Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Yani bu yöntem, belirli bir ilacın yaşayan bir organizmada nasıl işlediğine dair bir ilaç bulma sürecindeki anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, büyük örnek boyutlarının hızlı ve verimli bir şekilde taranmasını sağlamasıdır. Bu teknik, uyuşturucu adaylarının etkilerinin son derece niceliksel bir değerlendirmesini sağlayarak ilaç keşfinde zaten önemli bir etkiye sahiptir.

Bu yöntem, yanlış katlama hastalıklarının başlangıcı ve ilerlemesi içine yeni mekanistik anlayışlar sağlar. Ayrıca bu yöntem yaşlanma ve genetik taramalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Uyuşturucu keşfi alanına yeni fiziksel yöntemler getirme fırsatı bizi çok heyecanlandırıyor.

Tarama adımları bu novo otomatik teknik ile yüksek aşinalık gerektirdiğinden bu yöntemin bu demonstartions önemlidir. Prosedürü gösteren Sam Casford, laboratuarımızdan bir arama asistanı olacak. İşleme başlamadan önce, her ilaç bileşiğinin uygun konsantrasyonda 2,2 milileter ekleyin ve solucan suşu başına altı adet 5-fluorodeoxyuridine veya FUDR plakası, bileşiğin tüm yüzeyine dikkatlice yayarak ve tabakları steril koşullarda kurutarak.

Plakalar kururken, solucanları beş zengin nematod büyüme faktörü plakasından yıkamak için 15 mililitre M9 tamponu kullanın ve kurtarılan solucanları santrifüj için konik bir tüpe aktarın. L4 larva aşamasında solucan sayısının ölçülmesi için taze M9 tampon üç mililitre nematodlar yeniden askıya, ve tohum 700 L4 larvaher solucan suşu başına altı kuru FUDR plakaları üzerine, bileşik başına. Tüm nematodlar tohumlu olduğunda, 24 saat boyunca 24 santigrat derece sıcaklık yükselterek parlysis indüklenen suşları içeren plakalar yerleştirin.

Ertesi gün, paralel solucan izcisahne ışıkları açın ve yüzde 70 etanol ile izci cam sahne temizleyin. Görünür kalıntı kalmazsa, lens kapağını çıkarın ve görüntüleme lensini temizlemek için bir hava sökücü kullanın. Kameranın doğru şekilde takılı ve takılı olduğunu doğrulayın ve görüntü yakalama yazılımıyla kaydetmeye başlayın.

Kamera ayarlarını uygun mono-16 kayıt parametreleriyle saniyede 20 kare kaydacak şekilde ayarlayın. Sahnenin doğru yüksekliğe ayarlandığından emin olmak için boş, dokuz santimetrelik bir petri kabı kullanın ve gerekirse sahneyi ayarlayın. Steril koşullar altında, bir motilite tarama plakasına üç mililitre M9 çözeltisi ekleyin ve aynı deney grubundan aynı deney grubundan iki nematod yüklü FUDR plakasının yüzey alanının üçte birini yıkamak için iki mililitre M9 çözeltisi kullanın.

Daha sonra, tarama plakasını izci aşamasına yerleştirin. Kamera odaklanmak için tek bir solucan kullanın ve hayvanları kaydetmeye başlayın. Kayıt tamamlandığında, hareketlilik plakasını atın ve FUDR plakalarını kuvöze geri vermeden önce bir kez kullanılmış olarak işaretleyin.

Video verilerini analiz etmek için paralel solucan izci veri analizi yazılımı grafik kullanıcı arabirimini açın ve ilgi çekici videoyu yüklemek için tarama işlevini kullanın. Bir çıktı hedef klasörü seçin ve 30 saniyelik bir çözümleme için 600 ila 1200 çerçeveayarlı olduğunu onaylayın. Tam çözünürlükte dokuz santimetrelik petri kabının görüntülenmesi için 0,029 pikselden milimetreye dönüştürme faktörü ekleyin ve ölü izleme algorithhm'ini seçin.

Konum belirleme parametreleri sekmesialtında, Z-use görüntülerini 100'e, Z dolguyu 3'e, standart pikselleri 54'e, eşiği 9'a, 1'e açılımı ve 2'ye kapatmaya ayarlayın. Filtreleme parametrelerini en az 20, en fazla 180 boyutuna ve 0,94 gibi bir solucana ayarlayın. Şekillendirme yörüngeparametrelerini en fazla 10 mesafe hareketine, en az 150 uzunluğa ve 10 belleğe ayarlayın.

Bükümleri ve hız parametrelerini 1,8 büküm eşiğine, en az 0 bükümlere ve hızı tahmin etmek için 150'ye ayarla. Ölü solucan istatistiklerini dakikada 5'lik bir maksimum minmim vuruşu ve maksimum 1 hıza ayarlayın. Çıktı klasörünü seçin ve çıktı çerçevesi sayısını 50'ye, yazı tipi boyutunu da 10'a seçin.

Parametreleri sınamak için örnek işlevi kullanın ve solucanların sekiz eşik adımıboyunca görünür olup olmadığını kontrol etmek için örnek görüntüleri çıktı. Ardından Start Job" işlevini başlatın ve test sonuç dosyalarını çözümlemek için tüm veri kümesinin tek tek sonuçlarını birleştirerek sonuçları TSV işlevine dışa aktarma yoluyla kaydedin. Bu yöntem, Frontotemporal Demans, Parkinson Hastalığı, Alzheimer Hastalığı ve Amiyotrofik Lateral Skleroz gibi nörodejeneratif hastalığın çeşitli solucan modellerinin büyük nüfus çalışmaları için nematod fenotiplerin karakterizasyonu sağlar.

Yanı sıra potansiyel terapötik moleküllerin etkilerinin karakterizasyonu, Parkinson ve Alzheimer Hastalığı solucan modelleri kullanarak. Bu ölçümlerin yüksek doğruluğu, geleneksel yöntemlere göre analiz edilebilen solucan sayısının artırılması ile elde edilir. Bu yordamı gerçekleştirirken, solucanların hareketliliğe eklenmesi ile izlemenin başlangıcı arasındaki süreyi en aza indirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, diğer yöntemler sonuçları tamamlamak ve protein toplama ile bağlantı için yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif ve yanlış katlama hastalıkları alanında araştırmacıların doğru keşif uygulamalarını keşfetmelerinin önünü açtı. FUDR ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve nitril eldiven takmak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.