Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, in vivo, mikrodamarların 3D geometrisini taklit eden ve kontrollü sürekli bolluk akışı altında çalışan bir çip üzerinde çok derinlikli dairesel kesitsel endotelyal yaşamlar mikro kanalları geliştirmektir. Bu, ilk olarak, pozitif yeniden akıtılabilir foto direnç kullanılarak yarı dairesel kesitli bir mikro kanal ağına sahip bir ana kalıbın litografik olarak üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, iki poli dimetil soane mikro kanalını çoğaltmak, hizalamak ve silindirik bir mikro kanal ağı oluşturmak için bağlamak için ana kalıbı kullanmaktır.

Daha sonra, birincil insan göbek damarı endotel hücreleri, hücreleri dört gün ile iki hafta arasında bir süre boyunca kontrollü sürekli ortam perfüzyon koşulları altında kültürlemeden önce mikrokanal ağının içine oturtulur. Nihayetinde, mikrokanal ağının iç yüzeyi boyunca mikroskoplar altında duran zar ve çekirdekler ile gösterilen bir birleşme hücresi tek tabakası geliştirilir Karmaşık vasküler fenomenin incelenmesi için bir platform sağlayabilecek fonksiyonel mikro damarların hesaplanması. Bununla birlikte, anso hücre göçü testleri gibi geleneksel bireysel mikro damar testleri ve iki oluşum testi ve sağ ve mostik halka tahlilleri, üç boyutlu geometri ve sürekli akış kontrolüne göre bireysel mikro damarları yeniden oluşturmak için sınırlıdır.

Tekniklerimizin temel avantajı, mevcut mikrofabrikasyon yöntemimiz, geleneksel olarak, yuvarlatılmış kesitlere sahip in vivo mikro damarların karmaşık 3D geometrilerini taklit eden çok derinlikli bir mikroakışkan kanal ağı üretebilmesidir. Ayrıca, yaklaşık olarak daha yavaş itaat eden ve sıvı akışını istenen seviyede tutan mikrovasküler biyomanyetik sistemlerin tasarlanmasına izin verir, böylece genel kanal direnci düşüktür ve kaybettiğimiz akış ağ boyunca daha homojen hale gelir, prosedürün laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacağını gösterir. Bu prosedür, metin protokolünde detaylandırıldığı gibi çapları 30 mikron ile 60 mikron arasında olan mikro kanallardan oluşan bir fotorezist ana kalıbın imalatı ile başlar, kullanımdan 24 saat önce buzdolabından dört santigrat derecede yeniden akış foto rezistansını kısa bir süre temiz odaya aktarın ve oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.

Metin protokolündeki prosedürü izleyerek pozitif yeniden akış foto direnç katmanını önceden temizlenmiş bir silikon alt tabaka üzerine sıkarak başlayın. Ardından, desenli mikro kanalları geliştirmeden önce fotorezisti desenli bir maske aracılığıyla UV ışığına maruz bırakın. Son olarak, yeniden akıştan sonra, yarı dairesel kesitli bir mikro kanal ağı oluşturun.

Ana kalıp hazır olduğunda, kürleme maddesine 10 ila bir baz ağırlık oranında polimetil soane veya PDMS çözeltisi hazırlayın ve bir planet santrifüj karıştırıcı kullanarak iyice karıştırın. PDMS çözeltisini yeniden akıtılmış foto direnç ana kalıbına dökün. Dökülen PDMS'yi Gazı Gidermek için 15 dakika kurutun.

Gerekirse kalan kabarcıkları çıkarmak için nitrojen gazı kullanın. PDMS'yi kürlenmesini sağlamak için 60 santigrat derece sıcaklıktaki bir fırında üç saat pişirin. Ardından kürlenmiş PDMS katmanını ana kalıptan çıkarın.

Kanal ağında delikler açarak giriş ve çıkış delikleri oluşturmak için keskinleştirilmiş bir zımba kullanın. PDMS'nin yüzeyini nitrojen gazı kullanarak temizleyin. İki PDMS katmanını, 45 mil çalışma basıncında ve dakikada 3,5 fit küp oksijen akış hızında bir plazma temizleyici içinde 30 saniye boyunca oksijen plazması ile tedavi edin.

Ardından PDMS'nin yüzeylerini optik mikroskop altında manuel olarak hizalayın. Hizalamayı daha iyi kontrol etmek için gerekirse bir damla su kullanın. Son olarak, kalıcı yapıştırma kültürü elde etmek için cihazı 60 derecelik bir fırında 30 dakika pişirin.

Primer insan göbek damarı endotel hücreleri veya %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş L-glutamin içeren kültür ortamında VE. Cihazı, 45 milit çalışma basıncı ve dakikada 3,5 fit küp oksijen akış hızı ile beş dakika boyunca oksijen plazması ile tedavi edin. Daha sonra cihazı deiyonize su ile doldurun ve sterilizasyon için laminer bir biyogüvenlik başlığında sekiz saat boyunca UV ışığı ile muamele edin.

Hücreler hazır olmadan bir gün önce, cihazı bir x fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve ardından fibronektin ile kaplayın. Gece boyunca buzdolabında dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreler birleştikten sonra, önce hücreleri yığın tamponlu tuzlu su çözeltisi ile durulayarak ve ardından tripsin ilavesini takiben hücreleri tripsin EDTA ile muamele ederek hasat edin.

