Name: Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Keşfedin, mikroakışkan platform kullanarak çok hücreli kürelerde perfüzyon yapılabilir vasküler ağ oluşturmayı. Bu yöntem ilaç teslimatını in vitro simüle ederek rejeneratif tıp araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser CREST JST (grant sayı JPMJCR14W4), toplum için promosyon, bilim (JSP'ler) KAKENHI (grant sayı 25600060, 16 K 16386), MEXT ve JST, proje anahtar değerlendirme teknoloji geliştirme odaklı yenilik Program Merkezi tarafından desteklenmiştir Tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED, Mizuho temel bilimler tanıtımı için Japonya Ajansı. Microfabrication Kyoto Üniversitesi Nano teknoloji Hub tarafından desteklenmiştir.

1. mikrosıvısal aygıt kalıp imalatı
<ol><li>Piyasada bulunan yazılım kullanarak mikrosıvısal aygıt desen tasarım (Clewin5 veya AutoCAD 2016, vs.). Clewin5 işlevi için (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual) kullanım kılavuzuna başvurun. Not: Tasarım dosyası ek dosya 1' de kullanılabilir.</li>
	<li>Bir mikro desen jeneratör için tasarım dosya transferi ve olumlu fotorezist ile kaplı bir krom maske aracı yükleyin.</li>
	<li>Bir mikro Desen Oluşturucu'yu kullanmamanızı desen alanında pozitif fotorezist maruz.</li>
	<li>Geliştirici (Tablo reçetesi) kullanarak pozitif fotorezist geliştirmek ve maskeyi deiyonize (DI) su ile durulayın.</li>
	<li>Krom etchant (Malzeme tablo) kullanarak, nerede olumlu fotorezist kaldırıldı açık alan içinde krom etch. Maskeyi DI su ile durulayın.</li>
	<li>Fotorezist aseton kullanarak maske üzerinde kalan kaldırın. Not: Saydamlık maskesi Cr maskesi için bir alternatif olabilir.</li>
	<li>Temiz silikon gofret hazırlamak (4 inç, P(100)) ve spin kat hexamethyldisilazane (HMDS) 3000 devirde 30 s.</li>
	<li>120 ° C ve serin gofret oda sıcaklığında 5 min için 5 min için Softbake HMDS.</li>
	<li>Spincoat negatif fotorezist (tablo malzemelerin) 10 s 500 devir/dakika ve 30 için 1200 devir/dakika, s. Not: Spin kaplama koşulu fotorezist katmanları gofret üzerinde yaklaşık 100 µm kalınlığında fotolitografi sonra verim.</li>
	<li>95 ° C'de 45 dk için negatif fotorezist ppost ve gofret için oda sıcaklığında 60 dk serin.</li>
	<li>Her denemede UV ışık yoğunluğunu kontrol edin ve toplam pozlama enerji dozu 250 mW/cm2çekim hızı hesaplamak. Photomask (Adım 1.1-1.6) üzerinde gofret yerleştirin ve UV ışığına karşılaşmazlar.</li>
	<li>1 dk. 65 ° c ve 95 ° C'de 5 min için negatif fotorezist postbake Oda sıcaklığında 1 dakika soğumasını gofret ver.</li>
	<li>Negatif fotorezist katmanı 15dk ilk geliştirici (Tablo reçetesi) banyoda ve ikinci banyoda 2 min için geliştirmek. 10 için ilk isopropanol (IPA) banyoda gofret durulama s ve 10 ikinci IPA banyoda s.</li>
	<li>Hardbake negatif fotorezist 200 ° C ve serin gofret için oda sıcaklığında 5 dk, 30 dk için.</li>
	<li>Bir yüzey profiler kullanarak negatif fotorezist katman kalınlığını ölçmek.</li>
	<li>Bir vakum pompası bağlı bir desiccator gofret yerleştirin ve silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)., 200 µL ekleyin 10 dk için pompa açmak sonra kapatmak ve gofret 4 h için desiccator unutmayın.</li>
</ol>2. üretim adımları ve PDMS katmanları montajı
<ol><li>Polydimethylsiloxane (PDMS) ön polimer döküm (PDMS Bankası: Ajan kür 10:1 (w/w) =) ve 2 h için bir vakum odasında degas.</li>
	<li>Bir hava Bacalı fırın gecede 80° C'de PDMS kesin çözüm.</li>
	<li>Silikon gofret üzerinden PDMS akasındaki.</li>
	<li>Delik 1A - 3B yumruk (şekil 1) ve küresel kültür iyi. 3B ve 1 mm çapında küresel için de yumruk - 2 mm çapında yumruk delikleri 1A için kullanın.</li>
	<li>PDMS levha ve cam kapak kayma (24 mm × 24 mm) yapışkan bant ile tekrar tekrar yapışmasını ve bandı peeling temizleyin. Hava plazma 40 ile PDMS levha tedavi s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>PDMS levha üzerine herhangi bir hava kabarcıkları PDMS levha ve kapak astarlı ve tedavi için en az 12 h 80 ° c arasında yüzeyinden çıkarmak için cam kapak Not bağ.</li>
</ol>3. küresel hazırlık
Not: kırmızı floresan protein insan göbek ifade çalışmada, damar endotel hücreleri (RFP-HUVECs) ve yeşil flüoresan protein ifade HUVECs (GFP-HUVECs) küresel ve mikro, sırasıyla, kökeni ayırt etmek için kullanılır HUVECs sonra perfusable vasküler ağ. HUVECs kökeni gerekmiyorsa, etiketlenmemiş HUVECs deney için yeterlidir.
