Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, bir serebellar granül nöron kültüründe hücre canlılığını doğru bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, sinirbilim ve nörofarmakoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, istenmeyen glial hücreleri MISTA hücre kültürlerindeki nöronlardan ayırt edebilmemizdir.

Prosedürleri göstermek için Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, laboratuvarımdan üç lisans öğrencisi olacak. Sekiz günlük sıçan yavrularının kafalarını incelemeye başlayın, önce foramen magnumuna makas sokarak ve kafatasının iki tarafını kulaklardan gözlere kadar keserek. Ardından, kafatasını kaldırmak için forseps kullanın.

Beyincikleri izole etmek için forseps kullanın ve diseksiyon solüsyonu içeren 35 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Plakayı diseksiyon mikroskobu aşamasına aktarın ve meninksleri ve kan damarlarını çıkarmak için iki çift forseps kullanın. Dokuları kesmek için bir bıçak kullanın ve ardından dokuyu 30 mililitre diseksiyon solüsyonu içeren bir santrifüj tüpüne aktarın.

Oda sıcaklığında 1.500 x g'da beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemenin ardından, süpernatanı aspire edin ve peleti kurtarın. Ardından, pelete Tripsin çözeltisi ekleyin ve hafifçe çalkalayarak yeniden askıya alın.

Ardından tüpü 15 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. 15 dakika sonra DNase One, soya fasulyesi Tripsin inhibitörü ve magnezyum sülfat çözeltisi ekleyin ve çalkalayın. Daha sonra oda sıcaklığında 1.500 x g'da beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti daha az seyreltik bir DNase One, soya fasulyesi Tripsin inhibitörü ve magnezyum sülfat çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Ardından, iki adet 15 mililitrelik tüp hazırlayın. Hücrelerin yarısını her bir tüpe yerleştirin ve hücreleri homojenize etmek için pamuk tıkalı bir Pasteur pipeti kullanarak 60 ila 70 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Homojenizasyondan sonra, her 15 mililitrelik tüpe üç mililitre magnezyum sülfat ve kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin. Tüplerin oda sıcaklığında 10 dakika bekletilmesine izin verin. Süre geçtikten sonra, süpernatanı pamuk tıkalı bir Pasteur pipeti ile dikkatlice çıkarın ve yeni 15 mililitrelik tüplere aktarın.

Oda sıcaklığında beş dakika ve 1.500 x g santrifüjleyin. Mililitre başına altıncı hücre başına yaklaşık 1.5 x 10 hücre yoğunluğuna seyreltmek için pelete kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 6 oyuklu bir plakaya pipetleyin ve inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin.

24 saat sonra, plakaları inkübatöre geri göndermeden önce glial hücrelerin büyümesini engellemek için bir milimolar nihai konsantrasyona AraC stok çözeltisini ekleyin. Daha sonra, yedinci günde, bir milimolar nihai konsantrasyona kadar D-glikoz stok çözeltisine 50 mikrolitre ekleyin. Floresein diasetatı mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ve propidyum iyodürü mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ve 10 mililitre PBS'ye karıştırarak boyamaya başlayın.

FDA / PI çözeltisini girdaplayarak karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin. Kültür plakasını buzun üzerine yerleştirin. Pipet ucuyla hücrelere dokunmadan kültür ortamını dikkatlice aspire edin, ardından yavaşça soğuk PBS ekleyin.

PBS'yi aspire edin, ardından soğuk FDA / PI veya FDA / PI Hoechst çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Daha sonra, FDA / PI veya FDA / PI / Hoechst çalışma solüsyonunu aspire ettikten sonra, her bir oyuğa soğuk PBS ekleyin.

Floresan mikroskobun doğru şekilde kurulduğundan emin olun. FDA, PI ve Hoechst için floresan emisyonlarını sırasıyla 520, 620 ve 460 nanometrelerde, 100 ila 300 milisaniye arasında bir maruz kalma süresi ve 2.8 x'lik bir analog kazanç kullanarak tespit edin. Floresan görüntüleri topladıktan sonra, faz kontrast modunu kullanarak normal ışık altında bir görüntü çekin.

FDA / PI çift boyama için, grafik düzenleme yazılımında FDA pozitif katmanını PI pozitif katmanın üzerine sürükleyerek hücrelerin görüntülerini kaplayın. Katmanlar panelinin Opaklık alanına %50 girerek FDA pozitif katmanının opaklığını ayarlayın. Katman menüsünü açıp Görüneni Birleştir düğmesine tıklayarak iki katmanı birleştirin.

Görüntü, Ayarlamalar, Parlaklık/Kontrast altındaki Kontrast alanına 50 girerek bindirme görüntülerinin kontrastını ayarlayın. Bindirme görüntülerinde FDA ve PI çift pozitif hücre olmadığını kontrol edin. FDA / PI / Hoechst üçlü boyama için, FDA pozitif katmanını PI pozitif katman üzerine tekrar sürükleyerek, FDA pozitif katmanın opaklığını ayarlayarak ve görüntüleri daha önce olduğu gibi birleştirerek hücrelerin görüntülerini kaplayın.

Ardından, Hoechst pozitif katmanını birleştirilmiş katmana sürükleyin. Katmanlar panelinin Opaklık alanına %50 girerek Hoechst pozitif katmanının opaklığını ayarlayın ve Katman menüsünü açıp Görüneni Birleştir düğmesine tıklayarak iki katmanı birleştirin. Floresan modunda çekilen görüntüleri faz kontrast modunda çekilenlerle karşılaştırarak büyük, düzensiz glial hücreleri serebellar granüler nöronlardan görsel olarak ayırt edin.

Aşağıdaki görüntüler, CGN kültüründe hem küçük nöronların hem de büyük, düzensiz glial hücrelerin bulunduğunu göstermektedir. Bu görüntü, in vitro olarak sekiz günde bir CGN kültürünün GAP-43 amino boyamasını göstermektedir. Mavi oklar nöronları gösterir.

Burada, glial hücrelerin GFAP amino boyaması gösterilmiştir. Beyaz ok bir glial hücreyi gösterir. Bu faz kontrast görüntüsü, hücrelerin morfolojisini gösterir.

Glial hücreleri nöronlardan ayırt edebilen FDA/PI kanca boyama, CGN kültüründe nöronal canlılığın doğru değerlendirilmesi için avantajlıdır. Bu, normal büyüme ortamında yetiştirilen üçlü lekeli hücrelerin birleştirilmiş bir görüntüsüdür. Ok, tipik bir glial hücreyi gösterir.

Burada, benzer bir kültür, düşük potasyum içeren bir ortam ile muamele edilmiştir ve ok yine tipik bir glial hücreyi gösterir. Ayrıca, kırmızı propidyum iyodür boyamanın görünümüne dikkat edin. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.

Benzer bir strateji, nöronal canlılığı doğru bir şekilde analiz etmek için birincil kortikal kültürler ve birincil hipokampal kültürler gibi diğer karışık hücre kültürlerine de uygulanabilir.