Hücreleri 37 santigrat derecede iki ila altı dakika inkübe edin. Tripsin tamamlandıktan sonra, tripsin EDTA'yı tripsin nötralize edici solüsyon ile nötralize edin. Hücreleri sayın, ardından resüsten önce santrifüjleyin.

% 8 dekstrin ile kültür ortamında süspanse etme dekstrin, FI enc ENC kaplamasını takiben daha iyi hücre oturmasına ve bağlanmasına yardımcı olmak için orta viskoziteyi artırmak için kullanılır. Cihazı bir XPBS ile yıkayın, ardından 37 santigrat derece sıcaklıkta 15 dakika inkübe etmeden önce cihazı kültür ortamı ile yükleyin. Daha sonra% 8 Dekstrin kültür ortamındaki hücreler, mililitre başına üç ila 4 milyon hücre konsantrasyonunda cihaza yüklenir.

Cihazın bir girişine 20 mikrolitrelik bir hücre damlası yerleştirin ve hücreleri mikroakışkan kanala sokmak için eğin. 15 ila 20 dakika sonra, hücreler kanalların yan duvarlarına yapışmaya başlayacaktır. Daha düzgün bir hücre dağılımı oluşturmak için cihazı her 15 dakikada bir döndürün.

Gerekirse, ek yükleme yapılabilir. Beş ila altı saatlik statik kültürden sonra, bağlı hücreler tamamen yayılmaya başlayacaktır. Saatte 10 mikrolitrelik sabit bir akışa sahip uzaktan kumandalı bir şırınga pompa sistemi kullanarak uzun süreli perfüzyon ayarlayın, perfüzyon daha yüksek bir akış hızı için ayarlanabilir ve dört gün ile iki hafta arasında bir süre sürebilir.

Hücreler cihazın içinde birleştiğinde, ortamı iyice çıkarmak için önce cihazı bir XPBS ile yıkayın. Ardından, cihazın karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmesinin ardından cihazı seyreltilmiş kırmızı boya ile yükleyin. Lekelenmeyi durdurmak için kültür ortamı ile yıkayın.

Boyanın uzun süre inkübasyonu, hücresel toksisiteye ve yapışma bozukluğuna neden olabilir. Ardından, cihazı bir XPBS ile seyreltilmiş mavi boya ile yükleyin, cihazı bir XPBS ile iyice yıkamadan önce karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Hücre lekelenmesini ters çevrilmiş bir optik mikroskop altında inceleyin.

Lekelenme iyiyse, mikro kanalları sabitleme ortamı ile yükleyin, ardından cihazı sabitleme ortamına batırın ve tamamen alüminyum folyo ile kaplayın. Cihazın kurumasını ve ağartılmasını önlemek için cihazı buzdolabında dört santigrat derece sıcaklıkta saklayın, sabit cihaz artık lazer taramalı konfokal mikroskop, taramalı elektron mikroskobu ve optik mikroskopi ile yapılabilen konfokal görüntüleme için hazırdır. Yeniden akış ilerlemesinden önce ve sonra yeniden akış fotorezistini ve çoğaltılmış PDMS kanalını karakterize etmek için kullanıldı.

PDMS Mikrokanal ağının geometrik özellikleri burada karakterize edildi ve gösterildi. PDMS kalıplarının dairesel kesitleri, her dallanma seviyesinde kanal boyutlarını gösterir. Sonuçlar, fotorezist yeniden akış tekniğinin, fotorezist yeniden akış teknikleriyle daha uygun bir yaklaşımla çok derinlikli dallanma kanal ağları oluşturabildiğini ve burada gösterilen Murray yasasına yaklaşık olarak uyan mikrovasküler biyomimetik sistemlerin tasarlanmasına izin verdiğini, kırmızı renkte floresan hücre zarı boyası ve mavi hücre nükleer boyası kullanan mikroskopi görüntüleridir.

Dairesel kesit görünümleri, VE'nin farklı dallanma bölgelerinde silindirik bir mikrokanal ağının iç yüzeyini kapladığını ortaya çıkardı. İn vivo mikro damar sisteminin karmaşık geometrileri nedeniyle, bu küçük damarların gerçek zamanlı izlenmesi zordur. Geliştirilen P DM S tabanlı çip, iyi optik özellikler sunar ve dairesel kanal ağı boyunca hücre astarının bu konfokal filminde gösterildiği gibi endotelyal mikro kanalların yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntülenmesine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, bu kütle modu için yeniden akışın nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Dairesel kesitli PDMS mikro kanal ağı oluşturun, endo hücre hücrelerini cihazlara yükleyin ve uzun vadeli medya bolluğu ayarlayın. Özetle, bir çip üzerinde geliştirilen endo serileştirilmiş mikro kanallar, InVivo mikro damarların geometrisini taklit eden dairesel kesitli çok derinlikli mikro kanal ağları oluşturmak için hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar.

Bu prosedür, uzun süreli sürekli perfüzyon kontrolüne sahip bir mikrovasküler model oluşturmak için gelişmiş mikro üretim ve mikro gıda teknolojilerindeki benzersiz yeteneklerin yanı sıra hücre biyolojisi, doku mühendisliği ve biyomühendislik uygulamaları için mikro gıda kanallarının artan faydası ile yüksek kalite ve gerçek zamanlı görüntüleme yeteneğinin kullanımını göstermektedir. Bir çip üzerindeki endo serileştirilmiş mikro kanallar, mikrovasküler araştırmalar için potansiyel bir denemedir.