<ol><li>RFP-HUVECs (3.0 × 105 hücreleri/flakon) ve insan akciğer fibroblast (hLF) (1,0 × 106 hücreler/flakon) çözülme ve endotel hücreleri ve fibroblast hücreleri, orta 10 mL içine sırasıyla ekleyin (Malzemeler tablo). Onları CO2 37 ° C ve %5 100-mm tabak içinde 2-3 gün boyunca alt Konfluent RFP-HUVECs ve hLFs için kültür. Bu hazırlık ~ 200 pulcuklarının ortaya çıkarır.</li>
	<li>RFP-HUVECs ve hLFs yemeklerin 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.</li>
	<li>Santrifüjü vasıl 220 x g 3 dk sonra süpernatant kaldırmak ve RFP-HUVECs ve hLFs sırasıyla son hücre konsantrasyonları 2.5 × 104 ve 1,0 × 105 hücre/mL, endotel orta resuspend.</li>
	<li>Yavaşça iyi başına hücre süspansiyon (RFP HUVECs için 5000 hücreleri) ve hLFs için 20.000 hücreleri 200 µL Ultra düşük bağlama yüzeyli bir 96-şey plaka ekleyin.</li>
	<li>96-şey plaka CO2 37 ° C ve %5 2-4 günlük bir süre için kuluçkaya. Not: Kültür süresi ve ilk cep numarasını 96-şey plaka üzerinde küresel çapı bağlı olduğundan, bu iki parametre tarafından denetlenebilir.</li>
</ol>4. hücre mikrosıvısal cihazda tohumlama
Not: Delikleri, kanalları ve küresel için adlandırma kuralı de gösterdi şekil 1' de. Biz gün 0 zaman mikrosıvısal cihazın içine hücre hasat bitmiş gün tanımlar. Deneysel zaman çizelgeleri şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.
<ol><li>Gün – 1) küresel yükleme Not: Aşağıdaki adımı buza jelleşme kollajen ve fibrin önlemek için yapılmalıdır.<ol>
<li>Fibrinojen fosfat tamponlu tuz (PBS) 2.80 mg/mL nihai bir konsantrasyon için geçiyoruz.</li>
		<li>Etkisiz kollajen (3.0 mg/mL PBS) üreticinin protokolüne göre hazırlayın.</li>
		<li>107.2 µL fibrinojen çözüm (2.80 mg/mL), 8.0 µL etkisiz kollajen (3.0 mg/mL) ve aprotinin tepki bir tüp (5 U/mL) 3.6 µL birleştirir. Bu çözüm "ana mix çözüm" etiketli (MS). Not: Bir küresel yükleme için yeterli birimdir. Birden fazla küresel ise, her birim pulcuklarının sayısı ile çarpın.</li>
		<li>50 U/mL nihai bir konsantrasyon için PBS içinde Trombin geçiyoruz. Not: 50 U/mL Trombin (20 µL/tüp) Aliquots −30 ° C saklanır ve her deneme önce çözdürülen.</li>
		<li>Biyogüvenlik kabini içinde pulcuklarının içeren 96-şey tabak koyun.</li>
		<li>Biyogüvenlik dolap, bir tabak üzerinde buz (çanak 1) ve benchtop (dish 2) üzerinde diğer çanak içinde iki 35-mm Petri yemekler hazırlamak. Damlalıklı 99 µL of MS çanak 1 (bir damlacık oluşturmak içinşekil 3a) ortasına.</li>
		<li>İpuçları (10-100 µL) 2 sarı trim ve 3 pulcuklarının pulcuklarının cihazın içine enjekte ve medya cihazın içine enjekte MS, hassas pulcuklarının topluluğu ile Trombin karıştırma 96-şey plaka topluluğu için pipet İpuçları (1-100 µL) temizleyin , sırasıyla. İpucu gözenek boyutu biraz delik 1A - 3B Kanal 1 ve 3 çapından daha büyük olmalıdır veya küresel su kuyusu içinde Kanal 2 bir rahat için uygun. Not: Bundan sonra aksi belirtilmediği sürece, bu adımda kesmek pipet ipuçlarını kullanın. Kesme ipuçları fotoğraf şekil 4' te kullanılabilir.</li>
		<li>Bir küresel orta 100 µL ile 96-şey plaka toplayabilir ve çanak 2 (şekil 3a) ekleyebilir.</li>
		<li>Küresel medya dish 2 üzerinden en küçük birim ile almak. Pipettor dik tutarak, küresel yerçekimi tarafından damlalıklı ipucu dibe doğru hareket etmeliyiz. Küresel damlalıklı ipucu tabak 1 (şekil 3a) MS damlacık Menisküs üzerine dokunarak dışarı atmak. Not: Aşağıdaki adımları 4.1.10 & 4.1.11 hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
