Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Bu prosedürün genel amacı, çok hücreli bir agrega veya sferoidde perfüze edilebilir bir vasküler ağ oluşturmak için mikroakışkan bir platform kullanmaktır. Bu yöntem, in vivo ve in vitro doku modelleri gibi bir vasküler ağın nasıl önemli olduğu gibi rejeneratif tıp alanlarının alternatif şeklindeki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ilaç ve takviye uygulama yolunun, ilgilenilen bölgelerin doğrudan sferoidlere verilmesi yoluyla in vitro olarak simüle edilebilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, hücreleri mikroakışkan cihazdaki hedef bölgeye sokmanın zorluğu nedeniyle mücadele edeceklerdir. PDMS prepolimerini döktükten sonra, malzemeyi iki saat boyunca bir vakum odasında gazdan arındırın, ardından hava bacalı bir fırında 80 santigrat derecede gece boyunca kürleyin. Ertesi sabah, PDMS'yi silikon gofretten soyun ve malzemede belirtilen konumlarda delikler oluşturmak için iki milimetre çapında bir delgeç kullanın.

Küresel kuyuyu oluşturmak için bir milimetre çapında bir zımba kullanın ve PDMS levhasını temizlemek için yapışkan bant ve 24 x 24 milimetre cam kapak kızağı kullanın. Temiz levhaya 40 saniye boyunca hava plazması uygulayın ve PDMS levhasını kapak kızağına yapıştırın. Ardından, PDMS'yi en az 12 saat boyunca 80 santigrat derecede sertleştirin.

Mikroakışkan cihazı tohumlamadan iki ila üç gün önce, 10 milimetrelik bir tabakta 10 mililitre taze endotel ortamına beşinci taze çözülmüş hLF, RFP-HUVEC ve GFP-HUVEC'lere üç kez 10 ekleyin. hLF'ler ve RFP-HUVEC'ler alt birleşmeye ulaştığında, hLF'leri ve RFP-HUVEC'leri endotel ortamında sırasıyla milimetre başına 1.0 kez 10 ila beşinci ve 2.5 kez 10 ila dördüncü hücrelerde nihai konsantrasyonlara kadar askıya alın. Süspansiyon kültüründe iki gün geçirdikten sonra, bir biyogüvenlik kabininde, buz üzerinde 35 milimetrelik bir Petri kabının ortasına 99 mikrolitrelik bir damla taze hazırlanmış ana karışım çözeltisi ekleyin.

Mikroakışkan cihazı yüklemek için, bir küresel ve 100 mikrolitre ortamı oda sıcaklığında ikinci bir Petri kabına aktarmak için modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanın. Ardından, sferoidi minimum miktarda ortamda aspire edin ve pipeti dik olarak çevirin, böylece sferoid yerçekimi ile pipet ucunun altına doğru hareket eder. Pipet pistonuna bastırmadan sferoidi çözeltiye çıkarmak için pipet ucunu ana karışım damlacığının menisküsüne dokundurun.

Daha sonra, damlacığa hızlı bir şekilde bir mikrolitre taze hazırlanmış trombin ekleyin ve trombini yavaşça çözeltiye karıştırın. Pipet yedi mikrolitreye ayarlandığında, sferoidi yavaşça PDMS levhasının küresel kuyusuna aktarın. Prosedürün en kritik adımı, sferoidin cihazın altına yerleşmesine izin verecek kadar jel enjekte etmektir.

Yüklemeden sonra, mikro direkler arasında sızıntıyı önlemek için pipet ucunu nazikçe çıkarın. Sferoidi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Fibrin katılaştığında, sırasıyla bir ve üç kanalı yüklemek için 20 ila 30 mikrolitre endotel ortamını bir A ve üç A deliklerine yavaşça enjekte edin.

Ardından, cihazı 100 milimetrelik bir tabakta ıslak bir laboratuvar mendiline aktarın ve ortam ile fibrin arasındaki arayüzdeki kabarcıkların çıkarılmasını kolaylaştırmak için cihazı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ertesi gün, alt birleşen GFP-HUVEC'lere iki mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler tamamen ayrıldığında tripsin reaksiyonunu dört mililitre tam ortamla durdurun. Endotel hücrelerini santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze endotel ortamında mililitre konsantrasyonu başına beş kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin.

Daha sonra, birinci kanalı yüklemek için 20 mikrolitre HUVEC'i birinci B deliğine enjekte edin ve cihazı 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin, HUVEC'lerin ikinci kanaldaki fibrine yapışmasını sağlamak için 90 derecelik bir açıyla eğilin. Üçüncü kanalı da aynı şekilde yükledikten sonra, cihazı nemli bir laboratuvar mendili içeren yeni bir 100 milimetrelik kaba yerleştirin ve hücre kültürü inkübatöründe yedi ila 14 gün boyunca ortamın yarısını günlük olarak birinci ve üçüncü kanallarda değiştirin. HUVEC yüklemesinin sıfırıncı gününde çekilen bu temsili görüntüler, fibrin jelin yalnızca ikinci kanala yüklendiğini, birinci veya üçüncü kanallara herhangi bir sızıntı olmadığını ve HUVEC'lerin fibrin jelin yan duvarına başarılı bir şekilde bağlandığını göstermektedir.

Kürenin cihazın altına düzgün bir şekilde yerleştiği de gözlemlenebilir. Anjiyojenik filizler birinci günden itibaren gözlemlenir, bu deneyde en uzun filiz üçüncü günde sferoide ulaşır ve anjiyojenik filizlerin çoğu yedinci günde sferoide ulaşır. Optimal olarak, cihazda dört gün geçirdikten sonra, vasküler ucun yönü ve vasküler kökten sferoidin merkezi olarak tanımlanan vasküler açı ile vasküler lümenlerden akış gözlemlenebilir.

Vasküler açılar zamana bağlı olarak azalır ve anjiyojenik filizlerin sferoide doğru göçünü gösterir. RFP ve GFP-HUVEC'ler koordineli olarak tek bir vasküler lümen oluşturabilir, bu da anjiyojenik filizlerin birinci ve üçüncü kanallardan sferoiddeki RFP-HUVEC'lere nasıl sürekli bir vasküler ağ oluşturduğunu açıkça gösterir. Ayrıca, birinci kanala enjekte edilen FITC-dekstran, inşa edilmiş vasküler ağa ve sferoidin iç kısmına akar ve sonunda üçüncü kanala ulaşır, bu da entegre vasküler ağın sferoide besin sağlayabileceğini ve atık ürünleri sferoidden uzaklaştırabileceğini ima eder.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, organik elektrik alanındaki araştırmacıların, in vitro doku modellerinde ilgilenilen ilaçların veya takviyelerin etkinliğini keşfetmelerinin yolunu açtı.