaştırmak için cihazı bir kez XPBS ile yıkayın. Ardından, cihazı oda sıcaklığında beş dakika boyunca karanlıkta inkübe ettikten sonra seyreltilmiş kırmızı boya ile doldurun. Boyamayı durdurmak için cihazı kültür besiyeri ile yıkayın.

Boyanın uzun süreli inkübasyonu, hücresel toksisiteye ve adezyon kaybına neden olabilir. Ardından, cihazı 1X PBS ile seyreltilmiş mavi boya ile doldurun ve 1X PBS ile iyice yıkamadan önce oda sıcaklığında, karanlıkta beş dakika boyunca inkübe edin. Hücre boyamasını ters bir optik mikroskop altında inceleyin.

Boyama başarılıysa, mikrokanalları tespit ortamı ile doldurun, ardından cihazı tespit ortamına batırın ve alüminyum folyo ile tamamen kaplayın. Cihazın kurumasını önlemek için cihazı buzdolabında dört derece Celsius sıcaklıkta saklayın; tespit edilen cihaz artık lazer taramalı konfokal mikroskop, taramalı elektron mikroskobu ve optik mikroskop ile gerçekleştirilebilen konfokal görüntüleme için hazırdır. Yeniden akış sonrası fotoresist ve replike edilmiş PDMS kanalın, yeniden akış işlemi öncesi ve sonrası karakterizasyonu için kullanılmıştır.

PDMS mikrokanal ağının geometrik özellikleri karakterize edilmiş ve burada gösterilmiştir. PDMS kalıpların dairesel kesitleri, her dallanma seviyesindeki kanal boyutlarını göstermektedir. Sonuçlar, fotorezist yeniden akış tekniğinin, çok derinlikli dallanan kanal ağlarını fotorezist yeniden akış teknikleri ile daha kolay bir yaklaşımla oluşturabildiğini ve burada gösterilen, yaklaşık olarak Murray yasasına uyan mikrovasküler biyomimetik sistemlerin tasarlanmasına olanak tanıdığını göstermektedir; bunlar, kırmızı floresan hücre membranı boyası ve mavi hücre çekirdeği boyası kullanılarak elde edilen mikroskopi görüntüleridir.

Dairesel kesit görünümleri, VE'nin farklı dallanma bölgelerinde silindirik bir mikrokanal ağının iç yüzeyini kapladığını ortaya koymuştur. İn vivo mikro vasküler yapının karmaşık geometrileri nedeniyle, bu küçük damarların gerçek zamanlı izlenmesi zordur. Geliştirilen PDMS tabanlı çip, iyi optik özellikler sunar ve dairesel kanal ağı boyunca hücre kaplamasının gösterildiği bu konfokal videoda olduğu gibi, endotelyal mikro kanalların yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntülenmesine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, bu kütle modu için reflow işleminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Dairesel kesitli PDMS mikro kanal ağı oluşturma, endo hücrelerini cihazlara yükleme ve uzun süreli medya perfüzyonunu kurma adımlarını öğreneceksiniz. Özetle, bir çip üzerinde geliştirilen endo serileştirilmiş mikro kanallar, InVivo mikro damarların geometrisini taklit eden, dairesel kesitli ve farklı derinliklerdeki mikro kanal ağlarını oluşturmak için hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Bu prosedür, uzun süreli sürekli perfüzyon kontrolüne sahip bir mikrovasküler model oluşturmak için ileri mikro üretim ve mikro akışkan teknolojilerindeki benzersiz yeteneklerin kullanımının yanı sıra, hücre biyolojisi, doku mühendisliği ve biyomühendislik uygulamaları için mikro akışkan kanalların artan faydasıyla birlikte yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntüleme kapasitesini göstermektedir. Bir çip üzerindeki endotelize seri mikro kanallar, mikrovasküler araştırmalar için potansiyel bir deneme düzeneğidir.