		<li>Trombin (50 U/mL) 1 µL ekleyin ve karışımı yavaşça sarı damlalıklı ucu ile.</li>
		<li>7 µL ayarla pipet ile küresel kadar almak ve yavaş yavaş küresel kuyuya (şekil 3b) yerleştirin.</li>
		<li>Fibrin jelleşme için 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
		<li>Yavaş yavaş delik 1A ve 3A ve dolgu Kanal 1 ve 3 endotel ortamından medya ile enjekte (20 ~ 30 µL/kanal).</li>
		<li>Aygıtın aygıt (şekil 3 c) ortamdan buharlaşma önlemek için ıslak bir Kimwipe ile 100 mm çanak yerleştirin.</li>
		<li>Aygıt için medya ve fibrin arasında arayüz kabarcıklar kaldırmak 24 h 37 ° C ve % 5 CO2 yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0 gün) HUVECs yükleme<ol>
<li>GFP-HUVECs (3.0 x 105 hücreleri/şişe) çözülme ve endotel orta 10 mL ekleyin. Onları 100-mm bulaşık 37 ° C ve % 5 CO2 alt-confluency ulaşmak 2-3 gün içinde kültür. Bir tabak alt Konfluent GFP-HUVECs 8-10 cihazların hazırlama için yeterli.</li>
		<li>GFP-HUVECs 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile yemeklerin bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.</li>
		<li>220 x g 3 dk de aralıklarla sonra GFP HUVECs 5.0 x 106 hücre/mL, endotel ortamda resuspend.</li>
		<li>HUVECs hücre süspansiyon Kanal 1 delik 1B aracılığıyla içine enjekte (20 µL/kanal).</li>
		<li>Mikrosıvısal aygıt 90 ° yatırmayı, yanına koyun ve HUVECs Kanal 2 fibrin uymasını sağlamak 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.<ol>
<li>HUVECs eki fibrin üzerinde onaylayın. Jel ve orta arasında arayüz, bağlı HUVECs sayısı yeterli olmadığı zaman damarlara vasküler kökündeki aygıt kültür (şekil 5) bir kaç gün sonra bağlantısı kesilmiş olabilir. İletişim kuralında, perfüzyon başarı oranı olduğunu > % 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4.2.4 4.2.5 kanal 3 aygıtlarından.</li>
		<li>37 ° C ve % 5 CO2 7-14 gün boyunca nemli bir Kimwipe ile 100 mm çanak kültür hücreleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gün 1 ~) ortam değişimi<ol>
<li>Kanal 1 ve 3 medyada yarısı her gün değişimi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. çekirdek boyama
<ol><li>%4 paraformaldehyde (PFA) PBS hazırlayın.</li>
	<li>Kanal 1 ve 3 medyayı çıkarın ve 20 µL % 4'lük eklemek PFA kanal başına. %4 çözümde değiştirmek için İngiltere'de yılın, tekrar çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve % 4 ekleyerek PFA üç kez.</li>
	<li>Cihazın 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>% 4 kaldırma aygıt ve yıkama PFA kanalları üç kez PBS ile.</li>
	<li>10 µg/ml floresan boyalar (Tablo reçetesi) 20 µL hücresel çekirdeği leke kanal başına ekleyin. Cihazın çözümde değişimi için çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve 10 µg/mL ekleyerek floresan boya üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>4 ° C'de 24 h için aygıt depolar.</li>
</ol>6. sıvı perfüzyon bir küresel
<ol><li>Küresel fazla 7 gün içinde belgili tanımlık aygıt 37 ° C ve % 5 CO2 sürekli bir damar yolu tamamlanması için kültür sonra hazırlayın.</li>
	<li>Orta delik 1A, 1B, 3A ve 3B kaldırın.</li>
	<li>Floresein isothiocyanate (FITC) 10 µM çözüm 10 µL tanıtmak-PBS içinde dextran delik 1A ve 1B.</li>
	<li>Lastikteki veya ters bir mikroskop altında FITC boya akışını izlemek.</li>
</ol>7. Filiz uzunluğu miktar
Not: ImageJ ver 1.49 yazılım tüm bu çalışmada görüntü analizi için kullanılır.
