Sözde Hemangioblastoma tahlil çimlenme küresel kullanarak neovaskülarizasyon Vitro performansını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam

Bu deneyin genel amacı, in vitro olarak küresel filizlenme testi kullanılarak varsayılan hemanjiyoblastom neovaskülarizasyonunun performansını değerlendirmektir. Yöntem, tümör anjiyogenezi gibi anjiyojenik alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, klasik tümör anjiyogenezinin hemanjiyoblastomda nerede bulunduğunu ve hemanjiyoblastomda nerede büyüdüğünü in vitro olarak değerlendirmek için kapsamlı bir prosedürün ürünü olmasıdır.

Bu tekniğin anlamı, hemanjiyoblastumor ve vaskülatürasyon tedavisine kadar uzanır, çünkü sonuç hemanjiyoblastumor neovaskülarizasyonunun karmaşıklığını vurgular ve bu, bu yaygın anjiyogenez formunun sadece tamamlayıcı bir mekanizma olduğunu düşündürmektedir. Dolayısıyla bu yöntem, hemanjiyoblastumor neovaskülarizasyon çalışmasına ışık tutabilir. Cam tümörde tümör vaskülojenik taklidi gibi bazı katı tümörlerde tümörlere, anjiyogenez ve vaskülogenez ile ilgili uygulamalara da uygulanabilir.

Bu manipüle edilmiş endotel hücre sferoid basamağının oluşturulmasının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin gerçek gösterimi kritiktir. Çünkü uygun durum önemlidir. İlk olarak, HUVEC endotel hücrelerini, yüzde on fetal sığır serumu, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş DMEM kültür ortamında kültürleyin.

Daha sonra, kültürü inkübatörde yüzde beş karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun. Daha sonra, shRNA fragmanını sentezlemek için, plazmidi ApaI ve EcoRI kısıtlama enzimleri ile sindirin. Daha sonra sindirilmiş plazmide hem ileri hem de geri oligoları, 10x NEB tamponunu ve çift damıtılmış suyu 50 mikrolitrelik bir son hacme ekleyin.

Tüm reaktifleri ekledikten sonra, karışımı dört dakika boyunca 98 santigrat derecede ısıtın. Ardından, birkaç saat içinde yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutun. Tavlanmış oligoları ve plazmidi bağlamak için T4 ligaz kullanın.

Tüpü gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 25 mikrolitre DH5alpha yetkin hücresine beş mikrolitre ligasyon karışımı ekleyin. 500 mikrolitre DMEM ortamında, diğer ambalaj plazmitleri ile birlikte lentiviral vektörü veya karıştırılmış vektörü ekleyin.

Ardından, lentiviral karışımı 37 santigrat derecede 25 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, karıştırılmış veya lentiviral karışık çözeltiye 7 mililitre DMEM ortamı ekleyin. 293FT hücrelerini, 10 santimetrelik bir kültür kabında fetal sığır serumu olmadan DMEM ortamında kültürleyin.

Kültür kabındaki 293FT hücrelerine bir mililitre lentiviral veya karıştırılmış çözelti ekleyin. Altı saat sonra, eski ortamı kültür kabından aspire edin. Ardından, eski ortamı yüzde 10 fetal sığır serumu içeren taze DMEM ortamı ile değiştirin.

48 saat sonra ortamı toplayın. HUVEC endotel hücrelerini lentiviral ortama aktarın ve 72 saat boyunca koruyun. Daha sonra, HUVEC hücre kültürü ortamına mililitre başına iki mikrogram puromisin ekleyin.

Son olarak, kültürü 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, HUVEC hücrelerini tripsinize etmek için bir mililitre tripsin EDTA ekleyin. Daha sonra, tripsinli hücre süspansiyonunu DMEM ortamında yüzde 10 fetal sığır serumu ile yeniden süspanse edin.

Hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. Saydıktan sonra, hücreleri 3D yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Tohumlamadan sonra, hücreleri 72 saat boyunca sürekli olarak yüzde beş karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

36 saat sonra, kültür ortamının yarısını taze ortamla değiştirin. İlk olarak, jel çözeltisini dört santigrat derecede çözün ve daha sonra indirgenmiş serum ortamı ile bir ila beş oranında seyreltin. Bir mikropipet kullanarak sferoidleri DMEM ortamından emdirin.

Daha sonra, sferoidleri beş mililitre azaltılmış serum ortamı ile yıkayın. Askıya alınmış sferoidleri ve seyreltilmiş jeli dikkatlice aktarın. 15 oyuklu bir plakaya, sferoidlerin ve seyreltilmiş jelin karışık sıvısının 300 mikrolitresini gömün.

Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra, tek bir kuyucuğa 400 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için kuyu çevresini steril su ile doldurun.

Ardından, hücreleri bir saat boyunca 37 santigrat derece, yüzde beş karbondioksit ve yüzde 100 nemde kültürleyin. İnkübasyondan sonra, eski ortamı aspire edin ve kuyucuğa yüzde bir endotel hücre büyüme takviyesi ile 600 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ekleyin ve bir gün inkübe edin. Ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın.

Burada, hücrelerin sferoid filizlenmesi, VHL gen susturmasının endotel hücrelerinin anjiyojenik potansiyeli üzerindeki etkisini incelemek için ters çevrilmiş ışık mikroskobu kullanılarak yakalanır. Hem kontrol hem de VHL susturulmuş endotel hücrelerinde lentiviral tedaviden 12 saat sonra bir sferoidin filizlendiği görülmektedir. Daha sonra, VHL geni susturulmuş sferoidler tarafından üretilen filizlerin uzunluğunu ölçmek için istatistiksel analiz yapılır.

Ortalama filiz uzunluğu, VHL susturuculu gruplarda yaklaşık 125 mikrometre gibi görünürken, kontrol grubunda sadece yaklaşık 65 mikrometredir. VHL susturuculu grubun ortalama kümülatif filiz uzunluğu yaklaşık 1250 mikrometre iken, kontrol grubunun uzunluğu 680 mikrometredir. Bu sonuçlar, VHL susturuculu gruplarda iki kat filiz uzunluğu artışına işaret etmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa 48 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben ek sorulara cevap vermek için kılcal damar oluşumu testi gibi bir yöntem ve yöntem yapılabilir. Vasküler endotel hücrelerinin anjiyojenik yeteneğini keşfetmek gibi.

Bu gelişmeden sonra bu teknik, anjiyogenez alanındaki araştırmacıların tümör iç vaskülorizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, patlayan test için kullanılan manipüle edilmiş endotel hücrelerinde hangi genlerin bir işlevi kaybettiğini iyi anlamış olmalısınız.