<ol><li>GFP-HUVECs gün 0, 1, 3, 5 ve 7 görüntülerin üst üste geliyor.</li>
	<li>Damarlara Günün İpucu'nu 0, 1, 3, 5 ve 7 gün çekilen görüntüleri aynı konumdan konumunu çıkarma.</li>
	<li>Kök konumu (şekil 6) vasküler ucundan büyüme belirlemek. Vasküler ipucu ve kök arasındaki mesafe (şekil 7b) Bu çalışmada Filiz uzunluğu olarak tanımlanmıştır.</li>
</ol>8. miktar vasküler açıların
Not: damar Açı açı oluşuyordu damar açı, kök ve küresel (Şekil 7 c) merkezi olarak tanımlanmıştır.
<ol><li>RFP-HUVECs içeren coculture küresel floresan görüntülerini binarize ve ImageJ analiz fonksiyonu tarafından "centroid" konum ölçmek. Bu çalışmada, ölçülen "centroid" konumu (şekil 6) küresel merkezi olarak tanımlanır.</li>
	<li>7. adımda aynı şekilde vasküler ipuçları ve kökleri konumunu belirleyin.</li>
	<li>ImageJ yazılımında analiz işlevini kullanarak vasküler açıları ölçmek.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+Biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: Biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+polarity+and+functional+bile+canaliculi+in+rat+hepatocyte+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids.</a> Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principle%3A+microenvironmental+influences+in+the+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast.</a> Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+for+netrins+in+regulating+epithelial+behavior+during+lung+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis.</a> Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).</li>
<li>Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+assay+on+a+silicon+chip+applicable+for+tumors+extirpated+from+mammalians%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians.</a> International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+And+Environment+Interactions+In+Tumor+Microregions+-+The+Multicell+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li>
<li>Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+technologies+for+cell-to-cell+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies.</a> Lab on a Chip. , (2017).</li>
<li>Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+approach+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).</li>
<li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt.2989">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373(2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481(2013).</li>
<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+In+Vivo+Origin+of+Metanephric+Nephron+Progenitors+Enables+Generation+of+Complex+Kidney+Structures+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAuger%2C+FA+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22">Annual Review of Biomedical Engineering</a>. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).</li>
<li>Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Approach+for+Formation+of+Vascularized+Liver+Tissue+by+Endothelial+Cell-Covered+Hepatocyte+Spheroid+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).</li>
<li>Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+assemble+into+a+3-dimensional+prevascular+network+in+a+bone+tissue+engineering+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct.</a> Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).</li>
<li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Perfused+Human+Capillary+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">In Vitro Perfused Human Capillary Networks.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li>
<li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li>
<li>Huang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microscale+cellular+niches+for+three-dimensional+multicellular+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).</li>
<li>Newman, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Stromal+Cell+Secretomes+Reveals+a+Critical+Role+for+Stromal+Cell-Derived+Hepatocyte+Growth+Factor+and+Fibronectin+in+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513(2013).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
<li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+limits+of+an+in+vitro+thick+prevascularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+Liquid+Tumors%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Leukemic-Cell-Induced+Bone+Marrow+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+developing+vasculature+and+optogenetically+engineered+skeletal+muscle+improves+muscle+contraction+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis.</a> Biomaterials. 156, 65-76 (2018).</li>
</ol>

Yazar ilan hiçbir rakip mali çıkarlarının zorundalar.

Önceki raporları hLFs angiopoietin-1, angiogenin, hepatosit büyüme faktörü, büyüme faktör-α, tümör nekrozis faktör ve bazı hücre dışı matriks proteinleri29dönüşüm gibi birden çok anjiogenik faktörlerin bir kokteyl salgılar göstermek, 30. Bu tahlil anjiogenik salgı ilgili kısıtlama tekniği, coculture küresel hLFs üzerinden kullanır. Bu nedenle, coculture küresel ve Kanal 1 ve 3 HUVECs arasındaki mesafe kısaltılmış bir kuyunun dibinde bir coculture küresel ayarlam...

Üç boyutlu bir kültüre monolayer (iki boyutlu) kültüründen değişen motive yaşayan hücresel işlevlerini taklit kültür modelleri ile çalışması gerektiğinden dokular1,2,3. Düz ve sert plastik yüzeylerde yaygın olarak kullanılan hücre kültüründe insan vücudu hücre dışı ortamlarda çoğu benzer değil. Aslında, birçok çalışma o üç boyutlu kültür yeniden doku özgü mimari, mekanik ve biyokimyasal ipuçları ve hücre-hücre iletişim, geleneksel iki boyutlu kültür4' tegözlenen değil göstermek, 5,6,7,8.
Bir çok hücreli agrega veya küresel, bir bu üç boyutlu kültür9,10gerçekleştirmek için en umut verici teknikleri biridir. Hücreleri hücre dışı Matriks (ECM) salgılar ve diğerleri ile küresel etkileşim kurabilir. Her ne kadar bazı diğer Biyomühendislik gibi hücre istifleme,11,12,13,14, yaklaşımlar başarıyla insan vücudunun kayma karmaşıklık çoğaltmak, yalnızca iki veya üç bu yaklaşımlar var hücreler analiz kolaylığı ve hedef organlar üzerinde duruldu yalnızca bir işlev için türlü. Buna ek olarak, pulcuklarının hücrelerde besinler, oksijen ve parakrin ve küresel olarak sinyal otokrin heterojen temini nedeniyle küresel konumlarına bağlı olarak farklı kültür ortamlara maruz kalır. Bu özelliği pulcuklarının, kısmen vivo içinde kültür durumu ve olanaklı kılmak çok daha karmaşık, organize doku oluşturmak için pulcuklarının hücrelerde vitro bu yığın doku9', kültürlü yapısı taklit eder 15 , 16. bir küresel tek bir hücre oluşur, küresel hücrelerde işlevi nedeniyle küresel türdeş olmayan ortamda tek tip olmadığını unutmayın. Son birkaç yıl içinde küresel kültürler embriyonik kök hücreleri (ESCs), indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) veya doku yerleşik kök hücre içinde vivo gelişimsel dizileri taklit ve mini-organ beyin17gibi yeniden girebilir, karaciğer18ve böbrek19,20.
Küresel kültür teknikleri önemli ilerlemeye rağmen hala uzun bir süre için büyük pulcuklarının kültür problemlidir. Üç boyutlu bir doku hücreleri oksijen ve besin21sınırlı kaynağı nedeniyle bir kan damarı 150-200 µm içinde bulunduğu gerekir. Küresel içinde damar ağları arasında kan ve doku içinde vivoalışverişi maddeler özetlemek gereklidir. Bunu başarmak için diğer gruplar endotel hücreleri hedef hücre22,23,24 ile birlikte kültürlü veya pluripotent hücreler farklılaşma CD31 pozitif hücreler20içine indüklenen. Yine de, bildirilen gemi benzeri yapıları lumina oksijen ve besin küresel ortasına sağlamak için açık uçları var mı. Üç boyutlu kültür hücrelerde besleyen damar rol taklit etmek için açık uçlu ve perfusable damar ağı içinde küresel geliştirilmelidir.
Son birkaç yıl içinde bazı araştırma grupları microengineering alanındaki kendiliğinden bir mikrosıvısal cihazda anjiogenik faktörler cocultured fibroblast hücreleri25 kullanarak oluşturduğu bir perfusable vasküler ağ oluşturmak için yöntemleri bildirdi. ,26. Vasküler bu şebekeler için in vivo meslektaşlarına benzer görünümdeki ve vasküler fonksiyonlar bir küresel kültür taklit için uygundur çevresel faktörler tarafından yenilenmiş. Bu iletişim kuralının amacı bir mikrosıvısal platformu27kullanarak bir küresel perfusable vasküler ağlarda oluşturmaktır. Böylece bir küresel dahil edilebilir mikrosıvısal aygıt daha önce bildirilen aygıt25 değiştirilir. Bir küresel fibroblast hücrelerinde üzerinden anjiogenik salgı mikro endotel hücreleri yönlendirerek tarafından anjiogenik ile küresel anastomosed mikro üzerinden lahanası ve perfusable bir damar ağı kurdu. Bu yöntem, floresan molekülleri ve damar ağları ile uzun vadeli bir doku kültürü için çerçeve sağlar bir küresel iç içine mikrometre ölçekli boncuk gibi maddeleri geniş bir doğrudan teslim sağlar.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>AZP 1350 ile kaplanmış bir krom maske.</td><td>TEMİZ YÜZEY TEKNOLOJİSİ</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Mikro model üreteci</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 geliştiricisi</td><td>Rohm ve haas elektronik</td> <td>malzemeler-Protokol</td> <td>1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>Protokolde krom aşındırıcı 1.5</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Gofret</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Kaplayıcı</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Heksametildisilazan (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem-Negatif</td><td></td> <td>fotorezist protokol 1.9</td></tr><tr><td>UV Maruz Kalma</td><td>Nanometrik Teknoloji Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Geliştirici</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Protokol 1.13'te negatif fotorezist için geliştirici</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>Yüzey profilleyici</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>(Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td> <td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi Punch (1.0mm)&nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi Punch (2.0mm)&nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Sistemi</td><td>Femto Science</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>MATSUNAMI CAMI</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Kültür Yemekleri</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP İnsan Göbek Veni Endotel Hücresi</td><td>Anjiyo Proteomie</td><td>Eksprese Etme cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>Normal İnsan Akciğer Fibroblastları</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Büyüme Ortamı Kitleri</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0.05w/v% Tripsin-0.53mmol/l EDTA&boğa; Fenol</td> Kırmızı <td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlar)</td> ile 4Na Çözeltisi <td>Takara bio</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Sumitomo bakalit</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Çip</td><td>NIPPON Genetik</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul ve nbsp; Çip</td><td>NIPPON Genetik</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Çip</td><td>NIPPON Genetik</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP İnsan Göbek Veni Endotel Hücresi</td><td>Anjiyo Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından fibrinojen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Sığır akciğerinden aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından trombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Protokol 5.5'te çekirdekleri boyamak için floresan boya</td></tr><tr><td>Paraformaldehit Çözeltisi</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikroskobu</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Dijital CCD Kamera</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Lazer Taramalı Biyolojik Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikroskobu</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat-dekstran</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Bir küresel (çok hücreli agrega) insan vücudunun içinde yaşayan doku iyi bir model olarak kabul edilir. Küresel kültürler içinde önemli ilerleme rağmen pulcuklarının perfusable vasküler ağlarda korumak ve protein ifadeler ve morfogenetik gibi işlevlerini geliştirmek için gerekli uzun vadeli kültür için kritik bir meydan okuma kalır. Protokol perfusable bir damar ağı içinde küresel bir mikrosıvısal cihazın entegre etmek için yeni bir yöntem sunuyor. Küresel perfusable vasküler ağlarda ikna etmek için mikro için bağlı anjiogenik lahanası için küresel anjiogenik faktörler küresel kültürlü insan akciğer fibroblastlar üzerinden kullanarak destekli. Anjiogenik lahanası küresel işbirliği kültürlü endotel hücreleri ile birleştirilmiş küresel ulaştı ve sürekli bir damar ağı kurdu. Vasküler ağ olmadan herhangi bir küresel iç sıvı. İnşa vasküler ağ daha fazla besin temini ve atık ürünlerin, kan dolaşımını içinde vivotaklit kaldırılması için bir yol olarak kullanılabilir. Yöntemi küresel kültür yaşam dokuların daha iyi Rekapitülasyon doğru yeni bir platform sağlar.

Şekil 1 bir tasarım ve fotoğraf mikrosıvısal cihazın gösterir. Hangi kanalda 2 küresel de içeren üç paralel kanal içerir. Kanal 1 ve 3 HUVEC kültürü için kullanılan ve 2 için küresel kanalıdır. Her kanal trapez microposts desen PDMS tasarlanmış ayrılır. Microposts Kanal 2 hidrojel yüzey gerilimi tarafından kanallarına 1 ve 3 sızıntı önlemek ve mikro28arasında küresel ve HUVECs maddelerin değişimi sağlar.
<p class="jove_content" fo:...

Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Bu prosedürün genel amacı, çok hücreli bir agrega veya sferoidde perfüze edilebilir bir vasküler ağ oluşturmak için mikroakışkan bir platform kullanmaktır. Bu yöntem, in vivo ve in vitro doku modelleri gibi bir vasküler ağın nasıl önemli olduğu gibi rejeneratif tıp alanlarının alternatif şeklindeki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ilaç ve takviye uygulama yolunun, ilgilenilen bölgelerin doğrudan sferoidlere verilmesi yoluyla in vitro olarak simüle edilebilmesidir.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, hücreleri mikroakışkan cihazdaki hedef bölgeye sokmanın zorluğu nedeniyle mücadele edeceklerdir. PDMS prepolimerini döktükten sonra, malzemeyi iki saat boyunca bir vakum odasında gazdan arındırın, ardından hava bacalı bir fırında 80 santigrat derecede gece boyunca kürleyin. Ertesi sabah, PDMS'yi silikon gofretten soyun ve malzemede belirtilen konumlarda delikler oluşturmak için iki milimetre çapında bir delgeç kullanın.Küresel kuyuyu oluşturmak için bir milimetre çapında bir zımba kullanın ve PDMS levhasını temizlemek için yapışkan bant ve 24 x 24 milimetre cam kapak kızağı kullanın. Temiz levhaya 40 saniye boyunca hava plazması uygulayın ve PDMS levhasını kapak kızağına yapıştırın. Ardından, PDMS'yi en az 12 saat boyunca 80 santigrat derecede sertleştirin.Mikroakışkan cihazı tohumlamadan iki ila üç gün önce, 10 milimetrelik bir tabakta 10 mililitre taze endotel ortamına beşinci taze çözülmüş hLF, RFP-HUVEC ve GFP-HUVEC'lere üç kez 10 ekleyin. hLF'ler ve RFP-HUVEC'ler alt birleşmeye ulaştığında, hLF'leri ve RFP-HUVEC'leri endotel ortamında sırasıyla milimetre başına 1.0 kez 10 ila beşinci ve 2.5 kez 10 ila dördüncü hücrelerde nihai konsantrasyonlara kadar askıya alın. Süspansiyon kültüründe iki gün geçirdikten sonra, bir biyogüvenlik kabininde, buz üzerinde 35 milimetrelik bir Petri kabının ortasına 99 mikrolitrelik bir damla taze hazırlanmış ana karışım çözeltisi ekleyin.Mikroakışkan cihazı yüklemek için, bir küresel ve 100 mikrolitre ortamı oda sıcaklığında ikinci bir Petri kabına aktarmak için modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanın. Ardından, sferoidi minimum miktarda ortamda aspire edin ve pipeti dik olarak çevirin, böylece sferoid yerçekimi ile pipet ucunun altına doğru hareket eder. Pipet pistonuna bastırmadan sferoidi çözeltiye çıkarmak için pipet ucunu ana karışım damlacığının menisküsüne dokundurun.Daha sonra, damlacığa hızlı bir şekilde bir mikrolitre taze hazırlanmış trombin ekleyin ve trombini yavaşça çözeltiye karıştırın. Pipet yedi mikrolitreye ayarlandığında, sferoidi yavaşça PDMS levhasının küresel kuyusuna aktarın. Prosedürün en kritik adımı, sferoidin cihazın altına yerleşmesine izin verecek kadar jel enjekte etmektir.Yüklemeden sonra, mikro direkler arasında sızıntıyı önlemek için pipet ucunu nazikçe çıkarın. Sferoidi 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Fibrin katılaştığında, sırasıyla bir ve üç kanalı yüklemek için 20 ila 30 mikrolitre endotel ortamını bir A ve üç A deliklerine yavaşça enjekte edin.Ardından, cihazı 100 milimetrelik bir tabakta ıslak bir laboratuvar mendiline aktarın ve ortam ile fibrin arasındaki arayüzdeki kabarcıkların çıkarılmasını kolaylaştırmak için cihazı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ertesi gün, alt birleşen GFP-HUVEC'lere iki mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler tamamen ayrıldığında tripsin reaksiyonunu dört mililitre tam ortamla durdurun. Endotel hücrelerini santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze endotel ortamında mililitre konsantrasyonu başına beş kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin.Daha sonra, birinci kanalı yüklemek için 20 mikrolitre HUVEC'i birinci B deliğine enjekte edin ve cihazı 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin, HUVEC'lerin ikinci kanaldaki fibrine yapışmasını sağlamak için 90 derecelik bir açıyla eğilin. Üçüncü kanalı da aynı şekilde yükledikten sonra, cihazı nemli bir laboratuvar mendili içeren yeni bir 100 milimetrelik kaba yerleştirin ve hücre kültürü inkübatöründe yedi ila 14 gün boyunca ortamın yarısını günlük olarak birinci ve üçüncü kanallarda değiştirin. HUVEC yüklemesinin sıfırıncı gününde çekilen bu temsili görüntüler, fibrin jelin yalnızca ikinci kanala yüklendiğini, birinci veya üçüncü kanallara herhangi bir sızıntı olmadığını ve HUVEC'lerin fibrin jelin yan duvarına başarılı bir şekilde bağlandığını göstermektedir.Kürenin cihazın altına düzgün bir şekilde yerleştiği de gözlemlenebilir. Anjiyojenik filizler birinci günden itibaren gözlemlenir, bu deneyde en uzun filiz üçüncü günde sferoide ulaşır ve anjiyojenik filizlerin çoğu yedinci günde sferoide ulaşır. Optimal olarak, cihazda dört gün geçirdikten sonra, vasküler ucun yönü ve vasküler kökten sferoidin merkezi olarak tanımlanan vasküler açı ile vasküler lümenlerden akış gözlemlenebilir.Vasküler açılar zamana bağlı olarak azalır ve anjiyojenik filizlerin sferoide doğru göçünü gösterir. RFP ve GFP-HUVEC'ler koordineli olarak tek bir vasküler lümen oluşturabilir, bu da anjiyojenik filizlerin birinci ve üçüncü kanallardan sferoiddeki RFP-HUVEC'lere nasıl sürekli bir vasküler ağ oluşturduğunu açıkça gösterir. Ayrıca, birinci kanala enjekte edilen FITC-dekstran, inşa edilmiş vasküler ağa ve sferoidin iç kısmına akar ve sonunda üçüncü kanala ulaşır, bu da entegre vasküler ağın sferoide besin sağlayabileceğini ve atık ürünleri sferoidden uzaklaştırabileceğini ima eder.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, organik elektrik alanındaki araştırmacıların, in vitro doku modellerinde ilgilenilen ilaçların veya takviyelerin etkinliğini keşfetmelerinin yolunu açtı.

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Bu el yazması endotele fizyolojik özelliklerini recapitulate mikrodamarlar mühendisi bir enjeksiyon kalıplama yöntemi sunar. Mikroakışkan tabanlı süreç böyle akışı, hücresel kompozisyon, geometri ve biyokimyasal geçişlerini olarak Uyarlanabilen koşullar, patent 3D damar ağları oluşturur. üretim süreci ve potansiyel uygulama örnekleri açıklanmıştır.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Bu protokol, poli(etilen glikol) diakrilat (PEGDA) hidrojellere gömülü vasküler türetilmiş, biyomimetik mikroakışkan ağları üretmek için görüntü kılavuzlu, lazer tabanlı hidrojel bozunmasının uygulanmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu biyomimetik mikroakışkan sistemler, doku mühendisliği uygulamaları, in vitro hastalık modellerinin oluşturulması ve gelişmiş "çip üzerinde" cihazların üretilmesi için yararlı olabilir.

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF' ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Bu protokol, yükleme, bakım ve değerlendirme prosedürlerinin bir açıklamasıyla birlikte yüksek verimli temel ve translasyonel insan kanseri araştırmaları, gelişmiş ilaç taraması, hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları gerçekleştirmek için fizyolojik olarak ilgili bir çip üzerinde tümör modeli sunar.

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Plaka üzerinde damar (VOP) olarak adlandırılan 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak standart altı oyuklu bir plaka üzerinde esnek boyutlara ve istenen desenlere sahip vasküler kanalların yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz. Bu platform, riskli endotel ile ilişkili bozukluklar için terapötiklerin geliştirilmesini ilerletme potansiyeline sahiptir.

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

Burada, pnömonektomiyi taklit etmek için tasarlanmış bir çip üzerinde organ (OOC) sistemi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, glikokaliks bozukluğu ile pnömonektomi sonrası komplikasyonlar arasındaki potansiyel ilişkiyi araştırır.

Pnömonektomi Sonrası Endotelyal Glikokaliksin 3D Akışkan Çipte Modellenmesi - Vasküler Tabanlı Çip Üzerinde Organ Sistemi Üretmeye Yönelik Bir Yaklaşım

Keşfedin, mikroakışkan platform kullanarak çok hücreli kürelerde perfüzyon yapılabilir vasküler ağ oluşturmayı. Bu yöntem ilaç teslimatını in vitro simüle ederek rejeneratif tıp araştırmalarına katkı sağlar.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Daha fazla video keşfet